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大肠杆菌O157∶H7呼吸系统调控蛋白FNR对三型分泌系统调控的研究
目的 了解大肠杆菌O157∶H7 FNR(fumarate nitrate reduction,富马酸硝酸盐还原)对三型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)表达的影响.方法 本研究采用λRed重组技术,利用PCR产物,通过Bet(a ssDNA annealing protein,ssDNA退火蛋白)和Exo(a5'→3'dsDNA exonuclease,5 '→3' dsDNA外切酶)蛋白促进同位交换的方法,成功构建了fnr突变株.结果 虽然细胞黏附结果显示,与野生株相比,缺失株的黏附力并没有明显下降.但是T3SS的蛋白图谱显示fnr突变株中蛋白分泌量有明显下降.结论 推测可能是fnr基因敲除后导致高浓度的ClpXP(caseinolytic protease X&P,酪蛋白水解酶X&P)引起GrlA(global regulator of LEE activator)蛋白的降解,从而导致LEE(locus of enterocyte effacement)表达的下降,造成T3SS蛋白分泌量的下降.
关键词： 大肠杆菌O157∶H7 FNR T3SS -
肠出血性大肠杆菌O157∶H7Ⅲ型分泌系统效应蛋白NleF基因敲除菌株的构建及其生物学功能初探
目的：构建肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7 T3SS效应蛋白NleF敲除菌株和回复菌株，研究其对细菌生长和细胞死亡的影响。方法利用λ-Red同源重组的方法构建nleF基因敲除菌株ΔnleF；将pET-24a（＋）-NleF重组质粒导入敲除菌感受态细胞中构建回复菌株ΔnleF／NleF。将野生株、敲除株和回复株分别用LB和DMEM（10％FBS）培养，每隔1 h测定D600，绘制生长曲线；分别用3种菌株感染HeLa细胞，用细胞毒性试剂盒检测上清中乳酸脱氢酶（ LDH）的释放量，计算细胞毒性。结果成功构建NleF敲除菌株ΔnleF和回复菌株ΔnleF／NleF；野生株、敲除株和回复株三者的生长速率无明显差异；与野生株相比，ΔnleF感染HeLa细胞后，细胞毒性增加，ΔnleF／NleF感染后HeLa细胞毒性与野生株相当。结论 EHEC O157∶H7 T3SS 效应蛋白NleF对细菌的生长无明显影响，但可能抑制由细菌感染引起的宿主细胞死亡。
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鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统相关蛋白β-内酰胺酶报告系统的建立
目的 构建鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)Ⅲ型分泌系统(T3SS)相关蛋白β-内酰胺酶(TEM-1 β-lactamases,Bla)报告基因载体,旨在运用本系统检测鼠疫菌待测蛋白能否转运至宿主细胞内.方法 将TEM基因克隆入pA-CYC184载体中,构建用于鼠疫茵研究的TEM报告基因载体.把待分析的鼠疫菌基因及启动子区克隆入TEM基因上游,使鼠疫菌蛋白与TEM蛋白融合表达.将鼠疫菌基因-TEM融合表达载体电转化到鼠疫菌中,并感染HeLa细胞2h后,加入CCF2-AM底物,在激光共聚焦显微镜下观察结果.结果与结论 应用本系统检测了YopK-Bla、YscK-Bla、YscL-Bla和YscX-Bla进入宿主细胞的情况,YopK-Bla和YscX-Bla菌株感染的HeLa细胞呈蓝色,YscK-Bla和YscL-Bla菌株感染的HeLa细胞呈绿色,表明YopK及YscX可以进入宿主细胞,而YscK和YscL则不能.本研究成功地构建了适于鼠疫菌的TEM报告基因系统,该系统可作为分析其他鼠疫菌蛋白能否在感染的过程中进入宿主细胞的工具,为鼠疫菌T3SS相关蛋白致病机制研究奠定了基础.
关键词： 鼠疫耶尔森菌 T3SS β-内酰胺酶报告基因 质粒 聚合酶链反应 -
副溶血性弧菌食物中毒及腹泻菌株Ⅲ型分泌系统的检测及分析
目的 了解副溶血性弧菌食物中毒和临床腹泻株Ⅲ型分泌系统的分布以及耐药特征.方法 对食物中毒和临床腹泻分离到的共21株副溶血性弧菌进行毒力基因tdh、trh、T3SS1、T3SS2α、T3SS2β和toxR检测,并用VITEK 2 compact全自动微生物鉴定系统进行了耐药性分析.结果 21株菌株中tdh +/trh-占90.48％(19/21),tdh-/trh+和tdh-/trh-分别占4.76％、4.76％,未检测到tdh +/trh+菌株.T3SS1广泛存在于所有菌株中.T3SS2α存在于tdh +/trh-菌株,T3SS2β存在于tdh-/trh+菌株.1株食物中毒菌株毒力基因携带情况为tdh-/trh-/T3 SS2d-/T3SS2B-.21株副溶血性弧菌对阿莫西林、头孢吡肟、抗菌素B、庆大霉素、环丙沙星和复方新诺明敏感,对氨苄西林完全耐药.结论 食物中毒和临床腹泻分离到的菌株大多携带tdh基因,T3SS2α与tdh相关,而T3SS2β则存在于trh+菌株.未携带tdh和trh基因的食物中毒分离株表明副溶血性弧菌不仅仅依赖TDH和TRH发挥毒力作用,其致病机制具有多样性和复杂性.
