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荧光定量RT-PCR检测柯萨奇病毒A组6和10型的方法建立及应用
目的 建立柯萨奇病毒A组6(Coxsackievirus A6,CVA6)和10型(CVA10)的SYBRGreen Ⅰ荧光定量RT-PCR方法并进行评价及初步应用.方法 根据GenBank上的CVA6和CVA10序列,分别设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法体系,并分别进行灵敏度,重复性和特异性检测,然后利用该方法对649份2014年天津市未明确分型的肠道病毒阳性标本进行检测.结果 成功建立CVA6和CVA10的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法及定量标准曲线,其检出限均为101 copies/μL,重复性实验的变异系数均小于2％.该方法特异性强,与柯萨奇病毒(A组2、4、5、16型)、肠道病毒EV71型、诺如病毒、轮状病毒、麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应.利用该方法检测649份未分型标本,发现136份为CVA6阳性和174份为CVA10阳性,分别占未分型阳性标本的20.96％和26.81％.结论 本研究建立的检测CVA6和CVA10荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性好、特异性强,应用于2014年天津市手足口病监测,发现C VA6和CVA10已成为优势型病原体.
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牡蛎中诺如病毒检测的前处理方法比较及应用
目的 对牡蛎中诺如病毒检测的三种前处理方法进行比较并探讨应用策略.方法 2014年8月-2015年3月采集160只市售牡蛎,每组5只,共32组样品,取其肠腺组织采用直接处理法(M1)、PEG 8000沉淀法(M2)和蛋白酶K消化-PEG 8000沉淀法(M3)三种方法进行前处理,提取核酸后荧光定量RT-PCR检测诺如病毒核酸.应用串并联法对三种前处理方法的样品阳性率进行分析,利用x2检验比较不同方法的阳性率差异,应用一致性检验比较不同方法的一致性,对荧光RT-PCR所得到的Ct值进行ANOVA检验.结果 M1、M2、M3三种前处理方法诺如病毒阳性率依次为15.63％(5/32)、34.38％ (11/32)和37.50％ (12/32);M1/M2/M3并联使用的阳性率高,为50.00％ (16/32);其次为M2/M3并联法,阳性率为46.88％ (15/32);M1+ M3串联或M1+ M2+ M3串联的阳性率低,均为9.38％ (3/32).M2/M3与M1/M2/M3的阳性率经x2检验比较,差异无统计学意义(P＞0.05),两种方法经一致性检验,kappa=0.931(P＜0.05),一致性较高.M1、M2、M3三种方法检测阳性样品的Ct值依次为33.44±0.66、33.70±1.88和33.42±2.44.经ANOVA检验,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 常规监测时推荐使用M2或M3,暴发疫情溯源时可考虑使用M2/M3并联法.
关键词： 牡蛎 诺如病毒 前处理 荧光定量RT-PCR -
2008-2011年湖北省宜昌市手足口病的流行特征分析
目的 了解湖北省宜昌市手足口病的流行特征,为手足口病的综合防治提供科学依据.方法 收集2008-2011年宜昌市包括各县(市、区)报告的手足口病疫情病例和聚集性病例的相关标本,采用荧光定量RT-PCR方法进行检测.结果 在473份标本中,男女性别比为1.26∶1,手足口病发病高峰在春末和夏初;疱疹液的阳性检出率高于咽拭子(x2=8.026,P＜0.01)和口漱液(x2=12.67,P＜0.01);共检测到肠道通用病毒阳性标本298份,总检出率为73％,其中肠道病毒71型(EV71)阳性标本191份,柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)阳性标本78份,其他肠道病毒为29份,EV71的检出率高于Cox A16 (x2=86.517,P＜0.01)和其他肠道病毒(x2=189.089,P＜0.01).结论 宜昌市手足口病的病原体主要是EV71 (64.1％)和Cox A16(26.2％),随不同年份优势毒株稍有差异,EV71是引起宜昌市2008-2011年手足口病病例的主要优势毒株类型.
