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外周血胎儿游离DNA检测在无创性产前诊断中的价值
目的:探讨孕妇外周血胎儿游离DNA无创性产前检测在诊断胎儿非整倍体中的价值.方法:选择2017年1月-2017年12月本院行外周血胎儿游离DNA无创产前检测和羊水穿刺胎儿染色体核型分析的孕妇616例,以羊水穿刺结果为金标准,判断无创产前检测的准确率.结果:胎儿游离DNA无创性产前检出胎儿染色体非整倍体高风险11例,其中21-三体高风险5例,18-三体高风险3例,13-三体高风险1例;性染色体非整倍体高风险2例.羊水染色体核型分析共检出染色体非整倍体12例,其中21-三体5例,18-三体3例,13-三体1例,性染色体非整倍体3例,总体符合率91.7％.胎儿游离DNA无创性产前检测胎儿非整倍体的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度分别为91.7％、100.0％、100.0％、99.8％、99.8％、95.0％,ROC曲线下面积为0.958(95％CI:0.867～1.000).结论:无创性胎儿游离DNA检测可有效检出胎儿染色体非整倍体,是一种可靠的产前检测方法.但不排除存在假阳性及假阴性的可能.
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无创DNA检测在胎儿唐氏综合征产前筛查中的应用评价
目的：评价无创 DNA 检测在诊断唐氏综合征中的应用价值。方法：807例单胎孕妇分为高龄组、高危组、中危组，进行无创DNA检测，得出胎儿发生唐氏综合征的风险率。结果：高龄组121例孕妇中21三体阳性3例，高危组388例中4例，中危组298例中0例。7例阳性者经羊水穿刺及胎儿染色体核型分析证实为21三体阳性。625例阴性者出生后无唐氏综合征。结论：产前孕妇外周血中胎儿游离DNA检测对于唐氏综合征的产前诊断具有创伤小、安全、检出率及准确率高等优点。
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肺癌患者血清中游离DNA含量与肿瘤标志物相关性分析
通过对52例肺癌患者、8例肺部良性疾病患者和10名健康人血清游离DNA含量与肿瘤标志物(TM)CA19-9、CA125、CYFRA21-1、CEA和NSE的联合检测,对两种检测结果作相关性分析.将表皮生长因子受体(EGFR)作为肿瘤基因标志物,运用荧光定量RT-PCR方法检测血清游离DNA含量.结果显示,10名健康人血清游离DNA含量平均为18.81ng/mL(范围:0.17～54.64ng/mL).若以19ng/mL作为血清游离DNA含量的阳性临界值,则87.5%的健康人低于此水平.8例肺部良性疾病患者游离DNA含量均值为76.86ng/mL(范围:5.33～189.7ng/mL),其中4例(50%)高于阳性临界值.52例肺癌患者游离DNA均值为107.6ng/mL(范围:6.39～1617ng/mL),37例(71.2%)的肺癌患者血清游离DNA含量高于正常值.血清游离DNA含量诊断肺癌的价值等同于肿瘤标志物五项指标联合检测.其灵敏度、特异性、准确性分别为:71.15%,50%,68.3%,提示血清游离DNA含量作为一项新颖肿瘤标志物具有潜在的临床诊断价值.
关键词： 游离DNA 表皮生长因子受体 肿瘤标志物 荧光定量RT-PCR 肺癌 -
降钙素原、C反应蛋白、肿瘤坏死因子、游离DNA对多发伤患者发生多器官功能障碍综合征的预测价值
目的 探讨多发伤患者外周血PCT、CRP、TNF-α、游离DNA水平变化对多发伤患者发生MODS的预测价值.方法 回顾性分析2011年1月至2012年1月安徽医科大学第二附属医院急诊外科收治的多发伤患者且入院时发病时间在24 h以内、临床资料完整的患者54例,按1995年全国危重病急救医学学术会讨论通过的MODS诊断标准将病例分为MODS组与非MODS组,两组资料具有可比性,另选20例健康体检者为对照组.在第1、2、3、5天检测两组患者外周血血清PCT、CRP、TNF-α、游离DNA含量,并对结果进行对照分析.结果 同时段MODS组PCT、CRP、游离DNA含量明显高于非MODS组,差异具有统计学意义(P＜0.05),MODS组TNF-α含量较非MODS组差异无统计学意义(P＞0.05).PCT升高(PCT≥6 mg/L)、CRP升高(CRP≥130mg/L)、游离DNA升高(游离DNA≥10 0005/L)三者同时存在预测MODS准确,相对危险度RR为6.00,阳性预测值为100％.结论 PCT、CRP、游离DNA可作为预测多发伤患者MODS发生的预测指标,其中三者联合具有更高灵敏度及特异度.
