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SARS冠状病毒抗体工程的研究、应用及进展
SARS冠状病毒(SARS-CoV)抗体工程的研究建立了SARS的快速检测方法,深入探索了病毒的传播途径及致病机理.人源化抗体的研制及动物试验的成功使单克隆抗体用于SARS-CoV的预防及治疗成为可能.
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呼肠病毒与严重急性呼吸综合征(SARS)病因学关系的探讨
2002-2003年突发的急性呼吸综合征(Severeacute respiratory syndrome,SARS)在中国大陆及其他国家和地区肆虐已经过去5年了.这起SARS疫情给人民健康带来了巨大威胁,使经济蒙受了严重损失,甚至导致了社会危机,教训可谓刻骨铭心.自世界卫生组织(WHO)于2003年4月16日宣布新型冠状病毒(Coronavirus,CoV)为引起SARS的病原体以来,科技工作者围绕该病毒做了大量工作,取得了重要的研究成果.
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应用RT-PCR方法检测人与动物的SARS冠状病毒
目的选择合适的RT-PCR检测方法应用于人和与人类生活密切相关的多种野生、圈养和市售动物携带SARS样冠状病毒的检测,探索SARS样病毒的来源.方法收集深圳SARS临床诊断病例、疑似及观察病例咽漱液标本共350份,分别用TaqMan和分子信标荧光RT-PCR法进行检测;收集386只动物的咽肛拭子样本及病毒分离培养物共442份样品进行了TaqMan荧光RT-PCR和普通RT-PCR法的检测.结果41例临床确诊病例荧光RT-PCR法检出10份阳性,阳性率24.39%,TaqMan法和分子信标法检出结果8份符合(符合率88.89%).对动物样本病毒分离培养物细胞病变样本18份进行检测,检出16份阳性,其中14份(87.5%)样本来源为果子狸.深圳东门市场及广东周边地区市场及养殖场动物样本检测结果:果子狸、貉及獾类动物总的阳性率为39.02%,而其它动物的阳性率为0,两者间差异具有显著性(P＜0.01);对东门市场109只主要野生动物咽肛拭子样本进行PCR检测,阳性率44.04%,而145只野外的野生动物阳性率仅为0(P＜0.01).结论TaqMan法和分子信标法均可用于SARS检测;动物中尤其是果子狸等野生动物可能携带有SARS冠状病毒.
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广州市某野生动物市场从业人员携带SARS冠状病毒抗体状况调查
目的 了解广州市新源野生动物市场从业人员严重急性呼吸综合征(SARS)抗体产生情况及其暴露果子狸的关系.方法 对野生动物市场从业人员中的志愿者进行SARS病毒血清抗体监测,对监测结果结合果子狸在市场的存在情况进行分析.结果 2003年5和12月、2004年1和7月、2005年6月,共5次分别对328、238、135、139和53名市场从业人员开展调查,SARS病毒IgG抗体检出率依次为25.61%、13.03%、12.59%、5.04%和9.43%,没有检测到SARS病毒IgM抗体.在接受2次以上随访调查的129人中,97人的血清抗体一直为阴性,18人一直为阳性;有13人从阳性转为阴性,有1人从阴性转为阳性.在清除果子狸后进入市场的工作人员,SARS病毒IgG抗体检测全部阴性.结论 广州市新源野生动物市场从业人员SARS病毒抗体检出率和市场内果子狸的存在情况密切相关.
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广州市动物市场从业人员SARS冠状病毒感染的危险因素分析
目的探讨动物市场从业人员SARS冠状病毒(CoV)感染的可疑危险因素.方法在对广州市3家大型野生动物市场从业人员进行SARS-CoV抗体检测的基础上,采用自行设计调查表进行SARS-CoV感染的危险因素调查,采用单因素和多因素logistic回归分析方法分析资料.结果经单因素logistic回归分析发现,经营其他畜类(猫、狗)、野生畜类(狸、山猪、黄猄)、其他野生类(蝙蝠、巨蜥、穿山甲等)、水产类(甲鱼、龟、鳗鱼、蛙等)动物、采购销售等是SARS-CoV感染的相关因素;经多因素logistic回归分析发现有意义的因素是经营野生畜类(狸、山猪、黄猄)(P＜0.001)和经营家禽(鸡、鸭、鹅、鸽子)(P＝0.04),OR值分别为12.28、0.41.结论接触狸类动物是该从业人员感染SARS-CoV的主要危险因素.
