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贝类水产中副溶血性弧菌菌型分布研究
目的 了解贝类水产中副溶血性弧菌(VP)的菌型构成及其特点.方法 按照GB/T 4789.7标准处理贝类标本,每份VP阳性标本挑取10个克隆,并对其进行血清分型,以PCR法检测tdh、trh、GS-PCR和f237噬菌体的携带情况,并据此对阳性标本中的VP进行菌型区分,分析各菌型在相应标本中的构成.结果 75份贝类水产中18份(24.0％)检出VP,5.6％携带trh阳性VP(O4∶ KUT),未检出tdh阳性菌株.18份VP阳性标本共获得180株VP克隆,共可分为42种菌型.检出3株O3∶K6和1株O1∶K33 GS-PCR阳性菌株,均为非流行株.不同标本中菌型数不完全相同,多可检出9种,平均每份VP阳性标本含6.1种菌型.检出47个(26.1％)克隆株携带f237的orf8完全缺失变种.结论 f237 orf8完全缺失变种噬菌体在贝类中具有广泛的分布.贝类中VP种群构成复杂,常携带多个菌型.临床常见菌型在贝类中不具优势,食品中VP的检测应充分考虑血清分型、基因分型的作用.
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两种核酸检测法在副溶血性弧菌耐热直接溶血素和不耐热溶血毒素中的应用评估
目的 比较CPA-核酸试纸条法与荧光定量PCR法检测副溶血性弧菌(VP)的tlh种特异性基因和tdh毒力基因的灵敏度与特异性.方法 采用CPA-核酸试纸条法和荧光定量PCR法同时对655株不同来源的VP菌株进行tlh、tdh基因检测.结果 CPA-核酸试纸条法与荧光定量PCR法检测结果相同,VP菌株的tlh基因检测阳性率均为100％(655/655).两种方法对tdh基因的检测结果也完全一致,tdh基因临床株与海产品株阳性检测率均分别为95.8％ (207/216)与2.27％ (10/439).CPA-核酸试纸条法对tlh、tdh基因检测具有高度特异性,灵敏度可达6.2×103 cfu/ml菌液,从核酸制备至完成检测快仅需1 h.结论 VP临床株与涉水产品分离株普遍携带tlh种特异性基因,而tdh毒力基因主要存在于临床标本而在涉水产品株极少存在,可采用敏感、特异的CPA-核酸试纸条法,做VP腹泻患者的床边诊断以及食物中毒事故现场的快速检测.
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上海地区副溶血性弧菌大流行菌株血清型及分子特征研究
目的 了解上海地区大流行副溶血性弧菌(VP)大流行菌株血清型分布及分子特征.方法 对2010-2012年分离自腹泻患者和食品中的VP菌株进行血清分型,以GS-PCR辨别大流行株,以PCR检测菌株的毒力基因tdh、trh和大流行株分子标识f237噬菌体orf8基因,以PFGE分型来分析菌株间的遗传关系.结果 1 136株VP可分为52个血清型(群),其中64.5％的菌株GS-PCR阳性,判定为大流行菌株,其血清型有11种,主要集中于O3∶ K6(76.8％)、O4∶ K68(9.4％)、O1∶K25(6.8％)、O1∶ K36(4.5％)4种血清型.相对于非流行菌株,O10∶K60、O3:K3、O1:K33三种血清型的菌株其PFGE图谱与已报道的大流行株更为接近,为新检测到的大流行血清型变种.大流行产毒株中仅能检测到tdh基因,未检测到trh基因,94.3％的大流行菌株携带噬菌体f237的oorf8基因,但有5.7％的大流行株orf8基因缺失.相同血清型的大流行菌株其PFGE图谱存在差异,且orf8基因的携带与否不能以PFGE进行区分.结论 上海地区VP大流行菌株血清型相对集中,且不断有新的血清型变种出现.从PFGE图谱的差异和orf8基因的携带与否上来看,大流行菌株仍在演变.