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肿瘤诊断的新希望-循环游离DNA检测
游离DNA 是指游离于细胞之外的一类DNA，又称为循环核酸，1947年由 Mandel 和Métais发现。肿瘤患者外周血DNA水平高于正常人，且血液中游离DNA具有肿瘤细胞DNA的特征。随着肿瘤分子生物学的深入研究，血液中游离DNA定量分析已开始应用于肿瘤的早期诊断、个体化治疗和预后判断等。本文从游离DNA的来源、特点、提取、检测及临床应用方面对游离DNA及其在肿瘤中的重要作用做一综述。
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血液游离DNA检测肝癌的临床应用研究进展
肝癌是一种具有高发病率和高死亡率特点的恶性肿瘤,其常规检测手段如影像学检测、病理学检测等存在特异性和灵敏度不高、动态评估效果差的不足.血液游离DNA(cfDNA)是指存在于血液中、游离于细胞外的DNA片段,其中包含有来自相应机体组织的基因信息.肝癌患者的cfDNA中携带有肝癌疾病信息,提示cfDNA在肝癌的筛查、诊断、治疗及预后判断中有巨大的应用潜能.cfDNA的临床应用能弥补现有检测手段的不足,实现肝癌的无创、动态监测.本文对cfDNA在肝癌临床诊治的应用研究做一综述.
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小鼠脓毒症模型外周血和肺组织原位中性粒细胞胞外诱捕网的检测
目的：本研究旨在通过体内和体外实验建立在小鼠脓毒症模型中检测中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法，并初步探讨其与脓毒症肺组织损伤的相关性。方法采用盲肠结扎穿孔手术建立脓毒症小鼠模型，以假手术小鼠作为对照组。术后7 d，采用PicoGreen?染料定量检测小鼠血浆游离DNA，采用髓过氧化物酶（MPO）-DNA ELISA检测小鼠外周NETs复合物的形成，反映NETs生成量。对脓毒症小鼠的肺组织进行病理分析，反映肺组织损伤情况。采用免疫荧光染色法对肺组织原位的NETs形成情况进行鉴定。结果与对照组相比，脓毒症小鼠血浆中游离DNA含量（1650 ng/ml）显著升高（t =21.91，P =0.0021）。MPO-DNA复合物水平（4.85倍）也显著升高（t =15.40，P=0.0042）。脓毒症小鼠的肺组织可见明显损伤，免疫荧光检测显示脓毒症小鼠肺部的NETs形成增加。结论在小鼠中建立了稳定的NETs形成情况鉴定方法，且肺部NETs形成增加是脓毒症模型小鼠肺组织损伤的原因之一。
关键词： 脓毒症 中性粒细胞胞外诱捕网 游离DNA 肺损伤 -
建立体外诱导和检测中性粒细胞胞外诱捕网的方法
目的：建立体外诱导和检测中性粒细胞胞外诱捕网的方法，旨在研究中性粒细胞胞外诱捕网（NET）产生和调节的机制。方法分离正常人外周血中性粒细胞，通过内毒素（LPS）和白细胞介素-8（IL-8）体外诱导NET产生。采用免疫荧光染色和激光共聚焦显微成像定性评价NET生成；采用PicoGreen?染料定量检测细胞上清游离DNA，反映NET生成量。结果 LPS体外刺激中性粒细胞3 h后，与对照组相比，产生大量胞外网状结构（NET），该结构包含DNA、组蛋白和髓过氧化物酶（MPO）成分；同时细胞上清中游离DNA（NET）含量显著升高（P＜0.01）。采用IL-8体外刺激中性粒细胞3 h，与上述结果相似（P＜0.05）。结论建立了体外诱导和定性、定量检测NET的方法，二者结合能更好地评价NET的产生。
