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2013年济南市售牡蛎和毛蚶中副溶血性弧菌污染水平调查
目的 了解济南市零售和餐饮环节,贝类海产品牡蛎和毛蚶中副溶血性弧菌污染水平及毒力基因携带情况.方法 2013年夏秋季节,从市场、餐馆采集牡蛎和毛蚶样品52份,采用多重荧光MPN-PCR法对副溶血性弧菌的污染水平进行定量检测,并对毒力基因(tdh、trh、orf8)携带情况进行调查.结果 副溶血性弧菌在牡蛎和毛蚶中的检出率为46.15％ (24/52);其中污染水平≥110 MPN/g的样品占33.33％ (8/24);毒力基因阳性者有28株,以or为主(18株),tdh、trh各5株.结论 济南市市售牡蛎和毛蚶中,致病性副溶血性弧菌污染水平较高,提示存在一定的食品安全风险.
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多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌
目的 建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系.方法 针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和TaqMan探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌.结果 副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线.敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的低检测限分别为72、40、80 cfu/ml.对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致.结论 本研究建立的基于TaqMan探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测.
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多重荧光PCR法与细菌培养法在食品中致泻性大肠埃希氏菌检测中的应用
目的 通过多重荧光PCR法与细菌培养法在食品中致泻性大肠埃希氏菌检测中的应用,比较两种方法的敏感性、特异性、时限性、重复性.方法 采集10类食品200份样品进行细菌培养法和荧光PCR法检测致泻性大肠埃希氏菌.结果 在10类食品200份样品中细菌培养法检出普通大肠埃希氏菌30株,致泻性大肠埃希氏菌未检出.多重荧光PCR法检出EHEC阳性4份.其中生禽畜肉检出2份、水产品2份.EPEC、ETEC、EAEC、EIEC均为阴性.结论 与传统的细菌培养法相比,多重荧光PCR法可以为细菌分离培养提供初步信息,提示实验室在进行分离培养时应有针对地重点考虑,减轻分离培养繁杂过程,有利于实验室诊断.
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多重荧光PCR在Y染色体微缺失检测中的应用
目的:Y染色体AZF微缺失检测是国内外公认的男性不育辅助检查之一,传统的PCR凝胶电泳因其缺点已不太适应临床需要.本文旨在探讨多重荧光PCR在AZF微缺失检测中的可行性. 方法:收集AZF微缺失各种类型样本238例,正常男性样本62例,比对两种不同的检测方法(多重PCR凝胶电泳和多重荧光PCR),Kappa检验比较分析两种方法检测结果的一致性. 结果:多重PCR凝胶电泳和多重荧光PCR检测300例临床标本,两者在位点检出率方面完全一致,差异无统计学意义.Kappa检验显示Y染色体AZFa、AZFb、AZFc 3个区6个位点P值及Kappa值均为1,两种方法一致性好,无统计学差异. 结论:多重荧光PCR技术比多重PCR凝胶电泳法可大量节约时间,减少工作量,提高临床检验工作效率,是临床Y染色体微缺失检测的优选方法.
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致病性大肠埃希菌毒素基因的Allglo探针技术鉴定
目的：基于Allglo探针技术结合多重荧光PCR，建立快速、简便鉴定致病性大肠埃希菌相关毒素基因的方法。方法选取致病性大肠埃希菌的紧密黏附素基因（ eae）、志贺样毒素Ⅰ基因（ stx I）、志贺样毒素II基因（ stx II）和转录激活因子基因（ aggR）作为靶点。通过设计引物和Allglo探针，建立多重荧光PCR反应体系。同时，构建了4种毒素基因标准质粒，进而评价方法的特异性、灵敏性和重复性。结果基于Allglo探针技术的多重荧光PCR方法可同时准确、特异地鉴定致病性大肠埃希菌所携带的4种毒素相关基因，eae基因和aggR基因的灵敏度为10 copies/μL，stx I基因和stx II基因的灵敏度为1 copies/μL；定量检测的批间和批内变异系数均小于5%。对356份腹泻粪便样本进行评价，结果显示检出39份基因阳性。39份阳性样本中，eae基因阳性为53.85%，stxⅠ基因和stx II基因阳性为23.08%，aggR基因阳性为46.15%。通过直接测序方法进行鉴定，符合率达到100.00%。结论本实验建立的基于Allglo探针技术结合多重荧光PCR方法具有操作简便、特异性好和灵敏度高等特点，为致病性大肠埃希菌鉴定提供了一种快速、可靠的检测方法。
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多重荧光PCR-毛细管电泳进行微卫星不稳定性分析中的常见问题
微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)作为肿瘤发生相关机制之一,其检测已广泛应用于多项研究.利用多重荧光PCR结合毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)技术检测微卫星是一种具有优势的方法.它有高效、稳定、灵敏度高、分析结果可靠等优点.但由于多重荧光PCR-毛细管电泳是一项精度要求相对较高的检测技术,因此实验操作中不少细节是影响检测成败的关键因素,并可能引起微卫星数据分析的误解.本文结合实例,对这项方法在使用中的一些常见问题进行探讨,并就相关技术优化等方面做一简要介绍.
