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深圳东门市场野生动物SARS病毒的监测
目的对深圳东门市场野生动物标本中SARS病毒进行监测,了解动物携带SARS病毒的情况.方法对2003年5月7日至12月在东门市场采集的果子狸、貉、鼬獾、猪獾和狗獾等5种动物标本,进行病毒分离鉴定及RT-PCR和SARS荧光定量PCR检测.结果5月首先从4份果子狸和1份貉标本中分离到SARS病毒.5月至12月的121份动物标本中共有55份SARS病毒阳性标本,阳性率为45.45%.5月份、10月份、11月份和12月份野生动物标本中SARS阳性率分别为50%、83.33%、34.78%和44.87%,其中,果子狸的SARS病毒携带率为90%.结论东门市场售卖的果子狸可能是携带SARS病毒的重要载体之一,在SARS的传播中可能起着重要的作用.
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改良分子信标-双重实时荧光PCR快速检测SARS病毒
目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒的方法,用于SARS的早期诊断和动物溯源.方法利用改良分子信标技术、装甲RNA和双片段双色荧光技术,根据GenBank公布的SARS病毒聚合酶基因1b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,以部分临床标本的酶联吸附实验结果和传统细胞培养方法作为对照,建立分子信标检测SARS病毒的方法.对368份临床标本(咽漱液、血液、粪便、尿液)、52份细胞培养液和50份动物标本进行荧光PCR扩增.结果分子信标检测SARS病毒的方法灵敏度为10～100个拷贝/ml,与流感病毒等呼吸道病毒无交叉反应.分子信标检测368份临床标本,20份阳性.其中确诊病例阳性率为21.27%(10/47),确诊病例的咽漱液阳性率为43.48%,还分别从粪便和血清中检测到SARS病毒.52份细胞培养液,29份阳性,阳性率为55.77%.50份动物标本,23份阳性,阳性率为46%.结论改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源.
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人用SARS病毒灭活疫苗的研究
[目的]研制出安全、有效、质量可控的人用SARs病毒灭活疫苗.[方法]建立了生产疫苗用的Vero细胞库并进行了检定,分离培养可稳定传代的SARS病毒,对其生物学特性进行了研究;建立了适用于SARS疫苗生产的细胞库和可用于疫苗生产的病毒种子批;优化确定SARS疫苗的灭活工艺和纯化工艺;通过动物实验,对其安全性、有效性进行了研究.[结果]建立了符合SARS病毒灭活疫苗生产使用的细胞库;分离获得了可稳定传代的用于疫苗生产的SARS病毒株;建立了适用于产业化的SARS病毒的灭活工艺和纯化工艺;制备的人用SARS灭活疫苗经小鼠、豚鼠、家兔、恒河猴不同种动物试验,免疫后动物可产生较高SARS病毒中和抗体,可以有效防护SARS病毒对动物的攻击.安全性实验表明,该疫苗未见毒副反应.[结论]试验研制的人用SARS病毒灭活疫苗具有较强的免疫原性,设计的灭活疫苗的生产工艺是可行的,并获得了国家食品药品监督管理局颁发的临床研究批文,待进一步研究后,可望进行规模化生产.
