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改良分子信标-双重实时荧光PCR快速检测SARS病毒
目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒的方法,用于SARS的早期诊断和动物溯源.方法利用改良分子信标技术、装甲RNA和双片段双色荧光技术,根据GenBank公布的SARS病毒聚合酶基因1b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,以部分临床标本的酶联吸附实验结果和传统细胞培养方法作为对照,建立分子信标检测SARS病毒的方法.对368份临床标本(咽漱液、血液、粪便、尿液)、52份细胞培养液和50份动物标本进行荧光PCR扩增.结果分子信标检测SARS病毒的方法灵敏度为10～100个拷贝/ml,与流感病毒等呼吸道病毒无交叉反应.分子信标检测368份临床标本,20份阳性.其中确诊病例阳性率为21.27%(10/47),确诊病例的咽漱液阳性率为43.48%,还分别从粪便和血清中检测到SARS病毒.52份细胞培养液,29份阳性,阳性率为55.77%.50份动物标本,23份阳性,阳性率为46%.结论改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源.
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改良分子信标-实时荧光PCR同时检测猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌
目的 建立猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,应用于食品和食物中毒病人标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断.方法 根据GenBank公布的猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的保守序列(CP000857.1),设计引物和改良分子信标探针,优化PCR程序和PCR成分,以11种细菌为对照,建立实时荧光PCR检测方法,并用71株常见血清型的沙门菌评价该方法的灵敏度和特异性,所建立的方法应用于70份食品样品的检测.结果 该改良分子信标一荧光PCR方法的DNA低检出限为10fg/反应体系,菌液低检出限为20 CFU/反应体系;无交叉荧光信号产生.针对目标菌均出现特异荧光信号.对71株沙门菌属的检测,该方法的灵敏度和特异度为100%.70份食品样品用荧光PCR和传统方法检测猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌,结果均为阴性.该方法从菌株的核酸提取到检测仅需1.5小时,从样品处理到检测仅需1天时间.结论 建立的实时PCR检测方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于食品及食物中毒标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断,保障食品安全.
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双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌
目的建立改良分子信标-双重实时PCR同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验. 方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时PCR-改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测. 结果改良分子信标-双重实时PCR反应体系DNA灵敏度为102.4～166.6fg/μl,菌液灵敏度为32～64CFU/ml或3～6CFU/PCR反应体系,无交叉反应.此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰.对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性.从样品处理到检测结果仅需1天时间. 结论改良分子信标-双重实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.
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一起肠炎沙门菌食物中毒的快速诊断与溯源
本研究采用改良分子信标-实时PCR快速检测方法和核酸脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术,成功地应用于深圳市一起细菌性食物中毒的快速诊断和准确溯源.
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改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌
目的:建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌(LMO)的快速方法,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断.方法:根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标-实时PCR检测体系,应用于食品中LMO检测.结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110fg,菌液灵敏度为99 cfu/ml或4 cfu/PCR反应体系,无交叉反应.以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号.上述方法可将检测时间由原来的至少4 d缩短至1 d.对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性,其中6份LMO细菌培养阳性.结论:改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,能提高LMO的检出率和准确性,可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断.
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改良分子信标-实时PCR快速检测志贺菌
目的:建立改良分子信标-实时PCR检测志贺菌的快速方法,应用于志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测.方法:根据GenBank公布志贺菌ipaH基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR-改良分子信标检测体系,应用于对志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测.结果:改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为93 fg/μl,菌液灵敏度为64 cfu/ml或2 cfu/PCR反应体系,无交叉反应.此反应体系检测67株志贺菌,均出现特异的荧光信号.对细菌性食物中毒样本等共657份样品进行志贺菌检测,42份志贺菌实时PCR阳性,其中41份志贺菌细菌培养阳性.从样品处理到检测结果仅需2 h～1 d时间.结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于志贺菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段,对于提高肠道门诊的工作效率有重要意义.
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一起食物中毒事件的快速诊断与病原分析
目的:同时应用传统细菌培养方法和改良分子信标方法检测食物中毒致病菌,为突发事件现场的调查处理及患者的治疗提供信息.方法:依据中华人民共和国国家标准《食品卫生微生物学检验》、广东卫生防疫《病原微生物学检验常规》和改良分子信标方法进行检测.结果:15份食品工人肛拭子及3份患者呕吐物均未检出致病菌.在111份患者肛拭子中,66份检出肠炎沙门菌,检出率为59.46%.37份可疑食品和剩余食品中5份检出肠炎沙门菌,18份生产加工环境样品中1份检出肠炎沙门菌.结论:此起食物中毒是面包厂在生产加工过程中糕点食品污染肠炎沙门菌而引起.改良分子信标方法能够快速准确的为传统方法提供检测方向信息,以及为现场疫情处理提供实验室依据.需要进一步加强食品卫生监督管理,定期对食品从业人员进行培训及健康体检,以提高食品安全意识.