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多重荧光PCR检测婴幼儿食品中常见病原菌
目的 建立婴幼儿食品中3种常见病原菌的多重荧光PCR检测方法.方法 根据阪崎杆菌16S-23SrDNA保守区、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因序列和蜡样芽胞杆菌cerA特异基因,设计合成引物和探针,优化反应条件.结果 建立的多重荧光PCR方法只特异性地扩增目标病原菌；用国标法和多重荧光PCR方法同时对194份奶粉和米粉样品进行检测,结果完全一致.多重荧光PCR方法检测过程可在8h内完成.结论 建立的多重荧光PCR法敏感性高、特异性强、快速、准确,可同时检测婴幼儿食品中的阪崎杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌,适合批量样本检测,有很好的应用前景.
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应用多重荧光Real-time PCR快速鉴定猪链球菌2型
目的 建立能同时鉴定链球菌2型(S.suis 2)和确定主要毒力标志MRP的快速检测方法.方法 根据S.suis 2 CPS2J与MRP的保守序列,设计并合成了2 对引物及其相应探针.通过优化各反应物的浓度、配比和循环程序,建立能从组织中直接检测CPS2J和MRP的实时荧光PCR 方法.结果 能在3 h内对送检组织样品检测确定S.suis 2型和MRP毒力基因,低检测菌体浓度24CFU/ml.与普通PCR相比,敏感性在检测CPS2J时比普通PCR高至少10倍以上,而在检测MRP时比其高100倍.与葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、S.suis 1型、9型等无交叉反应.同一人在试剂放置0d、20d和60d检测,以及不同人用同一方法检测,变异系数均小于5%,差异不显著.用于检测SSsc0501攻毒后的样品,结果在心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、脑中均检测到S.suis 2阳性,MRP阳性.而在肌肉中,S.suis 2和MRP均为阴性.结论 建立的多重荧光Real-time PCR敏感性高、特异性强,稳定性和重复性好,能用于可疑S.suis 2型组织样品的快速定型和毒力鉴定.
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杭州地区乙型肝炎病毒基因型分析
目的:建立多重荧光PCR技术检测乙肝病毒(HBV)基因型,并了解杭州地区乙型肝炎病毒感染者基因型分布特点.方法:首先优化TaqMan探针多重荧光PCR的反应体系,然后采用该法检测杭州地区150例慢性乙肝患者的HBV基因型,并用测序方法进行确认.结果:B基因型65例(43.3%),C基因型53例(35.3%),B+C混合型24例(16%),未分型8例(5.3%).结论:杭州地区乙型肝炎病毒感染者基因型以B、C型为主,B、C混合型感染比例较其他地区高,TaqMan探针多重荧光PCR简单经济,可以应用于大规模HBV基因型研究.
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诺如病毒检测技术研究应用进展
诺如病毒(Norovirus,NV)首次在1972年美国俄亥俄州诺瓦克镇暴发腹泻疫情的患者粪便中发现[1],故初被称为诺瓦克病毒(Norwalkvirus),后不断地在全球各地的腹泻病人粪便中发现此病毒.2002年8月,在第十二届国际病毒会议上,被正式命名为诺如病毒(Norovirus)[2].诺如病毒是常见的非细菌性急性肠胃炎的病原体之一,粪-口途径是主要传播方式,也可以通过污染的水源、食物及由病人的呕吐物和粪便形成的气溶胶等传播.易在医院、疗养院、学校、幼儿园、船舱、宾馆等人多密集、半封闭的环境中引起暴发性流行.诺如病毒感染的特征为突然发病,呕吐、腹痛和水样腹泻,可伴有发烧和头痛等,所有年龄人群对该病毒敏感,一般潜伏期为24 h～48 h,病程为2d～3d,常自愈.在北半球,每年的11月至次年4月是高发季节.