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SARS恢复期患者血液与排泄物中SARS-CoV RNA的检测
目的应用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测严重急性呼吸综合征(SARS)恢复期患者血液与排泄物中的病毒RNA.方法对连续3次收集的23例确诊SARS恢复期(病程≥21天)患者的血、尿、痰、粪便标本进行核酸提取,设计特异性内外引物,使用巢式RT-PCR的方法进行病毒RNA检测.结果通过巢式RT-PCR,共检测到6份阳性标本,其中粪便标本中检测到4份,检出率为5.8%;痰标本中检测到2份,检出率为2.9%.在尿液和血液标本中未检测到病毒RNA.结论个别SARS恢复期患者排泄物中有SARS病毒RNA存在,因此对恢复期患者的排泄物应慎重处理,对其引起SARS的再次传播的危险性需要进一步评估.
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SARS患者某定点收治医院空气样本中SARS-CoV及其RNA的检测
目的了解SARS某定点收治医院空气中的SARS病毒污染情况及SARS病毒在空气中的分布和传播特性.方法采用FA-2型空气微生物采样器在病房区及病房阳台连续采样.将采集到的空气样本洗脱后分别采用细胞分离和逆转录-聚合酶链反应分析,并对细胞分离阳性者作进一步的系列分析鉴定.结果 SARS患者某定点收治医院病房区及阳台空气样本中均有部分PCR结果阳性,SARS阳性率病房区为29%,阳台为20%;其中一份样品中分离出活性病原体,并稳定传代;经免疫荧光染色鉴定阳性,RT-PCR扩增产物的测序结果显示该病原体与已知SARS-CoV的同源性在98%以上.结论 SARS急性期后期与恢复期早期的患者仍然从呼吸道排毒,病毒在距传染源周围1 m之内的空气中具有感染活性,在此范围之内存在气溶胶传播的潜在威胁.
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检测SARS患者血清中抗-SARS-CoV IgG的四种试剂盒比较
目的比较4种试剂盒检测SARS患者血清中抗-SARS-CoV IgG的灵敏度和特异度.方法用2种酶联免疫吸附试验(EIA)和2种间接免疫荧光法(IFA)试剂盒分别检测18例SARS患者的99份系列血清及123份阴性参比血清标本中抗-SARS-CoV IgG.结果在患者发病第1周,4种试剂盒均未检出抗-SARS-CoV IgG;自发病第2周,除EIA甲未能检出外,EIA乙和2种IFA 均从血清中检出抗-SARS-CoV IgG,其阳性率分别为57.1%(4/7)、57.1%(4/7)和42.9%(3/7).4种试剂盒早检出时间分别为发病后第16、12、13和9天.于发病后第3周该4种试剂盒的检出率分别为52.6%(10/19)、94.7%(18/19)、78.9%(15/19)和84.2%(16/19).但自发病第4周后,该4种试剂盒的检出率相同.检测123份阴性参比血清表明,除EIA乙的特异度为94.9%外,其余3种试剂盒的特异度均为100%.结论 2种IFA的灵敏度和特异度均较2种EIA高;2种国产EIA试剂盒质量尚需进一步提高.
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SARS冠状病毒结构蛋白在血清学诊断中潜在应用价值的比较
为了确定特异的SARS抗体检测抗原,比较了SARS冠状病毒(SARS-CoV)主要结构蛋白与SARS患者血清的反应性.从SARS死亡患者的肺组织提取的总RNA为模板,用RT-PCR技术分别扩增S、N、M和E 4种结构蛋白基因,对3种S截短突变体和N、M、E的重组蛋白在大肠杆菌中进行表达.以表达的蛋白为抗原,应用Westernblot跟踪检测11例SARS患者血清54份.结果显示:SARS-CoV的重组N蛋白和S蛋白有很强的抗原性,S蛋白的3个区段的抗原性强弱存在差异,S3抗原性强于S1和S2;在患病第1周、2周、3周及3周以上,N蛋白和S3蛋白抗体检出率分别为40%、65.2%、100%、100%和40%、61%、76.2%、100%;提示SARS-CoV重组N蛋白和S3蛋白在SARS的血清学诊断中有一定的应用价值.
关键词： SARS冠状病毒 结构蛋白 Western blot 血清学诊断 -
中国内陆发现HCoV-HKU1感染及N和S蛋白基因序列及进化分析
了解冠状病毒HKU1在我国大陆地区的感染情况及N基因和S基因的编码特征.采用RT-PCR的方法对2005年10月～2006年1月收集的260例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物(NPA)进行了冠状病毒HKU1基因检测.将PCR阳性产物测序,并将所测序列在GenBank中进行比较分析.260份样本中共检测到2份冠状病毒HKU1阳性,阳性率为0.77%(2/260),且该2例冠状病毒HKU1阳性患者临床均表现为肺炎症状.扩增其中一株病毒N和S全基因,并进行测序,与GenBank中的冠状病毒HKU1参考株及冠状病毒科其它成员进行序列同源性和进化树分析,并对N和S蛋白的结构与功能进行了初步的预测分析.由此表明我国大陆地区存在冠状病毒HKU1感染,且可能与儿童下呼吸道感染存在相关性.