关键词： 手足口病 病原学 肠道病毒 荧光定量RT-PCR -
北京市某幼儿园手足口病聚集疫情流行病学调查
目的 了解2014年北京市某幼儿园手足口病聚集疫情的流行病学特征,为完善手足口病防治措施提供科学依据.方法 应用描述性流行病学方法进行调查,并采集患儿及密切接触者的咽拭子进行荧光定量RT-PCR方法检测.结果 该幼儿园短时间内手足口病共发病12例,主要集中在4～5周岁儿童,罹患率为7.89％,流行期15 d.首发病例发病前接触过确诊的手足口病患儿,其余患儿发病前和潜伏期的首发病例有密切接触.12例患儿中发热5例,占41.7％,11例患儿均有口腔疱疹、手足出现红疹的临床表现.实验室检测出CoxA16病毒株样品7件,EV71病毒株样品1件,肠道未分型病毒株样品1件.结论 流行病学调查结合实验室检测结果可推测此起疫情是由CoxA16病毒株引起.该疫情提示疫情流调过程中,在建立整体疫情框架的同时应系统分析该疫情中的每一例个案,找寻个案之间的关联,从而为疫情的定性提供依据.在手足口病防控工作中,应着重加强手足口病的健康教育,提高家长对手足口病的认识程度.
关键词： 手足口病 聚集疫情 荧光定量RT-PCR -
2010～2012年北京市顺义区手足口病病原学检测结果分析
目的 通过对2010～2012年北京市顺义区手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HMFD)实验室检测结果分析,了解顺义区手足口病病原学特征,为手足口病防控工作提供科学依据.方法 对2010～2012年顺义区684例临床诊断为手足口病患者标本,应用实时荧光定量RT-PCR法检测标本中的肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)、非EV71和CVA16的其它肠道病毒(EV)特异性核酸.结果 684例HFMD患者标本中,肠道病毒阳性率为47.37％ (324/684).病原谱构成以CVA16型为主,占55.56％(180/324),其次为EV71占32.41％(105/324),其他肠道病毒占12.03％ (39/324)；4～7月为HFMD检出高峰期；0～5岁为高风险年龄组；性别比1.49∶1,男性阳性率略高于女性,但差异无统计学意义(x2 =0.163,P＞0.05)；散居病例阳性检出率较高.结论 2010 ～2012年顺义区HFMD病例病毒阳性检出率较高,CVA16是优势病毒型别；每年春夏季节,应加强对流动人口聚居区5岁以下儿童的手足口病防控工作.
关键词： 手足口病 荧光定量RT-PCR EV71 CVA16 -
荧光定量RT-PCR快速检测N_2亚型流感病毒的研究
目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立快速检测甲型流感病毒N_2亚型的方法.方法 根据N_2亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系后,采用十倍稀释法检验建立体系的灵敏度并建立相对定量标准曲线;采用N_1亚型毒株核酸进行方法特异性检验并对临床疑似流感样病例样本进行检测.结果 N_2亚型流感病毒的检测灵敏度为2.56 × 10~(-6),扩增效率为99.9%,标准曲线r=0.997,特异性为100%.临床ILl样本检测结果与HAl鉴定结果相符. 结论本研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确的检测M亚型流感病毒.
关键词： 流感病毒 N_2亚型 荧光定量RT-PCR -
双重荧光定量RT-PCR快速检测N1、N2亚型流感病毒的研究
目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立快速检测流感病毒N1、N2亚型的方法.方法 根据N1、N2亚型流感病毒NA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系后,采用十倍稀释体外转录RNA检验建立体系的灵敏度和重复性并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性.结果 N1、N2亚型流感病毒的检测灵敏度为10拷贝/μl,扩增效率分别为10221％和10178％,标准曲线相关系数大于99％,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增.结论 双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确的检测N1、N2亚型流感病毒.