关键词： 中性粒细胞胞外诱捕网 免疫荧光染色 游离DNA -
无创产前基因检测技术在胎儿染色体非整倍体筛查中的应用研究
目的 探讨高通量测序平台的无创基因检测技术应用于产前诊断的可行性.方法 选择2012年4月到2013年5月在广东省妇幼保健院产前诊断中心就诊,孕龄12～32周的3711例单胎妊娠高危孕妇,记录临床指征、年龄、孕周等数据.采用高通量测序平台的无创产前基因检测技术对其外周血游离胎儿DNA进行分析.检测结果为高危的孕妇行羊膜腔穿刺或脐血穿刺术进行胎儿染色体核型分析.结果 3711例孕妇中游离胎儿DNA高通量基因测序技术检测出74例染色体高风险胎儿,羊水／脐血核型分析证实其中59例为染色体异常,分别为41例21-三体和8例18-三体,4例13-三体,5例性染色异常,1例其他常染色异常,1例21-三体和7例其他染色体异常证实为假阳性.结论 利用高通量测序平台的无创产前基因检测技术可快速、准确地检测出胎儿13、18、21染色体非整倍体异常,其敏感性、特异性与染色体核型分析技术具有较高的一致性.但是对于其他染色体异常准确性还有待技术完善来进一步提高,对于染色体微缺失、微重复的检测也日益受到众多专家学者的关注,这也是我们以后研究的方向之一.
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T790M与晚期NSCLC患者EGFR-TKI继发耐药及预后的相关性
目的 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI),该类药物对于有EGFR突变的非小细胞肺癌患者具有非常好的治疗效果.然而,约50％的患者经过EGFR-TKI治疗后会出现耐药突变,即T790M突变.故本研究主要探讨晚期肺腺癌患者外周血EGFR基因外显子20 T790M基因突变与EGFR-TKI继发耐药及预后之间的关系.方法 收集2013-12-08-2014-12-30石河子大学医学院第一附属医院对EGFR-TKI耐药的晚期肺腺癌患者49例.按QIAamp Blood Mini Kit试剂盒提取血清游离DNA后,采用探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)法对外周血游离DNA中EGFR外显子20T790M突变进行检测,并分析其与临床特征、疗效及预后的关系.结果 在49例接受EGFR-TKI药物治疗的晚期NSCLC继发耐药患者中,T790M突变率为30.6％(15/49),T790M阳性突变与晚期NSCLC患者年龄、性别、是否吸烟、临床分期、ECOG评分、初EGFR突变类型及EGFR-TKI药物种类均无关,但与EGFR-TKI耐药后进展类型有关,差异有统计学意义,x2=6.759,P=0.009.T790M阳性突变患者无进展生存期(progression-free survival,PFS)为9.6个月,总生存时间(overall survival,OS)为17.6个月,均较T790M阴性突变患者的6.8和12.7个月延长,x2值分别为2.057和2.851,P值分别为0.018和0.027.Cox多因素分析显示,T790M基因突变是影响PFS(RR=0.653,95％CI为0.069～0.886,P=0.032)及OS(RR=0.847,95％CI为0.208～2.696,P=0.008)的独立因素.结论 T790M基因阳性突变与EGFR-TKI耐药后进展类型有关,同时是影响PFS及OS的独立因素.
