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四种人冠状病毒核衣壳蛋白的交叉反应特征
目的 了解人常见冠状病毒NL63、229E、OC43和HKU1核衣壳蛋白(N蛋白)之间的抗原交叉反应特征.方法 对人冠状病毒NL63、229E、OC43和HKU1的N蛋白用大肠杆菌进行表达和纯化,用竞争ELISA方法对已知的人阳性血清进行交叉反应分析.结果 同属内NL663和229E之间及OC43和HKU1 N蛋白之间存在抗原交叉反应.结论 人常见冠状N蛋白抗原交叉反应特征为以后基于人冠状病毒N蛋白的血清学研究和免疫学诊断试剂研发提供了重要的实验依据.
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广州市新发4例SARS患者SARS-CoV核衣壳蛋白和抗体变化规律
研究证明严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(CoV)的核衣壳蛋白(N)比较保守,具较强的免疫原性,在感染细胞中可大量的表达.作为病毒感染的靶标志物,检测N蛋白可能成为早期诊断的一种有用的方法.我们通过研究2003年12月至2004年1月在广州市新发4例SARS患者血液中的N蛋白和抗体的变化规律,探讨循环N蛋白在SARS早期诊断中的价值.
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酶联免疫吸附试验间接抗体夹心检测SARS-CoV抗原方法的建立和应用
目的制备和鉴定严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(mAb)和多克隆抗体建立SARS-CoV N抗原捕获抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)方法用于SARS-CoV感染的早期诊断.方法用基因重组SARS-CoV N蛋白免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔制备mAb和多克隆抗体,采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定,用单克隆抗体与兔多克隆抗体进行配对试验,建立抗原捕获抗体夹心ELISA法测定SARS-CoV N抗原.结果获得9株特异性针对SARS-CoV N蛋白的mAb和高效价的兔多克隆抗体,通过高亲和力的mAb与兔多抗的配对试验,筛选出3株单抗N1E8、N8E1和N10E4混合作为捕获抗体,与兔多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG组合作为测定抗体,建立了抗体夹心ELISA法,测定重组SARS-CoV N蛋白高灵敏度为50 pg/ml,特异性达99.86%,测定420份血清学确诊的SARS患者血清,其中发病1-10天阳性检出率为90.1%,11-20天检出率为23%,21天以上均为阴性,与其他呼吸道病毒和冠状病毒无交叉反应.结论获得特异性好、亲和力高的单克隆抗体和高效价的兔多克隆抗体,经过抗体的配对和优化,建立了一种灵敏度高、特异性强的SARS-CoV抗原的ELISA捕捉法,可应用于SARS早期诊断、溯源及流行病学研究.
关键词： 严重急性呼吸综合征冠状病毒 核衣壳蛋白 单克隆抗体 -
发热伴血小板减少综合征病毒感染人源巨噬细胞形成包涵体结构
发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)是在我国首次发现的布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新型病毒,是新发传染病发热伴血小板减少综合征的致病病原.本研究通过免疫荧光共聚焦实验观察不同感染剂量和不同感染时相SFTSV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)在THP-1细胞内的动态定位特点,并应用电镜方法在超微结构水平观察不同感染时相THP-1细胞的胞内形态结构特征,发现SFTSV感染THP-1在胞内形成包涵体结构.研究进一步显示感染后的第3天核衣壳蛋白NP所形成包涵体的形态大小与感染后第7天培养上清中的病毒载量之间存在相关.本研究揭示SFTSV感染人源巨噬细胞THP-1形成的包涵体结构可能是SFTSV利用宿主细胞形成的特殊胞内结构以利于大量合成和产生新的病毒颗粒.
关键词： 发热伴血小板减少综合征病毒 巨噬细胞 包涵体 核衣壳蛋白 -
SARS冠状病毒核衣壳(N)蛋白不同区域的原核表达
利用大肠杆菌表达系统对SARS冠状病毒的核衣壳(N)蛋白全长及N末端或/和C末端缺失突变体进行了表达,共表达了39个重组蛋白,表达量在15%～30%之间.分别利用电洗脱或金属鳌合介质纯化重组蛋白,用蛋白印迹实验检测纯化蛋白对SARS病人恢复期血清的反应性,结果发现全长N蛋白活性好,其余的末端缺失蛋白均无法达到同一活性水平.由此说明N蛋白的完整性对于其优势表位的充分暴露是必要的.
