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实时荧光定量-聚合酶链反应检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究
目的 利用实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)技术,建立食品中金黄色葡萄球菌(金葡萄)污染的快速敏感特异的检测方法.方法 以金葡菌的FemB基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以金葡菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg2+浓度,以金葡菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性.并初步应用于样品的检测.结果 本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.8 μmol/L、0.6 μmol/L,Mg2+浓度为3.5 mmol/L时,具有良好的特异性和敏感性.在10株相关菌株的检测中,除金葡菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性.在纯菌条件下,低检测限为44 cfu/ml.稳定性分析表明:同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均<5%.检测样品结果显示real-time PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便.结论 该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值.
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TaqMan探针实时荧光定量PCR检测聚集性细菌性腹泻病原的初步应用
目的 应用TaqMan探针实时荧光定量PCR,对聚集性细菌性腹泻便标本提取的DNA,进行多项病原初筛检测,结合常规培养以提高工作效率.方法 应用TaqMan探针实时荧光定量PCR对3起聚集性细菌性腹泻便标本提取的DNA进行多项病原检测,初筛阳性者再进行相应阳性病原的常规培养.结果 第1起疫情22件便标本,6件沙门菌核酸阳性中有5件检出鼠伤寒沙门菌;第2起疫情16件便标本,4件肠致泻性大肠杆菌核酸阳性中有1件检出肠致病性大肠杆菌0142∶K86(B)和产耐热肠毒素的肠产毒性大肠杆菌;第3起疫情2件便标本,2件产气荚膜梭状芽胞杆菌核酸阳性中有1件检出产气荚膜梭状芽胞杆菌.TaqMan探针实时荧光定量PCR阳性检出率为30.0％ (12/40),常规培养法阳性检出率为17.5.0％ (7/40).结论 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测聚集性细菌性腹泻病原,阳性检出率高于常规培养法,有初筛作用,为腹泻疫情的处置提供可靠的病原学检测数据.
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基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌
目的 建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法.方法 根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5′端标记FAM、SE探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法.结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性.ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2％,R2分别为0.998和0.995,低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml.结论 建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测.
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实时荧光定量PCR快速检测大肠埃希菌的方法研究
目的 基于TaqMan探针建立产肠毒素大肠埃希菌实时荧光定量PCR检测方法.方法 针对编码大肠埃希菌耐热肠毒素STI、不耐热性肠毒素LTI基因片段设计引物、探针,采用外标法,绘制标准曲线,进行荧光定量PCR检测.结果 引物、探针特异性良好,该方法的灵敏度可达到每反应1DNA拷贝,特异性强,检测范围在10°～107拷贝每反应,重复性及稳定性好,整个过程只需要2h.结论 该方法能快速、灵敏、特异检出产肠毒素大肠埃希菌.
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NLRP3基因单核苷酸多态性TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立
目的 建立以TaqMan探针实时荧光PCR技术为基础的核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(Nucleotide-binding oligomerization domain,Leucine rich Repeat and Pyrin domain containing,NLRP3)基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法.方法 以20份健康人血液样本为对象,选择NLRP3基因的两个SNP位点(rs3806265和rs35829419),针对每个位点分别设计1对PCR引物和2条TaqMan探针,进行实时荧光PCR扩增,对SNP位点进行分型.用常规PCR和基因测序的方法对TaqMan探针实时荧光PCR分型的结果进行验证.结果 用建立的TaqMan探针实时荧光PCR分型法对20份样本进行检测,其中rs3806265位点发现Tr基因型3份,TC基因型8份,CC基因型9份;rs35829419位点发现CC基因型20份,无AC和AA基因型.分型结果与常规PCR及基因测序分型方法完全一致.结论 基于TaqMan探针技术的实时荧光PCR方法简单、快速,可实现对NLRP3基因位点的分型检测.
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多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌
目的 建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系.方法 针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和TaqMan探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌.结果 副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线.敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的低检测限分别为72、40、80 cfu/ml.对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致.结论 本研究建立的基于TaqMan探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测.