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血清游离DNA浓度及完整性在食管癌诊断中的价值
目的 探讨血清游离DNA(cf-DNA)浓度及完整性在食管癌诊断中的价值.方法 收集68例食管癌患者、36例食管良性病变患者和45例健康体检者的静脉血标本.采用基于Alu序列的实时荧光定量PCR法(Alu-qPCR)扩增重复短片段Alu115和长片段Alu247,检测血清cf-DNA浓度和完整性指数,血清DNA的总水平以Alu115的含量表示,完整性指数以Alu247/Alu115表示.采用化学发光法检测血清癌胚抗原(CEA)和鳞状细胞癌抗原( SCC)浓度.分析血清cf-DNA浓度和完整性指数与食管癌患者临床病理特征以及CEA和SCC的关系.采用受试者工作特征曲线( ROC)评价血清cf-DNA浓度、完整性指数、CEA和SCC的诊断效能.结果 食管癌组、食管良性病变组、健康对照组血清Alu115的含量分别为1 162.0(817.8～1 652.4)、496.7(310.9～777.9)和432.3(198.4～634.1) ng/ml,Alu247/Alu115分别为0.57(0.51～0.65)、0.43(0.30～0.51)和0.42(0.33～0.48).食管癌组血清Alu115含量和Alu247/Alu115均明显高于健康对照组和食管良性病变组(均P＜0.01),食管良性病变组与健康对照组血清Alu115含量和Alu247/Alu115的差异无统计学意义(均P＞0.05).食管癌患者血清Alu115含量与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、美国癌症联合委员会( AJCC)分期及有无淋巴结转移无关(均P＞0.05),但Ⅲ期患者的血清Alu247/Alu115高于Ⅰ～Ⅱ期患者( P＜0.05),Ⅳ期患者高于Ⅲ期患者(P＜0.05).食管癌患者血清Alu115含量与CEA和SCC的水平无关(均P＞0.05), Alu247/Alu115与CEA和SCC的水平也无关(均P＞0.05).血清Alu115含量和Alu247/Alu115诊断食管癌的 ROC 曲线下面积分别为 0.867 和 0.854,均高于 CEA(0.622)和 SCC(0.753),Alu115和Alu247/Alu115联合CEA和SCC检测时,诊断食管癌的灵敏度可分别提高到95.6%和94.1%.结论 血清cf-DNA浓度和完整性检测有助于食管癌的早期辅助诊断和病程监测,对食管癌的诊断价值优于CEA和SCC.
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胎儿游离DNA用于无创产前诊断的研究进展
产前诊断是指在出生前对胚胎或胎儿的发育状态,以及是否患有疾病等进行检测,其目的不仅限于发现尚无有效治疗手段的胎源性疾病,以尽早终止妊娠,而且可使产科医师在胎儿出生前或出生后,把握适当时机对可治性疾病采取药物或手术治疗,同时使胎儿父母能够了解妊娠状况,做到知情选择[1],对于提高人口素质具有重要意义.传统获取胎儿遗传信息进行的产前诊断均为有创性操作,可能造成胎儿损伤、母体流产或宫内感染,甚至胎死宫内等.近年研究[2-3]发现,妊娠母体血浆中存在游离胎儿DNA,为无创产前诊断创造了条件.1989年,Lo等[4]首次应用巢式聚合酶链反应(PCR)技术,在妊娠妇女外周血胎儿细胞中扩增出Y特异性重复序列,提出该技术可用于产前诊断.
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母血中胎儿游离DNA进行地中海贫血的无创产前诊断研究
目的 探讨母血中胎儿游离DNA进行地中海贫血的无创产前诊断价值.方法 选取我院2014年6月～2016年1月的10例地中海贫血妊娠妇女为研究对象,与传统的羊水穿刺诊断进行比较,采用孕妇外周血血中胎儿游离DNA高通量测序诊断,分析高通量测序方法的检出率、误诊率、漏诊率.结果 胎儿游离DNA高通量测序的检出率、误诊率及漏诊率分别为90.0％(9/10)、0.0％(0/10)和10.0％(1/10),与金标准比较基本一致,可以用于地中海贫血的诊断.结论 胎儿游离DNA高通量测序可以用于地中海贫血的无创产前诊断,对临床有一定的指导及应用意义.