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2种免疫层析技术用于4种传染病及其病原体检测的研究
[目的]寻求能够快速定性/定量检测4种传染病及其病原体的试验方法.[方法]应用双抗体夹心法,建立胶体金免疫层析法、上转磷光(UCP)免疫层析法检测炭疽杆菌芽孢(以下简称炭疽芽孢)、鼠疫杆菌、肠出血性大肠埃希菌O157∶H7(以下简称EHEC O157),评价方法的灵敏性、特异性.通过分别检测模拟掺入3种菌/芽孢的"白色粉末"和检测3种细菌的强毒株,评价在实际环境样品检测中的应用.应用双抗原夹心法,建立胶体金免疫层析法、上转磷光(UCP)免疫层析法检测鼠疫F1抗体、SARS病毒抗体,检测239份青海鼠疫疫区人员血清、1 236份新疆鼠疫疫源地鼠血清,检测18份恢复期SARS病人血清和9份健康对照者血清,以及206份出入境健康人员血清,考核2种检测抗体的方法在实际样品检测中的应用.通过比较炭疽杆菌、鼠疫杆菌、大肠埃希菌O157以及鼠疫杆菌抗体、SARS病毒抗体的胶体金免疫层析方法、UCP免疫层析方法,比较我们建立的2套系统与加拿大RAMP系统检测炭疽杆菌的能力.[结果]UCP免疫层析方法能在35min内完成检测,炭疽芽孢检测掺入"白色粉末"的样品灵敏性为1×104cfu/test,炭疽芽孢低检测限为1×105cfu/ml(原溶液芽孢浓度),多种不同的芽孢菌及其它细菌共38种54株检测说明该法特异性良好,仅与腊样芽孢杆菌有交叉反应,特异性为97%;鼠疫杆菌检测灵敏性为5×104cfu/ml,低检测菌数为5×103cfu/test,在107cfu/ml水平上未发现与30余种细菌有交叉反应,包括近缘假结核耶尔森菌;EHEC O157检测灵敏性为1×103cfu/ml,仅与弗氏枸橼酸杆菌有交叉反应,特异性为98%.胶体金免疫层析方法能在10min内完成检测,炭疽芽孢、鼠疫杆菌、EHEC O157检测灵敏度分别为1×106cfu/ml、1×105cfu/ml、1×105cfu/ml,"白色粉末"等环境样品低可检测敏感性为1×105cfu,1×104cfu,1×104cfu/test.胶体金免疫层析方法分别应用于炭疽、鼠疫强毒株的检测,检测限为5×104cfu/test和7×104cfu/test.在实际血清样品检测中,与间接血凝方法对比,鼠疫抗体UCP和胶体金免疫层析方法有更好的敏感性.血清样品检测显示,SARS抗体的胶体金和UCP免疫层析方法均有较好的特异性和敏感性.[结论]2种免疫层析方法都有快速、敏感、特异的特点:上转磷光免疫层析方法可实现定量检测,敏感性优于胶体金免疫层析法;炭疽检测与加拿大RAMP检测系统相当;胶体金免疫层析法具有简便、直观、易行的特点.2种免疫层析方法均适合于炭疽芽孢芽孢、鼠疫杆菌、EHEC O157、鼠疫杆菌抗体、SARS抗体的现场检测和筛查.
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SARS病毒对温度耐受性的实验研究
为观察SARS病毒在冷藏和自然温度下的稳定性以及灭活SARS病毒的有效温度,将SARS病毒培养的上清液(106TCID50)分装到10 ml离心管中,放置在4℃冰箱、室温(24.5℃)、37℃、56℃和70℃水浴中,间隔一定时间以后取样0.5 ml,接种Vero-E6细胞.结果,SARS病毒在冷藏和室温条件下十分稳定,冷藏(4℃)放置10 d,滴度只下降大约2个log,室温放置5 d,滴度下降大约4个log,仍然保持较高的感染性.加热时SARS病毒的滴度迅速下降,56℃加热30 min、70℃加热15 min检测不出有活病毒.结论,SARS病毒在冷藏和自然温度下十分稳定,加热是灭活SARS病毒简单有效的方法.
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SARS病毒在外界环境物品中生存和抵抗能力的研究
评估SARS病毒离开人体以后在外界环境物品中生存的能力.采用的方法是将滴度为106]TCID#-的SARS病毒BJ-01株涂布在灭菌的不锈钢片、玻璃片、塑料片、滤纸片、棉布片和木片的表面,或混合在灭菌自来水和土壤样品中,经一定时间后洗下病毒,接种Vero-E6细胞,观察细胞病变.结果,SARS病毒在模拟污染的不锈钢片、玻璃片、塑料片上可以存活至少2 d,在模拟污染的棉布片、土壤、滤纸片和木片上至少可存活4～6 h,在污染的自来水中2 d仍然保持较强的感染性.干燥是影响SARS病毒生存时间的重要因素.结论,SARS病毒离开人体以后在外界环境物品中具有较强的生存能力,做好对环境物品的消毒对于切断传播途径十分重要.