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建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法
目的 利用Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌.方法 根据沙门氏菌属共有基因序列和肠炎沙门氏菌的特异序列分别设计2组引物及探针,运用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果 采用沙门氏菌属探针可检测到25种不同血清型沙门氏菌(共49株),而11株阴性对照菌株未得到扩增;利用肠炎沙门氏菌探针可从25种不同血清型的沙门氏菌(共49株)和11株阴性对照菌株中特异性的检测出全部15株肠炎沙门氏菌;以肠炎沙门氏菌系列稀释度菌液DNA为模板进行实时荧光PCR扩增,菌株的模板浓度与Ct值之间呈现良好线性关系,线性系数(R2) 0.993,扩增效率87％,低检测浓度260 cfu/mL;分别接种肠炎沙门氏菌于四种样品进行模拟样品检测,实时荧光PCR检测结果与经典培养鉴定方法的检测结果相吻合.结论 实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法特异性强、敏感度高,可应用于食品中肠炎沙门氏菌的检测.
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甲肝病毒TaqMan PCR检测方法的建立
目的 建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,对甲肝病毒核酸进行检测.方法 根据GenBank发表的HAV全基因组序列资料分析结果,在其保守区段设计HAV特异性引物和探针,优化引物、探针浓度,与佳退火温度,并考察检测体系的特异性、敏感性与重复性.结果 本研究体系的引物和探针浓度为0.8 μmol/L和0.6 μmol/L,退火温度为52℃时,具有良好的特异性与敏感性,检测灵敏度可达0.1 TCID50.同一样品重复检测3次,Ct值的变异系数均小于5%.结论 本研究建立的HAV TaqMan RT-PCR方法特异、敏感、快速且有效减少交叉污染的概率,为临床及水产品中的甲肝病毒的早期快速检测提供了一种新方法.
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基于TaqMan探针三重荧光PCR检测沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌
目的 建立基于TaqMan探针三重荧光PCR检测沙门菌(salmonella,Sa)、肠炎沙门菌(salmonella enteritidis,SE)和鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium,ST)的方法.方法 根据沙门菌aceA基因、肠炎沙门菌特异序列(GenBank:AF370707.1)、鼠伤寒沙门菌的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1),分别设计引物和TaqMan探针,在探针的5'端分别标记FAM、VIC、cy5,建立基于TaqMan探针三重实时荧光PCR检测沙门菌的方法.结果 29种不同血清型沙门菌均扩增出aceA基因,肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的引物和探针分别特异性地扩增出15株肠炎沙门菌和11株鼠伤寒沙门菌,而其他血清型沙门菌和17株非沙门菌扩增结果阴性.aceA、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的三重荧光PCR扩增效率分别为89％、87％、90％,低检测浓度分别达到280 cfu/ml、260 cfu/ml、300 cfu/ml.结论 本研究建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的特异性检测.
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新疆伊犁地区不同品种犬博尔纳病病毒自然感染调查
目的 调查新疆伊犁地区不同品种犬博尔纳病病毒(BDV)流行现状和分析其可能的种系来源.方法 采用改进的巢式反转录PCR(nRT-PCR)方法,检测犬外周血单核细胞(PBMCs)BDV磷蛋白(p24)RNA基因片段.用BDV核蛋白(p40)RNA片段和质粒PMD19标准品验证p24阳性产物,排除可能的假阳性.验证后的阳性产物进行基因测序、同源比对、氨基酸序列和系统发生学分析.结果 8个品种150只犬中,仅哈萨克牧羊犬检出BDV p24片段,阳性率为11.0%(10/91).基因序列与德国马He/80和德国绵羊S6病毒株同源相似度分别为99.2%和95.7%,氨基酸相似度为100%和89.3%,亲缘关系与He/80近,其次为S6.结论 新疆伊犁地区哈萨克牧羊犬可能存在BDV自然感染,其流行株与该地区伊犁马感染的He/80和引进德国美利奴绵羊的S6病毒株有关.