关键词： 流感病毒 N1亚型 N2亚型 荧光定量RT-PCR -
荧光定量RT-PCR试剂和反应条件对检测灵敏度的影响
目的 明确试剂和反应条件对荧光定量RT-PCR检测灵敏度的影响,为提高检测灵敏度提供指导.方法 将3种荧光定量RT-PCR试剂(A、B、C)和3种推荐反应条件(a、b、c)组合成9种荧光定量RT-PCR方法,采用统一的引物和探针,检测已知滴度的甲型流感病毒.通过对病毒进行10倍梯度稀释,测定不同方法的灵敏度,分析试剂、反应条件以及两者间相互作用对灵敏度的影响.结果 采用试剂C的3种方法是检测灵敏度低的方法(3种条件下灵敏度高于103 PFU/ml),3种试剂都在与条件b组合时都达到灵敏度的高值(试剂A、B、C分别达到100、100、103 PFU/ml),表明反应条件b可在一定程度提高方法的灵敏度.灵敏度高的方法是试剂B和条件b组合.结论 试剂和反应条件都对检测灵敏度有重要影响,但试剂的影响比反应条件更大;试剂和反应条件之间的相互作用对灵敏度也有一定影响.
关键词： 荧光定量RT-PCR 灵敏度 试剂 反应条件 -
武威地区丙型肝炎基因分型情况分析
目的:了解武威地区丙型肝炎基因分型特征,为HCV感染者的个体化治疗提供科学依据.方法:实时荧光定量RT-PCR检测70例抗-HCV阳性血清标本,并对血清标本PCR扩增基因片段,测定核苷酸序列进行基因分型.结果:70例标本中HCV1b型38例,占54%;HCV2a型21例,占30%;HCV1b/2a混合型9例,占13%;HCV2b型2例,占3%.结论:武威地区HCV基因型主要为1b型,其次为2a型,同时存在1b/2a混合型和2b型,与相邻城市HCV基因型分布比较有一致和差异.
关键词： 丙型肝炎病毒 荧光定量RT-PCR 测序 基因分型 -
一起甲1型流感病毒的快速检测
2008年8月,浙江省金华市婺城区白龙桥镇红树林服装有限公司陆续出现疑似流感样病例,主要临床表现为:高热、头痛头晕、咽喉肿痛、乏力、肌肉酸痛等.
关键词： 流感病毒 荧光定量RT-PCR 检测 -
中东呼吸综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测技术的建立
建立中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的筛查与诊断应用的核酸检测方法.本研究建立了基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重的三种荧光定量RT-PCR检测技术方法,分别与前期建立的单重荧光定量RT-PCR(upE或N2)检测方法做了比较,并且采用MERS-CoV病毒毒株、上海提供的口岸发烧病人样本以及由首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品和全血的样品做了临床验证.结果显示:采用MERS-CoV病毒毒株作为模板,三种新建立的多重检测方法与单重荧光定量RT-PCR检测方法低检测限均能达到10 PFU/mL,且与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应,特异性良好.对临床样品的验证中,上海病人咽拭子样本均为阴性,而中国首例MERS输入病例的急性期咽拭子样品均为阳性,而全血样的检测结果显示N2靶标有较高检出率,明显优于基于upE单一靶标.本研究所建立的基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重荧光定量RT-PCR检测技术方法用于MERS-CoV感染的实验室诊断,具有较高灵敏度与特异性及适用性.
关键词： 中东呼吸系统综合征 冠状病毒 荧光定量RT-PCR 多重 检测 -
埃可病毒9型荧光RT-PCR快速检测方法的建立及应用
为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测埃可病毒9型病毒核酸,并初步应用于埃可病毒9型的临床标本检测.根据GenBank登录的埃可病毒9型毒株VP1基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针.对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,同时对疑似埃可病毒9型病例标本进行检测.该方法对埃可病毒9型的检出有高度特异性,与EV71、CA16、CA24v、CA6、CA10、埃可病毒30型等均无交叉反应,检测灵敏度均达0.1TCID50/mL,可从疑似埃可病例粪便标本中直接检测病毒核酸,检测仅需3～4h.本研究建立的埃可病毒9型TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于临床早期诊断.