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基于tdh1基因变异的大流行副溶血性弧菌鉴别方法的建立
目的 基于副溶血性弧菌tdh1 DNA序列中特异性变异位点,建立新的大流行株鉴别方法.方法 通过对多种型别菌株的tdh序列进行比对,查找大流行株特异性变异位点,并基于该位点设计位点特异性PCR体系和检测方法.以GS-PCR和tdh基因联合检测为参照方法,用已知大流行株、非大流行株和2014年收集的1 067株副溶血性弧菌对新方法进行验证.结果 3株菌株的6条tdh全序列存在26个多态性位点,其中tdh1基因的第368位碱基的变异[G/A]能用于鉴别大流行株,本研究基于此位点建立了tdh1_368位点特异性PCR.该变异能将1996年后的大流行O3∶K6型菌株与1996前的进行区分,也能将大流行株其他血清型变种与非流行菌株进行区分.对2014年的1067株菌株的检测结果显示,tdh1_368位点特异性PCR与参考方法检测结果完全一致.结论 本研究以副溶血性弧菌tdh基因的多态性位点建立检测大流行菌型的试验方法,从对1067株菌株的实测结果来看,tdh1_368位点特异性PCR与既往报道的方法具有高度的一致性,且指标更为直接.
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北京市水产品污染与感染病例中副溶血性弧菌血清型和毒力基因型的比较研究
目的 对北京市夏季市售水产品污染与感染病例中副溶血性弧菌血清型和毒力基因型进行比较研究,为评估食品安全风险监测的目的与意义提供思路,为北京市水产品副溶血性弧菌污染与临床感染病例的关联性研究提供技术支持.方法 对采集的水产品样品和哨点医院腹泻患者粪便样本进行副溶血性弧菌的分离鉴定,采用血清玻片凝集法对分离出的副溶血性弧菌进行血清分型,PCR方法检测菌株的tlh、tdh、trh基因.结果 2014年7～9月共采集水产品样品164份,检出副溶血性弧菌80份,总污染率为48.78％;其中淡水产品污染率为38.78％(19/49),平均菌量浓度为66.63 MPN/g;海水产品污染率为53.04％ (61/115),平均菌量浓度为38.14 MPN/g.80株副溶血性弧菌分属于9个血清群,其中O2群28株,占35.00％,O1群11株,占13.75％,O5群10株,占12.50％.80株菌tlh基因均为阳性,只有1株菌携带tdh毒力基因,所有菌株trh毒力基因均为阴性.哨点医院腹泻病人粪便样本中分离鉴定副溶血性弧菌21株,血清型O3∶ K6占61.90％(13/21),O4:K8占28.57％ (6/21);毒力基因型tdh(+) /trh(-)占95.24％ (20/21),tdh(-)/trh(-)占4.76％(1/21).结论 来源于食品样品的副溶血性弧菌绝大部分不具备致病性,而导致消费者腹泻的副溶血性弧菌绝大部分携带致病性毒力基因,表明目前的食品安全风险监测结果不能作为评估副溶血弧菌导致的食源性疾病暴发和散发的依据.
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副溶血性弧菌及其引起的食物中毒检验研究进展
在沿海地区,副溶血性弧菌是引起食物中毒的重要病原菌.近年来,由副溶血性弧菌与其它细菌混合感染引起食物中毒屡见报道,主要是生食或加热不彻底的熟食.1995年以前检出频率高的副溶血性弧菌血清型为O4:K8,1996年以后由产生耐热的直接溶血毒素(TDH)的O3:K6取而代之.用于副溶血性弧菌的快速检验法有噬菌体裂解法、PCR法、PFGE法.采用免疫磁株法可有效地收集、浓缩神奈川现象阳性的副溶血性弧菌,可显著提高环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率.