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自然发生SARS病例的病毒基因溯源分析
目的 SARS病毒基因分型特别有助于病毒的溯源和控制.方法 对GenBank登记的SARS病毒和SARS样病毒等有关病毒序列进行了分析,以牛冠状病毒,鸟冠状病毒和冠状病毒科的Breda病毒为外组,构建了SARS病毒和SARS样病毒系统进化树,并进行单核苷酸变异分析.结果 发现两次SARS自然流行的病毒可分为两个明显不同的聚类;首次把第二次流行时从人类中分离的SARS病毒和从果子狸等动物中分离的SARS样病毒分为H和P基因型;H/P型的主要依据在病毒的非结构多蛋白基因序列而不是Spike基因序列.结论 两次SARS自然流行的病毒可能以不同的特性感染人类而不是简单的重复.结合流行病学资料,对第二次流行时的SARS病毒进行分子水平的溯源分析,前两例指标患者的病毒和果子狸等动物的SARS样病毒基因序列的直接关系仍不明确.并对SARS病毒的原型、蝙蝠中的冠状病毒牵连等提出了一些新的观点.
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中药注射剂对SARS作用的实验研究
为研究中药注射剂BA和JI对SARS病毒的作用,按照国家食品药品监督管理局制定的细胞模型筛选抗SARS病毒药物试验的技术要求,进行了实验研究.三批试验结果显示,BA对SARS病毒无明显的抑制作用,而JI对SARS病毒有较好的抑制作用,其平均半数抑制浓度为4.4～12.5ul/ml,对SARS病毒抑制率为50%～95.8%,平均治疗指数为5.15.
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中药抗SARS病毒的实验研究
目的:筛选对SARS病毒有效的中药.方法:采取先感染后给药、先给药后感染、感染同时给药3种方法进行试验研究.结果:在6种中药中,有3种药物对SARS病毒有抑制作用.其中,1号药对SARS病毒平均半数有效浓度(IC50)=4.4ul/ml～12.5ul/ml之间;抑制率为50%～95.8%,治疗指数(TI)=5.15.苦甘冲剂IC50=0.49mg/ml,TI=9.12;而889IC50=0.001mg/ml,TI=67(29h).结论:1号药对SARS病毒有一定的抑制作用;苦甘冲剂对SARS病毒有较好的抑制作用;而889有很强的抑制SARS病毒繁殖的作用.
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苦甘冲剂抗SARS病毒实验研究
1 材料细胞:非洲绿猴肾细胞(Vero E6),由军事医学科学院五所引进,本室传代备用.细胞培养液:含10%进口小牛血清,0.29mg L-谷氨酰胺%、100u/ml青链霉素的Eagle's MEM细胞培养液(日本日水制药株式会社出产).细胞维持液:除进口小牛血清含量为2%外,其余成分同细胞培养液.病毒:SARS Virus,来源同Vero E6细胞,本室传代、滴定,置液氮罐中保存.试药:苦甘冲剂,由青岛国风药业股份有限公司提供,批号:030506.用前以三蒸水配成0.25g/ml,隔水煮沸15min灭菌备用.
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防治SARS中药的研究线索
目的:提供从中药中寻找防治SARS的研究线索.方法:根据经验和资料,从中医防治SARS有效的方剂及中药中选出一批有研究前景的药物.结果:提供出可供进一步研究的药物表格以及一批可供SARS病毒筛选的植物类群.结论:本研究表明中药是寻找防治SARS新药的重要源泉之一.