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2013-2015年杭州地区急性腹泻患者来源副溶血弧菌毒力基因及耐药性调查
目的 对2013-2015年杭州地区腹泻患者副溶血弧菌(Vibrio parahaemol yticus)毒力基因的携带和耐药进行调查研究.方法 可疑菌株用全自动细菌鉴定仪(VITEK2 Compact,生物梅里埃,法国)进行鉴定,用PCR方法检测其8种毒力基因,用纸片扩散法检测13种抗生素的敏感性.结果 120株副溶血弧菌中,tdh+或trh+的致病菌株占95.0％(114株),tdh-且trh-的非致病株占5.0％(6株).所有120株副溶血弧菌均含有T3SS1基因,T3SS2α基因主要存在于tdh+/trh的菌株中,T3SS2p存在于trh+的菌株中,2株tdh-的菌株首次检出T3SS2a基因.本研究中大流行菌株占64.2％(77株),非大流行菌株占35.8％(43株).多达65.8％的副溶血弧菌对氨苄西林耐药,而90.0％以上的副溶血弧菌对其他抗生素包括喹诺酮类、第三代头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类和磺胺类抗菌药物较敏感.结论 杭州地区腹泻来源的副溶血弧菌多为大流行菌株,对常见抗菌药物敏感性高,但耐药率有所上升,要加强监测并引起临床重视.
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铜绿假单胞菌中T3SS毒力基因分布、表达及与抗菌药物耐药相关性研究
目的 探究临床分离铜绿假单胞菌中T3SS毒力基因分布、表达及与耐药的相关性.方法 收集2015年温州医科大学附属第一医院分离的铜绿假单胞菌共68株.琼脂稀释法检测抗菌药物的敏感性;PCR法检测不同来源菌株exoU、eroS、exoT、exoY4种毒力基因的分布,并对结果进行统计学分析;实时荧光定量PCR检测部分菌株中转录调控相关基因ptrA、exsA以及效应蛋白基因exoT、exoS的表达情况,并对4种基因的相对表达量进行Pearson相关性分析.结果 68株铜绿假单胞菌中,exoT和exoY检出率较高,分别为79.4％和75.0％,其中exoT在创面来源菌株中的检出率高于痰液(97.0％ vs 61.8％,P＜0.01),且以exoU-/exoS+基因型常见,占51.5％ (35/68).痰液来源的菌株对亚胺培南、美罗培南的耐药率显著高于创面来源菌株(47.1％ vs 8.8％,47.1％vs 14.7％,P＜0.01);携带exoU基因的菌株对碳青霉烯类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物耐药率均高于其他3种基因型菌株.Pearson相关性分析显示ptrA基因表达量与exoT、exoS、exsA基因表达水平均呈负相关(P＜0.05).结论 本院临床分离的铜绿假单胞菌T3SS毒力基因exoT和exoY的携带率较高,毒力基因与铜绿假单胞菌耐药性相关,ptrA可能是T3SS毒力基因表达的潜在负调控基因.
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EFFECTORSEARCH:病原菌基因组中三型分泌系统效应蛋白的预测
病原菌为了生存和侵入寄主细胞,经过漫长的进化形成了多种可介导大分子转运的分子机制,细菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)是其中重要的一种.T3SS又被称为“细菌注射器”,病原菌利用此系统可以将效应蛋白注射到靶细胞中.近年来发现,T3SS不仅存在于在人类、动物、甚至植物的多种致病菌中,在其它环境下的细菌中也存在.本文介绍了一种新的生物信息学预测工具(EFFECTORSEARCH),可用于在微生物基因组中预测T3SS的基因,并且在本文中着重介绍了其在丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)基因组中T3SS基因的预测结果.
关键词： Effectorsearch 病原菌基因组 T3SS 预测 -
沙门氏菌毒力岛及Ⅲ型分泌系统研究进展
沙门氏菌(Salmonella)是寄生于人和动物肠道内的革兰氏阴性杆菌,能引起人和动物多种不同临床症状表现,为人类食物中毒主要病原菌之一.沙门氏菌的侵袭力与毒力岛(pathogenicity island,PI)及其编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)直接相关.本文对沙门氏菌毒力岛、T3SS组成、T3SS分泌及调控机制、T3SS与沙门氏菌致病性、应用研究等进行综述,以期为深入研究提供参考.
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志贺菌致病的分子机制
志贺菌是肠道内致病菌,无鞭毛不能运动,侵袭过程依靠T3SS分泌的效应分子.本文就志贺菌T3SS、参与侵袭过程的效应分子以及相应的致病机制作一综述.
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副溶血性弧菌食物中毒及腹泻菌株Ⅲ型分泌系统的检测及分析
目的:检测及分析副溶血性弧菌食物中毒及腹泻菌株Ⅲ型分泌系统.方法:对食物中毒和临床腹泻分离到的共21株副溶血性弧菌进行毒力基因tdh、trh、T3SS1、T3SS2α、T3SS2β和toxR检测,并用VITEK 2 compact全自动微生物鉴定系统进行了耐药性分析.结果:21株菌株中tdh+/trh-占90.48％(19/21),tdh-/trh+和tdh-/trh-分别占4.76％、4.76％,未检测到tdh+/trh+菌株.T3SS1广泛存在于所有菌株中.T3SS2α存在tdh+/trh-菌株,T3SS2β存在于tdh-/trh+菌株.1株食物中毒菌株毒力基因携带情况tdh-/trh-/T3SS2-/T3SS2β-.21株副溶血性弧菌对阿莫西林、头孢吡肟、抗菌素B、庆大霉素、环丙沙星和复方新诺明敏感,对氨苄西林完全耐药.结论:食物中毒和临床腹泻分离到的菌株大多携带tdh基因,T3SS2α与tdh相关,而T3SS2β则存在于trh+菌株.未携带tdh和trh基因的食物中毒分离株表明副溶血性弧菌不仅仅依赖tdh和trh发挥毒力作用,其致病机制具有多样性和复杂性.