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2014年上海市嘉定区副溶血性弧菌分子流行病学分析
目的 了解上海市嘉定区副溶血性弧菌腹泻患者和食品分离株的血清型、毒力基因和分子分型特征及其流行状况.方法 对2014年分离自腹泻患者和食品的菌株进行血清分型,以PCR检测菌株的毒力基因tdh和trh及大流行株分子标识GS-PCR和orf8基因,通过PFGE分型分析菌株间的遗传关系.结果 嘉定区副溶血性弧菌导致的腹泻病例主要集中在5～10月份,高峰出现在8月份,患者年龄分布呈双峰现象,女性感染者中检出弱产毒或不产毒菌株的比例高于男性.腹泻患者分离株中居前7位的血清型分别为O3:K6、O4:K9、O4:K8、O4:K68、O4:K12、O1:KUT、O3:KUT,产毒株占92.3％,流行株占61.9％,主要以O3:K6为主,orf8基因阴性流行株约占流行株的20.1％.323株副溶血性弧菌分为121个PFGE型,大流行株之间遗传距离更为接近,均处于同一聚类单元;非流行株构成复杂,形成以O4:K8、O4:K9、O4:K12、O3:K29(O3:KUT)为中心的4个聚类单元,且与大流行株距离较远,非流行株之间在PFGE条带上差异也较大.食品分离株均为非产毒株,未发现患者分离株和食品分离株具有相同的PFGE型,且未见形成明显的PFGE聚类单元.结论 副溶血性弧菌是嘉定区重要的腹泻病原,其感染控制应以大流行株和产毒株为主,食品监测应充分考虑副溶血性弧菌在病例中的分布情况.
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2005～2011年厦门市食物中毒副溶血性弧菌的病原特征分析
目的分 析2005～2011年25起食物中毒标本中分离的108株副溶血性弧菌的血清型分布、tdh基因携带情况和PFGE分型特征.方法 血清学实验检测菌株的血清型别;实时荧光PCR法检测耐热直接溶血素(tdh)基因;脉冲场凝胶电泳(PFGE)和BioNumerics软件对菌株进行分子分型分析.结果 108株菌分为7个血清群、15个血清型,主要血清型是03∶K6;所有菌株分成65个PFGE types (PT),相似度为34.1％～100.0％;92株菌携带tdh基因,阳性率为85.2％.结论 引起厦门市食物中毒的副溶血性弧菌血清型分布呈多样性,优势血清型为03∶K6,且大部分菌株具有tdh基因;同一克隆的菌株血清型可相同也可不同.
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副溶血性弧菌食物中毒及腹泻菌株Ⅲ型分泌系统的检测及分析
目的 了解副溶血性弧菌食物中毒和临床腹泻株Ⅲ型分泌系统的分布以及耐药特征.方法 对食物中毒和临床腹泻分离到的共21株副溶血性弧菌进行毒力基因tdh、trh、T3SS1、T3SS2α、T3SS2β和toxR检测,并用VITEK 2 compact全自动微生物鉴定系统进行了耐药性分析.结果 21株菌株中tdh +/trh-占90.48％(19/21),tdh-/trh+和tdh-/trh-分别占4.76％、4.76％,未检测到tdh +/trh+菌株.T3SS1广泛存在于所有菌株中.T3SS2α存在于tdh +/trh-菌株,T3SS2β存在于tdh-/trh+菌株.1株食物中毒菌株毒力基因携带情况为tdh-/trh-/T3 SS2d-/T3SS2B-.21株副溶血性弧菌对阿莫西林、头孢吡肟、抗菌素B、庆大霉素、环丙沙星和复方新诺明敏感,对氨苄西林完全耐药.结论 食物中毒和临床腹泻分离到的菌株大多携带tdh基因,T3SS2α与tdh相关,而T3SS2β则存在于trh+菌株.未携带tdh和trh基因的食物中毒分离株表明副溶血性弧菌不仅仅依赖TDH和TRH发挥毒力作用,其致病机制具有多样性和复杂性.