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人源抗严重急性呼吸综合征(SARS)病毒基因工程抗体的初步研究
严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)或称传染性非典型肺炎,已严重威胁人民健康和生命安全.快速研制一种可用于紧急预防SARS病毒感染的基因工程抗体预防制剂迫在眉睫.为此,运用噬菌体表面呈现技术,从多个SARS病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗SARS病毒基因工程抗体文库,并筛选获得37株特异抗SARS病毒基因工程Fab抗体,其中11株人源抗体结合基因工程重组的SARS病毒核(N)蛋白,其中的1株在Western blot分析中与SARS病毒结合,识别SARS病毒N蛋白线性位点.对所获抗体的功能鉴定及基因分析正在进行中.人源抗SARS病毒基因工程抗体的获得,将对SARS疾病的特异性预防,治疗和诊断提供新的途径.
关键词： 严重急性呼吸综合征(SARS) SARS病毒 抗体库 Fab抗体 -
SARS病毒对乳鼠和鸡胚致病性的初步观察
目的建立SARS病毒的动物模型. 方法选用1～5日龄的BALB/c乳鼠和昆明种乳鼠,通过脑内、腹腔和鼻腔3种途径,分别接种自广州和北京地区非典型肺炎病人中分离的SARS病毒BJ01和GZ01株,观察该病毒对不同种系小鼠的致病性.同时,选用8～10日龄鸡胚经尿囊腔接种这2株病毒,观察对鸡胚的致病性. 结果与结论采用SARS病毒BJ01和GZ01株经脑内接种,均可使BALB/c乳鼠和昆明种乳鼠发病或死亡,但这种致病性不规律;而从腹腔和鼻腔途径接种病毒均不能使乳鼠发病.鸡胚对该病毒不敏感.
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北京株和广州株SARS病毒与非典型肺炎患者血清中和抗体反应观察
目的研究北京和广州地区分离的SARS病毒的抗原性关系,为非典型肺炎疫苗候选株的筛选提供依据. 方法采用Reed-Muench法测定BJ01和GZ01株病毒的滴度,分别选取北京和广州地区SARS病人血清各6份,采用固定病毒-稀释血清法进行微量细胞交叉中和试验,测定两地病人血清对BJ01和GZ01株病毒的中和抗体水平及交叉中和能力,分析这两株SARS病毒抗原性的差异. 结果北京和广州两地的非典型肺炎病人血清能够中和本地分离的SARS病毒.两地血清可互相交叉中和BJ01和GZ01株SARS病毒.中和抗体水平相同. 结论北京和广州两地分离的SARS病毒BJ01和GZ01株抗原性相似、差异较小.
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SARS冠状病毒spike基因DNA疫苗的初步研究
目的构建SARS病毒spike基因片段真核表达质粒DNA疫苗;检测spike基因片段的免疫原性;筛选SARS病毒疫苗构建的理想靶抗原. 方法采用RT-PCR从SARS冠状病毒北京01(BJ01)株cDNA获取了spike基因cDNA的全长D12、编码N末端氨基酸的cDNA片段D14和编码C末端氨基酸的cDNA片段D23;构建重组真核表达质粒pcDNA3/D12、pcDNA3/D14、pcDNA3/D23;用3种重组质粒和pcDNA3空质粒载体(对照)DNA皮下注射免疫Wistar大鼠;ELISA检测免疫后大鼠血清S蛋白特异性抗体IgG的产生;同位素51Cr实验检测特异性CTL应答;ELISPOT检测单细胞水平IFN-γ分泌. 结果 pcDNA3/D23疫苗免疫组大鼠血清有S蛋白阳性抗体IgG产生、抗体滴度>1000;脾淋巴细胞可诱导特异的CTL应答和IFN-γ分泌,pcDNA3/D23疫苗组与其它组之间统计分析P<0.05. 结论SARS冠状病毒S蛋白的C末端具有较强的免疫原性,是疫苗构建的理想候选靶抗原,本研究结果为SARS病毒的疫苗研究提供了资料.