关键词： 博尔纳病病毒 磷蛋白RNA 巢式反转录-聚合酶链反应 TaqMan探针 犬 -
新疆伊犁地区马群中博尔纳病病毒自然感染调查
目的 了解新疆伊犁地区马群中博尔纳病病毒(BDV)的流行状况,分析该病毒的种系来源.方法 采用改进的巢式反转录PCR(nRT-PCR)方法对新疆伊犁地区120匹马的外周血单个核细胞(PBMC)及脑组织中的BDV p24基因片段进行检测,对阳性产物进行基因序列测定和同源性分析.结果 有3匹马外周血和腩组织中同时检测到BDV,阳性率为2.5%(3/120).扩增产物序列与其他国外马源BDV分离株同源性>93%,与标准株He/80同源性达到98%以上.结论 新疆伊犁地区马群中存在BDV的自然感染.该地区BDV流行株与标准株He/80存在高度的同源性.
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基于DNA条形码的翠云草快速鉴定方法研究
目的:基于卷柏属植物DNA条形码鉴定序列,运行TaqMan探针技术探讨翠云草快速鉴定新方法.方法:本文利用DNA条形码鉴定技术对采集的11种32份卷柏属样本提取总DNA扩增ITS2序列,结合Genbank数据库的34种103条序列综合分析,针对翠云草设计特异引物及探针,运用实时荧光PCR检测技术比较序列扩增荧光信号差异实现翠云草的快速鉴定.结果:在所分析的物种中ITS2序列可将翠云草与其它卷柏属近源物种有效区分,TaqMan探针及引物特异性较好,本研究建立的方法在翠云草的鉴别中具有良好的特异性、重复性及灵敏性,甚至可从低至1 mg的样品中提取DNA得到有效检出.结论:基于DNA条形码鉴定序列变异位点信息,运用高特异TaqMan探针实时荧光PCR检测技术,可实现翠云草真伪快速鉴别,具有中药材市场监管应用前景,将为中药材快速鉴定应用研究提供参考.
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埃可病毒9型荧光RT-PCR快速检测方法的建立及应用
为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测埃可病毒9型病毒核酸,并初步应用于埃可病毒9型的临床标本检测.根据GenBank登录的埃可病毒9型毒株VP1基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针.对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,同时对疑似埃可病毒9型病例标本进行检测.该方法对埃可病毒9型的检出有高度特异性,与EV71、CA16、CA24v、CA6、CA10、埃可病毒30型等均无交叉反应,检测灵敏度均达0.1TCID50/mL,可从疑似埃可病例粪便标本中直接检测病毒核酸,检测仅需3～4h.本研究建立的埃可病毒9型TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于临床早期诊断.
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荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸
目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.
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风疹病毒荧光逆转录-聚合酶链反应快速检测方法的建立
目的 建立快速、灵敏的TaqMan探针荧光逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)用于风疹病毒核酸的特异性检测.方法 在风疹病毒非结构蛋白P150基因保守区域,设计特异性引物和TaqMan探针,优化荧光RT-PCR反应体系与反应条件,以提高方法的特异性和灵敏度,并应用于风疹疑似患者的临床样本检测.结果 建立的荧光RT-PCR对风疹病毒检测具有高度特异性,对麻疹、流行性腮腺炎、流行性感冒等其他病毒均无交叉反应,且检测的灵敏度达0.01 TCID20(50%组织培养感染刺量)/管.采用该方法从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右,且操作简便、重复性好、准确率高.结论 建立的风疹病毒荧光RT-PCR高效、特异、敏感,为风疹病毒感染的早期快速检测提供了一种新的方法.
关键词： 风疹病毒 荧光逆转录-聚合酶链反应 检测 TaqMan探针 -
埃博拉病毒检测与分型Real-time PCR方法的建立
目的 建立一种致死性埃博拉病毒(EBOV)的快速检测与分型方法. 方法 根据苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因的保守区序列,设计一对通用引物及特异性TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释质粒pblue-SG,pblue-ZG为标准品,进行Real-time PCR扩增,制作标准曲线,并进行重复性、准确性检验及特异性检测. 结果 Real-time PCR检测苏丹型和扎伊尔型埃博拉病毒标准曲线相关系数均大于0.99,灵敏度可达1.0×101拷贝,高于常规PCR方法的106～107；7种其他对照烈性病病原体检测均呈阴性. 结论 用建立的Real time PCR方法检测埃博拉病毒快速、灵敏、特异,重复性好,为埃博拉出血热的快速确诊奠定了基础.