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2013-2015年杭州地区急性腹泻患者来源副溶血弧菌毒力基因及耐药性调查
目的 对2013-2015年杭州地区腹泻患者副溶血弧菌(Vibrio parahaemol yticus)毒力基因的携带和耐药进行调查研究.方法 可疑菌株用全自动细菌鉴定仪(VITEK2 Compact,生物梅里埃,法国)进行鉴定,用PCR方法检测其8种毒力基因,用纸片扩散法检测13种抗生素的敏感性.结果 120株副溶血弧菌中,tdh+或trh+的致病菌株占95.0％(114株),tdh-且trh-的非致病株占5.0％(6株).所有120株副溶血弧菌均含有T3SS1基因,T3SS2α基因主要存在于tdh+/trh的菌株中,T3SS2p存在于trh+的菌株中,2株tdh-的菌株首次检出T3SS2a基因.本研究中大流行菌株占64.2％(77株),非大流行菌株占35.8％(43株).多达65.8％的副溶血弧菌对氨苄西林耐药,而90.0％以上的副溶血弧菌对其他抗生素包括喹诺酮类、第三代头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类和磺胺类抗菌药物较敏感.结论 杭州地区腹泻来源的副溶血弧菌多为大流行菌株,对常见抗菌药物敏感性高,但耐药率有所上升,要加强监测并引起临床重视.
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2012年上海地区副溶血性弧菌血清分型和毒力基因携带状况研究
为了解2012年上海地区副溶血性弧菌人源株和食源株的优势血清型及其毒力基因携带状况，本研究收集了2012年从上海市15个区（县）腹泻患者和食品监测中分离的副溶血性弧菌株，进行血清分型，并采用聚合酶链反应（PCR）检测 tdh和trh基因。结果显示，854株副溶血性弧菌中，88．1％为血清可分型，89．8％为产毒株。O3∶K6、O4∶K8、O1∶K25、O4∶K68、O4∶K9、O1∶K36、O3∶K29为上海地区可分型人源株的优势血清型（93．8％），其中O3∶K6多，达56．2％。副溶血性弧菌全部分离株的月份分布显示出聚集趋势，7～8月为高峰期。O4∶K9和O1∶K36血清型菌株的月份分布与其他优势血清型菌株不同，未表现出明显聚集趋势。食源株无明显优势血清型，且与人源株分布不同。人源株产毒株构成（95．6％）高于食源株（5．5％）。人源株优势血清型产毒株构成（99．9％）高于非优势血清型（71．1％）。血清可分型人源株的 tdh携带率（97．5％）高于不可分型人源株（67．6％），血清可分型人源株的 trh携带率（0．8％）低于不可分型人源株（42．6％）。结果提示，副溶血性弧菌血清型分布与历史数据相比变化较大，血清型与毒力基因携带呈一定程度关联，且人源株与食源株在血清型和毒力基因携带上具有分离现象。因此，在副溶血性弧菌的监测与检测中应充分考虑血清分型和毒力基因的重要性。
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基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌
目的 建立海产品中副溶血弧菌检测的双重荧光定量PCR体系.方法 针对副溶血弧菌种特异性基因tlh和tdh设计引物和TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血弧菌.结果 副溶血弧菌可得到特异性扩增,而其它与副溶血弧菌共存于海产品中的细菌均未见扩增曲线.副溶血弧菌与其它细菌的混合DNA检测表明,其它细菌基因组的存在时并不干扰副溶血弧菌检测.副溶血弧菌典型菌株FJ14和BJ97的敏感性试验显示,该体系的低检测DNA浓度分别为49.8pg与77.8pg,低检测细菌浓度为56CFU/mL和371CFU/mL.对舟山菜市场采集的50份样本检测表明,32份为tlh基因阳性,3份为tdh基因阳性,与传统方法的检测结果相同.结论 与传统检测方法相比,副溶血弧菌的双重荧光定量PCR检测方法快速准确,结果直观.
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食品中副溶血性弧菌毒力基因的特征研究
目的 了解深圳市食品中副溶血性弧菌的毒力基因特征状况.方法 从2010年-2012年食品等外环境分离到420株副溶血性弧菌,用荧光PCR技术检测食品中分离的420株副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、耐热直接溶血素相关溶血素基因(trh)和不耐热直接溶血素基因(tlh).结果 420株副溶血性弧菌中,检出基因trh阳性4株,阳性率为0.95％；基因tlh阳性420株,阳性率为100％;未检出基因tdh的菌株.结论 在食品外环境中深圳市尚未发现携带基因tdh副溶血性弧菌；携带基因trh副溶血性弧菌阳性率低；所有被检测副溶血弧菌均携带基因tlh；外环境中的副溶血性弧菌携带毒力基因差异较大.