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SARS冠状病毒S基因重组DNA诱导的体液免疫反应
目的以严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)密码子优化的S、S1和S2基因分别构建其真核表达质粒,免疫BALB/c小鼠,以初步评价其诱导特异性体液免疫的效果.方法将人工合成密码子优化的S、S1和S2基因克隆入pcDNA4/HisMax-TOPO表达载体,重组质粒转染293T细胞,Western blot和免疫组化检测其真核表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,酶联免疫(ELISA)检测抗S蛋白抗体,伪病毒中和试验、细胞融合抑制试验检测中和抗体.结果 3种重组质粒均可在真核细胞中获得表达,免疫小鼠后可诱导针对S蛋白的特异性抗体,抗体在12周观察期内呈持续上升趋势;其中,仅S和S1蛋白重组质粒能够诱导中和抗体的产生,以S蛋白的效价为高.结论密码子优化S和S1蛋白重组质粒可以有效诱导BALB/c小鼠产生中和抗体,其抗体可能具有阻断SARS-CoV侵袭易感细胞的能力.该结果为进一步研究SARS-CoV DNA疫苗提供了参考依据.
关键词： 严重急性呼吸综合征(SARS) SARS病毒 基因表达 DNA疫苗 体液免疫 -
SARS病毒抗体第一代参考品的研制及初步应用
目的建立严重急性呼吸综合征(SARS)病毒抗体参考品,用于对SARS病毒抗体诊断试剂的实验室评价. 方法收集临床确诊为SARS病人血清和非SARS人群血清,用不同的SARS病毒抗体诊断试剂进行检测筛查,选择不同样品组成参考品.并用该参考品对不同试剂进行初步评价. 结果 SARS病毒IgM抗体的参考品由38份组成,其中包括11份阳性参考品、20份阴性参考品、灵敏度样品6份,精密性样品1份;SARS病毒总抗体(包括IgG)由46份组成,其中包括18份阳性参考品、20份阴性参考品、灵敏度样品7份,精密性样品1份. 结论初步应用结果显示该参考品确实能够反应不同试剂的质量差异.
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原位RT-PCR法测定SARS患者肺组织中的病毒核酸
目的观察严重急性呼吸综合征(SARS)患者肺组织中SARS病毒核酸的定位和分布.方法采用原位逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对3例SARS死亡患者肺组织进行病毒核酸测定.以固定在载玻片上的肺组织为靶细胞,直接掺入地高辛素-dNTP标记物进行PCR扩增,并观察病毒核酸阳性物质.结果检测3例尸解肺组织,其中2例可见SARS病毒核酸阳性信号.阳性物质表现为蓝紫色颗粒状物,分布于细胞核或细胞浆内.在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及单个核细胞中均可观察到该病毒核酸物质.肺组织病理改变明显,表现为出血、渗出,炎性浸润等改变.结论在肺组织中检出SARS病毒核酸物质,并与病理改变并存,为本病的病原学诊断提供直接证据.
关键词： 严重急性呼吸综合征 SARS病毒 原位逆转录-聚合酶链反应 肺组织 -
冠状病毒的特性及其致病性研究进展
冠状病毒在自然界中广泛存在,其自然宿主包括家畜、禽类、鼠类及野生哺乳类动物等,尤其是有飞翔能力的哺乳动物-蝙蝠,是多种冠状病毒的自然储存宿主,也是病毒扩散、传播及致动物或人类疾病流行的传染源.已发现有6种冠状病毒可使人类致病,其中SARS-CoV及MERS-CoV具有高致死率.由于冠状病毒有广泛宿主的特点以及自身基因组的结构特征,使其在进化过程中极易发生基因重组和变异,呈现遗传多样性.新亚型及新的冠状病毒在此过程中不断出现,使该病毒可发生跨种属感染,也对感染的预防与治疗带来较大的困难.本文对冠状病毒的形态结构、分类、基因组与受体的特点、致病性和防治感染的措施等研究文献,作了回顾与论述.
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对SARS患者检验标本处理方法的探讨
医院检验科直接与SARS患者的血液和尿、便、痰等送检标本接触,存在较大的传染性.为避免标本成为另一个传染源,做好自我防护工作十分重要.检验人员要注意做到:
