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改良分子信标-双重实时荧光PCR快速检测SARS病毒
目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒的方法,用于SARS的早期诊断和动物溯源.方法利用改良分子信标技术、装甲RNA和双片段双色荧光技术,根据GenBank公布的SARS病毒聚合酶基因1b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,以部分临床标本的酶联吸附实验结果和传统细胞培养方法作为对照,建立分子信标检测SARS病毒的方法.对368份临床标本(咽漱液、血液、粪便、尿液)、52份细胞培养液和50份动物标本进行荧光PCR扩增.结果分子信标检测SARS病毒的方法灵敏度为10～100个拷贝/ml,与流感病毒等呼吸道病毒无交叉反应.分子信标检测368份临床标本,20份阳性.其中确诊病例阳性率为21.27%(10/47),确诊病例的咽漱液阳性率为43.48%,还分别从粪便和血清中检测到SARS病毒.52份细胞培养液,29份阳性,阳性率为55.77%.50份动物标本,23份阳性,阳性率为46%.结论改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源.
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人冠状病毒HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR检测方法的研究
目的 建立一种快速、灵敏、高效的人冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)和NL63 (HCoV-NL63)双重实时荧光RT-PCR检测方法.方法 根据GENBANK数据库中HCoV-HKU1和HCoV-NL63的基因序列,利用BIOEDIT5.0软件进行序列比对分析,选择基因组的保守序列,并借助引物设计生物信息学软件,设计筛选出一套针对HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR扩增的引物.从特异性、低检测限、重复性等方面进行评估,建立了HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR检测方法.结果 分别以HCoV-HKU1和HCoV-NL63质粒为模板,HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR方法的低检测量分别为4.96×102 copies/ml和4.96×102 copies/ml.该方法针对其他病原微生物及人类基因组无反应信号,特异性好.4个梯度稀释质粒样本的4次重复检测Ct值变异系数均＜5％,重复性好.结论 HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR方法准确性好、灵敏度高、稳定性好,在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的监测中具有很好的应用前景.
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双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用
目的 探讨双重实时荧光PCR 技术检测手足口病肠道病毒的应用效果.方法 用单一实时荧光PCR先检测标本中的肠道病毒通用病毒核酸,肠道病毒通用病毒核酸阳性再分别用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸,比较两种方法检测结果.结果 240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份,双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份,EV71阳性1份,其他肠道病毒45份,单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份,EV71阳性1份,CoxA16+EV71阳性2份,其他肠道病毒45份.EV71和其他肠道病毒符合率为100%.结论 双重实时荧光PCR 检测技术可以准确检测手足口病肠道病毒,且特异性强、灵敏度高,又可以快速得到检测结果,是一种快速检测手足口病病毒的方法.
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恙虫病东方体与莫氏立克次体双重实时荧光PCR检测方法建立及其在鼠类检测中的应用
目的 建立一种基于TaqMan-MGB探针技术的双重实时荧光PCR检测方法,用于鼠类携带恙虫病东方体和莫氏立克次体的检测工作开展.方法 依据恙虫病东方体56-kDa蛋白基因序列设计恙虫病东方体引物及Taqman-MGB探针,参照文献合成莫氏立克次体引物及Taqman-MGB探针,建立恙虫病东方体及莫氏立克次体双重实时荧光PCR检测方法.结果 利用本文建立的双重实时荧光PCR检测方法对288份鼠肺脏组织样品进行检测,检测结果与普通PCR检测结果一致.结论 本文建立的双重实时荧光PCR检测方法,具有较好的特异性、敏感性及重复性,满足国境口岸鼠类携带恙虫病东方体及莫氏立克次体的监测检测工作需要.
关键词： 双重实时荧光PCR 恙虫病东方体莫氏立克次体检测 -
双重实时荧光PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的建立
目的:建立一种能快速检测金黄色葡萄球菌,同时能快速鉴别是否具有耐甲氧西林基因的双重实时荧光PCR方法.方法:以金黄色葡萄球菌特异NUC基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针,同时针对耐甲氧西林特异MecA基因设计另一对引物和探针;2条探针的5′端标记不同荧光报告基团(FAM和HEX),3′端标记荧光淬灭基团,建立双重实时荧光PCR方法,检测样本中的金黄色葡萄球菌以及鉴别其是否具有耐甲氧西林基因,并对双重实时荧光PCR方法的的特异性和灵敏度进行评价.结果:双重荧光PCR方法可对金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林基因分别进行特异扩增,两者均为阳性时可判为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;金黄色葡萄球菌特异基因特异扩增阳性而耐甲氧西林基因特异扩增阴性可判为甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌;对同种属的表皮葡萄球菌、粪链球菌、藤黄微球菌等病原体均无扩增;双重实时荧光PCR方法的灵敏度低可检测至100个菌体.结论:建立的实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法不仅能实现对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌社区感染和临床感染的监控,同时也可为临床上耐甲氧西林葡萄球菌感染患者的用药提供必要的依据.
关键词： 耐甲氧西林基因金黄色葡萄球菌 双重实时荧光PCR 快速检测 -
双重实时荧光PCR对流感病毒检测及分型方法的研究
目的:建立双重实时荧光PCR方法用于流感病毒检测,实现对新甲型H1N1流感病毒,H1和H3亚型季节性流感病毒,H5和H9亚型禽流感病毒的亚型区分.方法:根据GenBank公布的基因序列,针对M基因保守区设计引物和探针,用于流感病毒检测和定量;针对HA基因设计引物和探针,用于病毒分型.建立和优化双重实时荧光PCR反应体系,进行敏感度和特异性评价,同时对32份已知亚型的流感病毒样本进行检测,验证所建方法的实用性.结果:基于M基因的实时荧光PCR方法定量范围为5×101到5×108个目的拷贝.经优化的双重实时荧光PCR方法对不同亚型流感病毒的检测灵敏度在50～500拷贝之间,各亚型之间没有交叉反应.建立的方法能够检测出本研究涉及的所有流感病毒标本,分型准确率达到96.9％.结论:建立的双重实时荧光PCR方法具有敏感度高,特异性好等优点,实现对流感病毒样本准确分型,适用于流感的鉴别诊断及病毒载量测定.