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一起由副溶血弧菌引起的食物中毒的实验室检测
目的:对一起可疑食物中毒的病原菌相关实验室检测.方法:参照GB/T7489、WS/T.9-1996对食物中毒患者肛拭子进行致病菌检测,并对分离的可疑致病菌进行毒力基因检测、随机扩增多态性分析(RAPD)和药敏试验.结果:11份患者肛拭标本中,8份(占72.7%)分离出副溶血弧菌,血清分型均为03:K6;毒力基因检测为tdh阳性,trh阴性;RAPD结果显示,8株副溶血弧菌具有相似的RAPD图谱.结论:结合流行病学资料、可疑致病菌检测、毒力基因检测及随机扩增多态性分析结果,证实该起食物中毒是由副溶血弧菌引起,致病毒素主要为tdh编码的TDH.
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改良分子信标—实时PCR快速检测副溶血弧菌
目的:建立改良分子信标-实时PCR检测副溶血弧菌的快速方法,应用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验.方法:根据GenBank公布副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,设计一对引物和改良分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5′,并进行特异性和灵敏度分析;同时以11种细菌作对照,建立改良分子信标检测副溶血弧菌的实时PCR反应体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测.结果:检测1 2种细菌,只有副溶血弧菌有荧光信号,与其他细菌无交叉反应,DNA灵敏度为1 66.6 fg/μl,菌液灵敏度为69 cfu/ml或6 cfu/PCCR反应体系.改良分子信标-实时PCR反应体系检测40株副溶血弧菌均出现特异的荧光信号,无干扰.对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性.检测时间仅需2 h.结论:改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.
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多重PCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究
建立快速检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的多重PCR(MPCR)方法.针对古典型霍乱弧菌(CVC)和埃尔托型霍乱弧菌(EVC)的共有序列霍乱肠毒素基因(ctxB)、CVC的毒力协调A亚单位基因(C-tcpA)、EVC的毒力协调A亚单位基因(E-tcpA)、副溶血性弧菌的热稳定性直接溶血素基因(tdh)为靶序列设计引物,建立多重PCR检测方法,相应扩增片段依次为564bp、617bp、471bp和202bp.用该方法检测EVC、CVC、副溶血性弧菌、非O1群霍乱弧菌、沙门氏菌等35株菌株表现出极好的特异性,对人工污染的罗非鱼、小虾、牡蛎、鱼鳃和鱼肠混合物的检出限EVC为2.2 cfu/mL、CVC为2.8 cfu/mL、副溶血性弧菌为6.5 cfu/mL,扩增片段表现出极好的特异性,整个实验过程8～10h完成.实验结果表明该方法是特异性强、省时、省力的检测方法.
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副溶血性弧菌食物中毒及腹泻菌株Ⅲ型分泌系统的检测及分析
目的:检测及分析副溶血性弧菌食物中毒及腹泻菌株Ⅲ型分泌系统.方法:对食物中毒和临床腹泻分离到的共21株副溶血性弧菌进行毒力基因tdh、trh、T3SS1、T3SS2α、T3SS2β和toxR检测,并用VITEK 2 compact全自动微生物鉴定系统进行了耐药性分析.结果:21株菌株中tdh+/trh-占90.48％(19/21),tdh-/trh+和tdh-/trh-分别占4.76％、4.76％,未检测到tdh+/trh+菌株.T3SS1广泛存在于所有菌株中.T3SS2α存在tdh+/trh-菌株,T3SS2β存在于tdh-/trh+菌株.1株食物中毒菌株毒力基因携带情况tdh-/trh-/T3SS2-/T3SS2β-.21株副溶血性弧菌对阿莫西林、头孢吡肟、抗菌素B、庆大霉素、环丙沙星和复方新诺明敏感,对氨苄西林完全耐药.结论:食物中毒和临床腹泻分离到的菌株大多携带tdh基因,T3SS2α与tdh相关,而T3SS2β则存在于trh+菌株.未携带tdh和trh基因的食物中毒分离株表明副溶血性弧菌不仅仅依赖tdh和trh发挥毒力作用,其致病机制具有多样性和复杂性.