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食品污染产单核李斯特菌不同检测方法学评估
目的 评价以不同方法检测食品中污染产单核李斯特菌(LMO)效果,并对其检测方法进行优化.方法 同时用国标法、改良国标法、改良分子信标-实时荧光PCR法、免疫磁性分离法对深圳市2004～2006年食品样品进行LMO分离鉴定并进行比较.结果 228份样品中8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性,其中6份LMO细菌培养阳性.国标法、改良国标法,改良分子信标-实时荧光PCR法、免疫磁性分离法都能检出LMO,检出率分别为2.63%、2.63%、3.50%、2.63%.深圳市食品中LMO的污染率为2.63%(国标法),速食类冻品污染率为12.8%(国标法).结论 荧光PCR法检出率高,将检测时间由原来的至少4～5d缩短至1d,可用于食品污染LMO状况调查的初筛和食物中毒的快速诊断;国标法与改良国标法的检出率相等,而后者的操作更方便.免疫磁性分离法的检出率低.
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改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157:H7
目的建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O157:H7的快速方法. 方法根据GenBank公布O157:H7的rfbE保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5'端,建立改良分子信标实时PCR检测O157:H7的反应体系,应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测. 结果共检测11种细菌,只有大肠杆菌O157:H7有荧光信号,其余10种全无荧光信号,且与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为64fg,菌液灵敏度为59cfu/ml或2cfu/PCR反应体系.应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O157:H7均出现特异的荧光信号,无干扰.对89份食品样品进行检测,5份O157:H7实时PCR阳性,其余样品为阴性,检测仅需2h.5份阳性样本,经传统方法培养,有3份检出大肠杆菌O157:H7. 结论改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于大肠杆菌O157:H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.
关键词： 大肠杆菌O157:H7 改良分子信标 实时PCR -
改良分子信标-实时PCR快速检测霍乱弧菌
目的建立改良分子信标-实时PCR检测霍乱弧菌的快速方法,应用于霍乱监测.方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)的保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,并进行特异性和灵敏度分析;同时以11种细菌作对照,建立改良分子信标检测霍乱孤菌的实时PCR反应体系,应用于霍乱监测.结果霍乱弧菌改良分子信标检测体系检测12种细菌,只有霍乱弧菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为102.4fg/ul,菌液灵敏度为32cfu/ml或3 cfu/PCR反应体系.对100份海产品和30份腹泻病人大便标本进行检测,结果都为阴性.检测时间仅需2h.结论改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱的快速诊断,为霍乱的分子流行病学调查提供新的检测手段.
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改良分子信标多重荧光PCR快速检测产毒性大肠杆菌
目的 应用改良分子信标探针建立多重实时荧光PCR方法快速检测产毒性大肠杆菌.方法 通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)下载产毒性大肠杆菌肠毒素基因Stp、Sth、Lt的基因序列,设计引物和探针,建立多重实时荧光PCR体系,应用于感染性腹泻病原体中ETEC的快速筛查.结果 改良分子信标多重荧光PCR反应体系,1管内同时检测ETEC的Stp、Sth、Lt三个毒素基因的方法具有简单、快速、省时、灵敏度高的特点,从核酸提取到检测结果仅需3h,低检出限可达3× 102 CFU/mL,稳定性良好,且无交叉反应,与普通PCR相比,灵敏度和特异度分别为100％和99.92％,kappa值为0.87,一致性良好.结论 本研究建立了一种用于检测产毒性大肠杆菌的方法,具有简便、快速和高效的特点,适合用于ETEC的临床诊断.
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产单核李斯特菌的改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测体系的建立
[目的]建立改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测产单核李斯特菌(LMO)的体系,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断. [方法]根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标荧光PCR检测体系.运用磁捕获材料对PCR检测阳性的增菌液进一步处理后划平皿做分离培养. [结果]改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110 fg,菌液灵敏度为99 cfu/ml或4 cfu/PCR反应体系,无交叉反应.以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号.对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性.用磁捕获材料处理此8份增菌液,全部细菌培养阳性,高于国标法的6份阳性.[结论]改良分子信标一实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,运用磁捕获试剂能有效提高培养阳性率.应用该检测系统能提高LMO的检出率和准确性.该系统可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断.
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改良分子信标—实时PCR快速检测副溶血弧菌
目的:建立改良分子信标-实时PCR检测副溶血弧菌的快速方法,应用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验.方法:根据GenBank公布副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5′,并进行特异性和灵敏度分析;同时以11种细菌作对照,建立改良分子信标检测副溶血弧菌的实时PCR反应体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测.结果:检测1 2种细菌,只有副溶血弧菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为1 66.6 fg/μl,菌液灵敏度为69 cfu/ml或6 cfu/PCCR反应体系.改良分子信标-实时PCR反应体系检测40株副溶血弧菌均出现特异的荧光信号,无干扰.对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性.检测时间仅需2 h.结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.