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利用多重荧光定量PCR协助诊断Crigler-Najjar综合征Ⅱ型及Gilbert综合征
目的 尝试建立一个多重荧光定量PCR反应体系对Crigler-Najjar综合征Ⅱ型(Crigler-Najjar syndromeⅡ,CNSⅡ)及Gil-bert综合征(Gilbert syndrome,GS)患者的尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1A1(uridine diphosphate glucuronosyhransferase 1A1, UGT1 A1)基因突变进行检测,以运用于协助以上疾病的临床诊断.方法 选取国内外目前报道较多UGT1A1基因常见突变的4个位点[A(TA)7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp],利用多重荧光定量PCR Tapman探针法对96例临床诊断为GS或CNSⅡ患者及100名健康体检者全血基因组进行检测,利用T-A克隆法对扩增产物进行测序验证.结果 多重荧光定量PCR反应体系可有效检测出实验样本中所存在的以上4种基因突变.A(TA)7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp在试验组测得的阳性率高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).PCR产物电泳及测序结果与其基因检测表型完全一致.结论 利用多重荧光定量PCR技术可以更简便、快捷、有效地对GS或CNSⅡ患者中的UGT1A1基因突变进行检测,为临床诊断提供有用信息.
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登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究
目的 建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型.方法 选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针,评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限；并对20份阳性样本进行检测.结果 20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性.梯度检测的变异系数均小于5％.对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测低检测限达103 copies/ml.结论 本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定.
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改良分子信标多重荧光PCR快速检测产毒性大肠杆菌
目的 应用改良分子信标探针建立多重实时荧光PCR方法快速检测产毒性大肠杆菌.方法 通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)下载产毒性大肠杆菌肠毒素基因Stp、Sth、Lt的基因序列,设计引物和探针,建立多重实时荧光PCR体系,应用于感染性腹泻病原体中ETEC的快速筛查.结果 改良分子信标多重荧光PCR反应体系,1管内同时检测ETEC的Stp、Sth、Lt三个毒素基因的方法具有简单、快速、省时、灵敏度高的特点,从核酸提取到检测结果仅需3h,低检出限可达3× 102 CFU/mL,稳定性良好,且无交叉反应,与普通PCR相比,灵敏度和特异度分别为100％和99.92％,kappa值为0.87,一致性良好.结论 本研究建立了一种用于检测产毒性大肠杆菌的方法,具有简便、快速和高效的特点,适合用于ETEC的临床诊断.
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尿路肿瘤细胞多重荧光PCR微卫星不稳定和荧光原位杂交的联合诊断
目的 研究泌尿系统脱落细胞的微卫星、荧光原位杂交联合分子病理诊断.方法 使用ABI试剂和ABI3100仪器应用多重荧光PCR(TGFbRII、IFNA、D9S171、D9S283、D4S243、D9S162、D17S695)和FISH法(CSP3/CSP7 DNA探针,GLP P16/CSP17 DNA探针)分别检测患者尿路脱落细胞的微卫星不稳定和缺失,结合HE染色进行联合诊断.结果 35例尿液样本:泌尿系肿瘤组15例,发现6例高频度微卫星不稳定(MSI-H),8例低频度微卫星不稳定(MSI-L),1例微卫星稳定(MSS),诊断阳性敏感度达93%;另外膀胱癌术后复查组6例,血尿及尿路上皮轻度异型组7例,正常体检组7例中,在血尿及轻度异型组发现1例MSI-L,其余均为MSS,阴性诊断特异率达95%.在6例联合检测组中,发现2例FISH阳性,1例MSI-L.结论 尿路肿瘤细胞的微卫星和FISH联合检测可作为膀胱肿瘤诊断和监测复发的有效非侵袭性检测方法,但还需扩大样本进一步研究.
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多重荧光PCR结合HANDS系统快速检测4种食源性致病菌
目的 建立快速、准确检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的多重荧光PCR方法.方法 将多重荧光PCR技术与HANDS系统结合,采用同源加尾的方式,构建四重荧光PCR体系,分析该体系的特异性,并进行模拟实验,该方法与国家标准检测方法进行方法比对实验.结果 该系统检测出了4种目标致病菌.初始菌浓度分别为5、9、10、2、50、3 cfu/ml的沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和兰氏A群、C群、G群链球菌增菌液,在增菌18h后都被体系检出.该方法与国家标准方法对样品的检测结果一致.结论 首次结合HANDS系统构建了同时检测4种致病菌的多重荧光PCR方法,该方法特异性强、灵敏度高,是检测沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的快速、准确方法.
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尿路肿瘤细胞多重荧光PCR检测微卫星不稳定
目的:研究膀胱肿瘤尿路脱落细胞的微卫星状态及其临床病理关系.方法:35例膀胱肿瘤尿液脱落细胞应用多重荧光PCR检测尿路的微卫星状态.结果:35例尿液样本:膀胱肿瘤组15例,有6例MSI-H,8例MSI-L,1例MSS,诊断阳性敏感度达93.33%;膀胱癌术后复查组6例,血尿及尿路上皮轻度异型组7例,正常体检组7例中,在血尿及轻度异型组发现1例MSI-L,其余均为MSS,阴性特异率达95%.结论:尿路脱落细胞的微卫星检测可作为膀胱肿瘤诊断和监测复发的有效非侵袭性检测方法.