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SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白不同区域的原核表达
利用大肠杆菌表达系统对SARS冠状病毒的核衣壳(N)蛋白全长及N末端或/和C末端缺失突变体进行了表达,共表达了39个重组蛋白,表达量在15%～30%之间.分别利用电洗脱或金属鳌合介质纯化重组蛋白,用蛋白印迹实验检测纯化蛋白对SARS病人恢复期血清的反应性,结果发现全长N蛋白活性好,其余的末端缺失蛋白均无法达到同一活性水平.由此说明N蛋白的完整性对于其优势表位的充分暴露是必要的.
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重组痘病毒表达SARS冠状病毒纤突蛋白及其免疫原性分析
对牛痘病毒弱毒株表达的SARS冠状病毒纤突蛋白(Spike protein,S)的免疫原性进行分析与比较.以减毒痘病毒(WR株)为载体重组了SARS冠状病毒全长S基因(rWR-SARS-S).SDS-PAGE和Western blot试验表明,迁移率约为190kD的重组SARS S蛋白可在HeLa细胞中表达,而且可以被鸡抗SARS全病毒高免血清识别,具有特异免疫反应原性.进一步研究表明,rWR-SARS-S感染的细胞在IFA试验中可与鸡抗SARS的高免血清发生特异反应,具有良好的敏感性和特异性.以104PFU的rWR-SARS-S免疫BALB/c小鼠产生的抗体在间接ELISA试验中可以被S蛋白识别,产生特异抗原抗体反应.利用痘病毒表达的SARS冠状病毒S蛋白具有良好的抗原性和生物学活性,可替代SARS冠状病毒全病毒,为研究安全、敏感和特异的重组诊断抗原奠定了重要基础.
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血中检测SARS冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用
为明确严重急性呼吸综合症(SARS)冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用,通过微量中和试验及酶联免疫方法、间接免疫荧光法检测疑似病人恢复期血清(大于28天)中SARS-IgG抗体,确诊SARS患者.同时收集发病不同时期SARS及普通发热病人血清,利用酶联免疫方法检测SARS-CoV N蛋白,并与荧光定量PCR早期诊断方法相比较.共检测:广州地区2003年12月～2004年1月新发4例确诊SARS患者不同时期的血液和咽漱液标本;恢复期血清SARS-CoV中和抗体阳性病人不同时期的血清46份;广州地区2003年1月～4月临床确诊SARS患者159例的血清和56例疑似患者血清;非SARS普通发热病人血清97份;正常人体检血清100份.结果:4例新发SARS患者的不同时期标本中,3例患者急性期血均检出N蛋白,优于常用的荧光定量PCR检测方法.46份SARS-CoV中和抗体阳性的血清标本,N蛋白检出率为100%.159例临床确诊病例中,发病早期5天以内SARS-CoVN蛋白的检出率为92.3%,随后呈现逐步下降的趋势,在发病第18天仍可检出.56例临床疑似患者发病早期也有23.2%检出率.而97例普通发热病人及100份正常人血清中均未能检测出SARS-CoV N蛋白.表明在血清中检测SARS冠状病毒N蛋白的方法敏感性和特异性都好,对SARS实验室早期诊断具有重要作用.
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SARS冠状病毒S蛋白噬菌体抗原库的构建及筛选
本研究旨在构建SARS冠状病毒S蛋白特异性噬菌体抗原库,并用于鉴定抗S蛋白单克隆抗体的抗原表位.首先采用PCR技术扩增出SARS冠状病毒S蛋白的全基因,以DNaseI将其随机酶切成50～500 bp不同大小的DNA片段.然后将DNA片段平末端化并连接到经过改造的噬菌体表达载体pComb3XSS,经电转化大肠杆菌XL1-Blue和辅助噬菌体感染获得S蛋白的特异性噬菌体抗原库.利用两个抗S蛋白单克隆中和抗体(S-M1和S-M2)对S蛋白抗原库进行富集和筛选.结果表明,我们成功构建库容量为5.7×106的S蛋白噬菌体抗原库.通过对S-M1和S-M2的有效富集和筛选,分别得到14个和15个阳性克隆,序列分析初步揭示了抗体的抗原表位.因此,S蛋白噬菌体抗原库的构建为鉴定S蛋白的抗原表位提供了重要的技术平台,对研发SARS疫苗和诊断试剂具有重要的科学意义和应用价值.
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严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒核蛋白的鉴定与分析
利用蛋白质组学技术,对纯化的严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒颗粒所含核蛋白进行初步分离与鉴定.质谱分析结果终表明,SARS冠状病毒核蛋白的分子量位于47kD与52kD之间,所获得的SARS冠状病毒核蛋白的质谱分析数据覆盖了所预测病毒核蛋白氨基酸序列的87%,且符合率为100%.从而首次从蛋白质水平对SARS冠状病毒核蛋白的氨基酸序列进行了证实.