关键词： 埃博拉病毒 Real-time PCR TaqMan探针 检测方法 -
应用TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测肠道病毒的研究
目的 建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量RT-PCR检测肠道病毒的方法.方法 根据GenBank中肠道病毒5′UTR序列,应用生物软件在保守区设计与筛选特异引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对急性临床样本的检测,评价该方法的实际应用价值.结果 该方法对肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及柯萨奇病毒和埃可病毒等的检测有高度特异性,甲肝病毒、乙脑病毒、登革病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、诺如病毒等均呈阴性.该方法的检测下限达10-1TCID50/100 μl.12份急性结膜炎病例结膜拭子标本中7份肠道病毒核酸阳性,普通RT-PCR方法5份阳性.结论 TaqMan荧光定量RT-PCR方法快速、敏感、特异,适于肠道病毒的快速检测.
关键词： 肠道病毒 荧光定量RT-PCR TaqMan探针 快速检测 -
快速诊断早期棘阿米巴角膜炎qPCR方法的建立及应用
目的 建立检测棘阿米巴18s rDNA的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time PCR or qPCR)方法,为无创早期诊断棘阿米巴病提供基因诊断标准方法. 方法 提取分离自土壤和水中的5株棘阿米巴DNA,测序后与GenBank中搜索到的棘阿米巴67条序列进行比对,在物种保守区域设计Real-time引物和TaqMan探针,通过T克隆载体制作标准品并测序,建立方法的标准曲线,测定低检测浓度,同时用该方法检测其他病原微生物及临床疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,实验数据通过JMP5.0.1和测评软件进行棘阿米巴角膜炎F检验和诊断测试评估. 结果 qPCR和培养法检测180例疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,阳性率分别为(5±1)％和(2.9±1.2)％,差异有统计学意义(F=13,P＜0.01).以qPCR法测定的标准品CT值为纵坐标(Y),以标本浓度的对数为横坐标(X)建立标准曲线:Y=-3.24X+40.74,R＞0.99.用建立的qPCR方法测定棘阿米巴18s rDNA低浓度为10拷贝/UL.用qPCR检测其他病原微生物,结果均为阴性.通过诊断测试评估软件比较两种方法检测临床疑似病人眼分泌物结果,95％置信区间内qPCR方法的灵敏度为100％,传统实验室培养法为62.5％. 结论 棘阿米巴18s rDNA Real-time PCR基因检测方法具有无创伤性、高效、特异、经济等特点,适用于疑似棘阿米巴角膜炎病人的筛查.
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TaqMan荧光定量PCR检测1型登革热病毒及临床应用
目的 建立登革热1型病毒(DV1)TaqMan荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床诊断.方法 根据DV1 5'端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan探针.用4个血清型DV标准毒株为对照,收集40份DV1临床血清为检测标本.通过对DV1标准毒株RT-PCR后,采用体外转录方式获得RNA模板作为阳性对照,检测所建立TaqMan荧光定量PCR方法的特异性.取DV-IgM/IgG用ELISA检测患者血清,将TaqMan荧光定量PCR和DV-IgM/IgGELISA进行敏感性比较.结果 所建立方法的低检测限约为每反应10个基因拷贝.发病后不同时间采集的登革热患者血清标本检测结果为:发病1～3 d的患者RT-PCR阳性检出率高(81.25%);4～6d ELISA-IgM检出率高(85.00%);7 d后ELISA-IgG检出率高(75.00%).结论 在登革热的早期诊断中建立的RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为DV1的快速诊断方法.
关键词： 登革热1型病毒 荧光定量RT-PCR TaqMan探针 检测 -
TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒
目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸,并初步应用于登革热的临床标本检测.方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针.对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性.同时对疑似登革热病例血清标本进行检测.结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性,与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应,检测的灵敏度均达0.1 TCID50,可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断.
关键词： 荧光定量RT-PCR TaqMan探针 登革病毒