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游离DNA与临床肿瘤的研究进展
游离DNA是一种存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中的细胞外DNA.体液中游离DNA水平和(或)基因的改变与疾病的发生发展有密切的关系.作为一种新型的检测对象,游离DNA取材简便,更适合于临床疾病的研究应用.游离DNA在临床肿瘤中的研究应用广泛,研究发现游离DNA的改变与肿瘤的发生发展密切相关.
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血清cf-DNA对宫颈癌早期辅助诊断的价值研究
目的 探讨血清循环游离DNA(cf-DNA)对宫颈癌的早期辅助诊断的价值.方法 选择2012年3月至2014年5月陕西省第二人民医院妇产科收治的36例宫颈癌患者为宫颈癌组,并选择同期收治的30例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅲ患者(CINⅢ组)、30例体检健康妇女(健康组)为对照研究,比较三组血清cf-DNA水平的差异,分析36例宫颈癌患者的cf-DNA水平与临床病理特征的相关性.与血清鳞状细胞癌抗原(SCCA)、糖类抗原(CA125、CA19-9)诊断价值进行比较.结果 宫颈癌组患者的cf-DNA水平高于CINⅢ组及健康组[(16±3)μg/L比(8±3)μg/L、(8±4)μg/L],差异有统计学意义(P＜0.01).Ⅱ～Ⅲ期和肿瘤直径≥4 cm的宫颈癌患者cf-DNA水平高于Ⅰ期和肿瘤直径＜4 cm的患者(P＜0.05).受试者工作特征曲线分析显示,cf-DNA、SCCA、CA125及CA19-9对宫颈癌诊断ROC曲线下面积分别为0.976,0.764,0.608,0.598,约登指数分别53.9％、26.1％、4.4％、3.3％,cf-DNA总体诊断效能显著优于其他指标.结论 血清cf-DNA水平的检测有助于临床早期诊断宫颈癌及判断其治疗预后,值得临床推广.
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孕妇血浆中胎儿游离DNA检测在唐氏综合征产前诊断中的应用
目的：探讨检测孕妇血浆中胎儿游离DNA在诊断唐氏综合征中所发挥的作用。方法随机选取2011年2月至2012年2月在我院进行产前检查的孕妇40例，其中包括正常产检、高龄或唐氏综合征需实施羊水穿刺的高危孕妇等，分为正常男胎妊娠组15例，正常女胎妊娠组13例，唐氏综合征男胎妊娠组12例。通过实时定量的PCR技术，对孕妇血浆中胎儿游离DNA水平变化进行检测比对。结果正常男胎妊娠组及唐氏综合征男胎妊娠组均检测出DYS14基因及β-actin基因，正常女胎妊娠组因无Y染色体，未检出DYS14基因。正常男胎妊娠组的DYS14基因定量数值为（31.9±17.6）GE/mL，范围分布为23~66 GE/mL，而唐氏综合征男胎妊娠组的DYS14基因定量数值为（74.6±31.2）GE/mL，范围分布为56~108 GE/mL。结论采用实时定量的PCR技术，对孕妇血浆中胎儿游离DNA进行检测，是一种较为操作快捷、经济合理的非创伤性产前筛查。
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肺癌与食管癌患者血浆游离DNA含量与患者临床特征的相关性
目的 探讨肺癌与食管癌患者血浆游离DNA含量与患者临床特征的相关性,分析患者肿瘤组织和血浆游离DNA的EGFR/KRAS基因突变的符合率.方法 收集2015年1-3月郑州大学附属肿瘤医院收治的肺癌及食管癌患者肿瘤组织样本、配对血浆样本共30例.采用磁珠法提取患者血浆游离DNA及组织基因组DNA,分析血浆游离DNA含量和患者临床特征的相关性.采用荧光PCR法检测患者组织基因组DNA及血浆游离DNA的EGFR/KRAS突变,分析血浆游离DNA和组织DNA突变符合率.结果 肺癌患者血浆游离DNA[(5.0±1.4) μg/L]、食管癌患者血浆游离DNA[(7.0 ±0.8)μg/L]水平与患者性别、年龄、部位、肿瘤分期无显著性相关性,与肿瘤体积呈正相关(r=0.574,P=0.01);食管癌组织DNA与血浆游离DNA均未检测出突变.肺癌组织中共检测到6例EGFR突变,1例KRAS突变;血浆游离DNA中共检测到4例EGFR突变,1例KRAS突变.结论 肺癌、食管癌患者血浆游离DNA水平与其肿瘤负荷呈正相关,血浆游离DNA与肿瘤组织DNA的EGFR/KRAS突变具有较好的一致性.
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胚胎培养液中游离DNA应用于植入前遗传学筛查中的研究进展
植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening,PGS)是指在体外受精一胚胎移植过程中,对具有高遗传风险患者的胚胎进行种植前活检和遗传学分析,选择遗传物质正常的胚胎植入母体宫腔,从而获得健康子代的诊断方法.目前,PGS仍主要通过胚胎活检获取细胞进行遗传学检测,而该有创过程可能会对胚胎发育及产科结局产生不良影响.近年研究发现胚胎培养液中含有胚胎来源的游离DNA片段,其含量与胚胎的碎片率呈正相关,并已在胚胎染色体及单基因疾病的检测和诊断方面得到了初步应用,开创了胚胎无创性PGS的先河.对胚胎培养液中游离DNA进行植入前遗传学筛查具有无创、取材简便、在分子水平检测胚胎的遗传物质等优点,有巨大的应用前景.但目前该技术尚处于研究阶段,存在易污染和特异性较差等问题,有待进一步完善.
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孕妇血浆中游离胎儿DNA在产前诊断中的研究进展
用妊娠妇女外周血中的胎儿DNA进行产前诊断是目前产前诊断研究的热点，从妊娠妇女外周血中得到胎儿DNA主要有两种途径，一种是从妊娠妇女外周血中富集纯化胎儿细胞，另一种是从孕妇血浆／血清中直接提取游离的胎儿DNA。将对孕妇血浆中的胎儿DNA在非侵入性产前诊断中的应用及存在的问题进行综述。
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百草枯体外诱导人外周血中性粒细胞胞外诱捕网形成的实验研究
目的 探讨百草枯(PQ)能否诱导人外周血中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成.方法 分离健康者外周血中性粒细胞,苏木素-伊红(HE)染色后进行细胞鉴定;分别采用浓度为0(对照)、200、400、600、800、1 000、1 200 μmol/L的PQ溶液处理细胞,建立PQ中毒的体外模型,应用CCK-8细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒检测细胞存活率,选择半数致死量的PQ浓度作为实验干预点.根据细胞活性检测结果进行细胞染毒(PQ染毒组),以未染毒细胞作为对照.采用免疫荧光染色显微成像定性鉴定NETs形成情况;采用PicoGreen核酸定量分析试剂盒检测细胞上清中游离DNA含量;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞上清中瓜氨酸化组蛋白3 (H3Cit)、髓过氧化物酶(MPO)的蛋白表达.结果 HE染色鉴定中性粒细胞纯度约95％;经不同浓度PQ建立中毒体外模型后发现,PQ浓度为800 μmol/L时细胞存活率为(58±2)％,以该半数致死量作为实验干预点.免疫荧光定性观察显示,对照组中性粒细胞仅有少量H3Cit及MPO表达,无NETs形成;而800 μmol/L PQ可以刺激中性粒细胞产生由DNA、H3Cit和MPO形成的NETs.定量结果显示,与对照组比较,PQ染毒组细胞上清中游离DNA含量显著升高(μg/L:2235±462比561±87,P＜0.01);且PQ染毒组细胞上清中H3Cit和MPO蛋白表达量均较对照组明显升高[H3Cit蛋白表达(灰度值):0.23±0.03比0.11±0.01,MPO蛋白表达(灰度值):0.47±0.05比0.21±0.04,均P＜ 0.05].结论 800 μmol/L的PQ可以诱导人外周血中性粒细胞形成NETs.
关键词： 百草枯 中性粒细胞胞外诱捕网 游离DNA 中毒