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新城疫强毒株荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用
基于国内流行的新城疫病毒强毒株F蛋白裂解位点分子特征设计特异性引物及Taqman探针,建立了一种可检测新城疫强毒株的一步法实时荧光定量RT-PCR方法.通过体外转录法制备cRNA标准品作为阳性模板制作标准曲线以及临床样品的检测绘制出ROC曲线,对诊断指标进行系统评价.结果显示:该方法的标准曲线为Y=-3.390X+38.23,相关系数R2为0.9999;灵敏度试验显示,该方法的低检测限为2拷贝/μL,比常规RT-PCR高10倍;特异性试验显示该方法与常见禽病病毒无交叉反应;重复性试验的组内和组间的变异系数分别低于1％和1.5％.通过检测1 974份临床样品绘制ROC曲线显示,ROC曲线下面积为0.9861,当Youden Index为93.12时,cutoff值设为35,诊断的敏感性和特异性分别为94.82％、98.3％,与病毒分离方法的Kappa系数为0.919.本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好、诊断准确性极好,给实验室提供一种快速、实用的检测临床样品的方法.
关键词： 新城疫病毒(NDV) 强毒 荧光定量RT-PCR ROC曲线 -
肺癌患者血清中游离DNA含量与肿瘤标志物相关性分析
通过对52例肺癌患者、8例肺部良性疾病患者和10名健康人血清游离DNA含量与肿瘤标志物(TM)CA19-9、CA125、CYFRA21-1、CEA和NSE的联合检测,对两种检测结果作相关性分析.将表皮生长因子受体(EGFR)作为肿瘤基因标志物,运用荧光定量RT-PCR方法检测血清游离DNA含量.结果显示,10名健康人血清游离DNA含量平均为18.81ng/mL(范围:0.17～54.64ng/mL).若以19ng/mL作为血清游离DNA含量的阳性临界值,则87.5%的健康人低于此水平.8例肺部良性疾病患者游离DNA含量均值为76.86ng/mL(范围:5.33～189.7ng/mL),其中4例(50%)高于阳性临界值.52例肺癌患者游离DNA均值为107.6ng/mL(范围:6.39～1617ng/mL),37例(71.2%)的肺癌患者血清游离DNA含量高于正常值.血清游离DNA含量诊断肺癌的价值等同于肿瘤标志物五项指标联合检测.其灵敏度、特异性、准确性分别为:71.15%,50%,68.3%,提示血清游离DNA含量作为一项新颖肿瘤标志物具有潜在的临床诊断价值.
关键词： 游离DNA 表皮生长因子受体 肿瘤标志物 荧光定量RT-PCR 肺癌 -
荧光定量RT-PCR检测去下颌下腺大鼠睾丸annexin 5 mRNA和Bax mRNA的表达
目的 观察下颌下腺切除对大鼠睾丸膜联蛋白5(annexin 5)和Bax mRNA表达的影响.方法 切除大鼠下颌下腺.分别于术后14d、28d和42d处死大鼠,提取睾丸总RNA,反转录,设计特异性引物和Taqman探针.荧光定量RT-PCR检测annexin 5和Bax mRNA的表达.结果 荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,切除下颌下腺14d和28d后,实验组大鼠睾丸annexin 5 mRNA分别升高了38.5%和55.3%,但无显著性差异;实验组大鼠睾丸Bax mRNA分别升高了70.6%和80.5%,其升高具有显著性差异(P<0.05和P<0.01);切除下颌下腺42d时,实验组大鼠睾丸annexin 5和Bax mRNA分别升高5.6%和2.3%,几乎恢复到与对照组相同的水平.结论 下颌下腺切除后14d和28d可造成大鼠睾丸annexin 5和Bax mRNA的表达升高;切除后42d,annexin 5和Bax mRNA又恢复到正常水平.
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应用TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测肠道病毒的研究
目的 建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量RT-PCR检测肠道病毒的方法.方法 根据GenBank中肠道病毒5′UTR序列,应用生物软件在保守区设计与筛选特异引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对急性临床样本的检测,评价该方法的实际应用价值.结果 该方法对肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及柯萨奇病毒和埃可病毒等的检测有高度特异性,甲肝病毒、乙脑病毒、登革病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、诺如病毒等均呈阴性.该方法的检测下限达10-1TCID50/100 μl.12份急性结膜炎病例结膜拭子标本中7份肠道病毒核酸阳性,普通RT-PCR方法5份阳性.结论 TaqMan荧光定量RT-PCR方法快速、敏感、特异,适于肠道病毒的快速检测.
关键词： 肠道病毒 荧光定量RT-PCR TaqMan探针 快速检测 -
人禽流感死亡病例不同组织器官中H5N1病毒的检测分析
目的 了解H5N1病毒在人禽流感死亡病例组织器官中的分布和含量.方法 在BSL-3实验室,测定H5N1禽流感病毒分离株的TCID50,并采用荧光定量PCR制作标准曲线;将人禽流感死亡病例的尸解标本,包括心、肝、脾、肺、肾、脑等组织标本研磨处理后,进行荧光定量PCR检测,并根据标准曲线推算H5N1禽流感病毒的病毒载量.结果 心、肝、肾、脑组织标本中H5N1禽流感病毒检测为阴性,在肺、脾组织标本中检测到H5N1病毒,病毒载量分别为1063TCID50/ml和104.55TCID50/ml.结论 除呼吸系统外,在脾组织中也存在H5N1禽流感病毒.
关键词： 禽流感病毒 荧光定量RT-PCR 病毒载量 -
RT-PCR检测病媒生物SARS冠状病毒结果初报
目的调查广东重点地区鼠类和蜚蠊是否携带SARS冠状病毒或者是否SARS冠状病毒的宿主,为寻找SARS冠状病毒的来源及控制SARS流行提供依据.方法巢式RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR技术.结果利用SARS冠状病毒特异性引物对广州、中山、江门及恩平等地的160份鼠肺样品及15份蜚蠊的体表擦拭子检测结果表明,荧光定量RT-PCR未检测到阳性,巢式RT-PCR显示来自广州市的1份蜚蠊体表擦拭子呈可疑阳性.结论巢式RT-PCR、荧光定量RT-PCR都适合于病媒生物SARS冠状病毒的初步筛选,目前未有明显证据显示鼠类及蜚蠊携带和传播SARS冠状病毒,仍需作进一步研究.
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TaqMan荧光定量PCR检测1型登革热病毒及临床应用
目的 建立登革热1型病毒(DV1)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床诊断.方法 根据DV1 5'端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan探针.用4个血清型DV标准毒株为对照,收集40份DV1临床血清为检测标本.通过对DV1标准毒株RT-PCR后,采用体外转录方式获得RNA模板作为阳性对照,检测所建立TaqMan荧光定量PCR方法的特异性.取DV-IgM/IgG用ELISA检测患者血清,将TaqMan荧光定量PCR和DV-IgM/IgGELISA进行敏感性比较.结果 所建立方法的低检测限约为每反应10个基因拷贝.发病后不同时间采集的登革热患者血清标本检测结果为:发病1～3 d的患者RT-PCR阳性检出率高(81.25%);4～6d ELISA-IgM检出率高(85.00%);7 d后ELISA-IgG检出率高(75.00%).结论 在登革热的早期诊断中建立的RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为DV1的快速诊断方法.
关键词： 登革热1型病毒 荧光定量RT-PCR TaqMan探针 检测 -
TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒
目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸,并初步应用于登革热的临床标本检测.方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针.对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性.同时对疑似登革热病例血清标本进行检测.结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性,与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应,检测的灵敏度均达0.1 TCID50,可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断.
关键词： 荧光定量RT-PCR TaqMan探针 登革病毒