关键词： 严重急性呼吸综合征(SARS) SARS冠状病毒 蛋白质组学 -
严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒抗体的检测及其临床意义
自2002年底出现的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)严重影响全球经济,危害着人民的健康.2003年4月16日,WHO确定一种新型冠状病毒为SARS的病因[1-3].随着对SARS病因的确认以及全球特别是中国的SARS疫情发展,困扰广大医学工作者的突出问题是SARS的防治,包括预防性疫苗的研制及SARS的病原学早期诊断.WHO相应地公布了SARS的实验室诊断标准[4].为明了SARS冠状病毒特异性抗体产生的规律及其临床意义,以进一步了解SARS病毒感染免疫的特点,采用中国军事医学科学院研制的SARS病毒IgG/IgM抗体检测试剂,对深圳东湖医院收治的SARS患者的系列血清进行了抗体检测,现将结果简报如下.
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血管紧张素转换酶2在大鼠胰腺组织中的表达
目的 检测SARS冠状病毒(SARS-CoV)S蛋白的功能性受体血管紧张素转换酶2 (ACE2)在大鼠内脏尤其在胰腺内、外分泌腺的表达.方法 麻醉Wistar大鼠后取胰、肺、肝、肾、心、肠、膀胱和脾8种组织,采用免疫组化和RT-PCR方法检测各组织ACE2的表达.结果 ACE2在组织中均有不同程度的表达,其中胰腺外分泌腺ACE2阳性细胞的吸光度值较内分泌腺显著增加 (P＜0.01).结论 ACE2在大鼠胰腺内、外分泌腺的表达可介导SARS-CoV侵入并损害胰腺,使胰岛素耗竭,引起血糖水平升高;同时ACE2在内脏组织的普遍表达为SARS-CoV的入侵提供了可能.
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SARS冠状病毒核壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的制备严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒(CoV)核壳(N)蛋白单克隆抗体,为寻求SARS早期诊断的方法及深入研究SARS疾病提供有力的工具.方法以重组SARS-CoV N蛋白免疫小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法制备单克隆抗体.通过间接酶联免疫分析、间接免疫荧光、免疫双向扩散等方法鉴定抗体的特异性、亲和力、类型及亚类、配对效果等.结果共获得15个阳性克隆,其中10个与天然SARS-CoV呈阳性反应.10株单抗的相对亲和常数在108～109mo1/L-1之间;10株中有1株为IgG2b、1株为IgG3,其余均为IgG1;10株单抗中有8株与12种肺炎相关的病原体无交叉反应,1株与流感病毒A、B,副流感病毒有交叉反应,l株与流感病毒A、B有交叉反应;10株单抗中的5株可形成5种配对,其中两种配对用于检测重组SARS病毒N蛋白,灵敏度可达1 μg/L.结论获得了特异性针对SARS冠状病毒N蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测SARS-CoV N蛋白的酶联双抗体夹心法,为SARS的早期诊断、蛋白质组学的研究奠定了基础.
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RT-PCR检测病媒生物SARS冠状病毒结果初报
目的调查广东重点地区鼠类和蜚蠊是否携带SARS冠状病毒或者是否SARS冠状病毒的宿主,为寻找SARS冠状病毒的来源及控制SARS流行提供依据.方法巢式RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR技术.结果利用SARS冠状病毒特异性引物对广州、中山、江门及恩平等地的160份鼠肺样品及15份蜚蠊的体表擦拭子检测结果表明,荧光定量RT-PCR未检测到阳性,巢式RT-PCR显示来自广州市的1份蜚蠊体表擦拭子呈可疑阳性.结论巢式RT-PCR、荧光定量RT-PCR都适合于病媒生物SARS冠状病毒的初步筛选,目前未有明显证据显示鼠类及蜚蠊携带和传播SARS冠状病毒,仍需作进一步研究.
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广西野生动物SARS冠状病毒的感染状况及其意义
目的查明广西境内野生动物SARS冠状病毒感染状况.方法对广西境内15种117只野生动物及99只人工养殖的果子狸采用聚合酶链反应和血清学方法检测其病毒核酸.结果15种野生动物中鸟类及爬行类动物血清的SARS冠状病毒抗体阳性率分别为22.2％和20.0％,哺乳类动物SARS冠状病毒抗体阳性率为0,人工养殖的果子狸咽拭子及肛拭子标本未检出SARS冠状病毒核酸.结论野生动物中鸟类及爬行类动物SARS冠状病毒感染率较高,可能是SARS冠状病毒的自然宿主或储存宿主.