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我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析
首次对我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的核农壳蛋白(N)基因和基因组启动子(GP)区进行序列测定和分子生物学特征分析.首先应用逆转录聚合酶链式反应从发病山羊病料中扩增出小反刍兽疫病毒N基因片段,用cDNA 3'末端快速扩增方法获得基因组启动子区片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,绘制系统发生树.我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的N基因由1 689个核苷酸组成,编码525个氨基酸,与India/Jhansi/03等6个已知N基因全序列的PPRV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.7%～97.6%和94.9%～98.5%.小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30N蛋白与磷蛋白作用的结构序列之一为495LFRLQAM501保守序列,N蛋白281-289位氨基酸含有一个T细胞表位,为281YPALGLHEF289保守序列.小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的GF区由107个核苷酸组成,与Tur-key 2000等5株其他PPRV毒株同源性为91.8%～98.2%.N基因核苷酸序列和相应的氨基酸序列系统进化分析表明小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30与亚洲国家分离株关系近.
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HCoV-NL63N蛋白不同片段的表达纯化及血清学检测应用分析
将HCoV-NL63核衣壳蛋白N端(Np 1～154aa)、C端(Cp 141～306aa)基因片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上进行原核表达,制备相应的纯化蛋白Np、Cp蛋白,利用Np、Cp蛋白建立基于Western-Blot条带印迹的HCoV-NL63抗体检测法,并与基于全长N蛋白(Nf)的HCoV-NL63抗体检测法相平行筛查了50份成年体检血清.结果显示:50份成年体检血清中,采用Nf、Np、Cp分别检出25、27、36份HCoV-NL63抗体阳性血清,检出率分别为50%、54%、72%.不同N蛋白与血清反应抗体阳性谱存在差异,其中Np与Nf检出一致率为64%,Cp与Nf检出一致率为54%,而Np与Cp检出一致率为54%.本研究表明人冠状病毒NL63在我国人群中感染常见,N蛋白C端(Cp)检出率比全长N(Nf)及N端(Np)要高,Nf、Np、Cp在抗体检测上存在不一致性.这为HCoV-NL63血清学试剂研发及免疫学研究提供了依据与实验基础.
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鸭肠炎病毒核衣壳蛋白受体的筛选与鉴定
为进一步阐明鸭肠炎病毒(DEV)致病机理,本研究通过构建DEV感染鸭肝组织cDNA文库及其文库质粒和DEV核衣壳蛋白(NP)基因“诱饵”质粒,利用酵母双杂交系统筛选DEV NP互作蛋白(受体)基因,并采用GSTpull-down试验进行验证,结果显示:所构建鸭肝组织cDNA文库的库容量为1×106CFU,插入片段大小集中在0.5～1kb；“诱饵”质粒pGBKT7-NP无自激活现象；筛选并初步证实DEV NP在鸭肝组织细胞的受体蛋白为蛋白激酶C抑制蛋白(PKCI).这些结果为进一步研究DEV致病机理提供新的线索.
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九种冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及纯化
目的 探索SARS冠状病毒(SARS-CoV)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等5种人类冠状病毒以及牛冠状病毒(BCoV)、鼠肝炎病毒(MHV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)和禽传染性支气管炎病毒(IBV)4种动物冠状病毒核衣壳(N)蛋白在大肠杆菌中克隆表达及纯化条件.方法 利用原核表达载体pET30a(+)经IPTG诱导表达重组蛋白,并采用离子交换及镍离子螫合亲和层析法对重组蛋白进行纯化,用SDS-PAGE及Westernblot对重组蛋白进行鉴定.结果 成功表达、纯化出9种冠状病毒N蛋白,纯度达90%以上.结论 在原核系统中表达得到了高纯度的9种冠状病毒N蛋白,为相关功能性研究奠定了基础.
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汉坦病毒感染乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞
目的 建立汉坦病毒(HTNV)76-118株或汉城病毒(SEOV) L99株感染乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养体系,并检测其对汉坦病毒的易感性.方法 通过免疫荧光显微技术、免疫印迹法、反转录聚合酶链反应检测星形胶质细胞对汉坦病毒的易感性,并通过反转录聚合酶链反应检测病毒S片段和GFAP基因表达情况.结果 HTNV或SEOV感染星形胶质细胞后病毒核衣壳蛋白(NP)和GFAP的表达增加,且GFAP和NP共定位,两者可能相互作用,同时病毒S片段和GFAP基因表达增加.结论 HTNV或SEOV能有效感染和激活星形胶质细胞,GFAP可能调节血脑屏障结构或功能的完整性、病毒NP合成及病毒复制.
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重组SARS-CoV核衣壳蛋白的表达及免疫原性研究
我们利用全基因合成方式及原核表达系统获得大量纯化的N蛋白,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究提供新的思路.由于长片段目的基因在原核系统中不易表达,根据抗原性预测分析将N蛋白分成两部分表达,第一部分为N-1蛋白1～549 bp,第二部分为N-2蛋白496～1269 bp,上下游分别设计BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点,并将基因中包含这两种酶切位点的基因以无义读码方式进行突变,通过全基因合成分别将两段基因克隆至原核表达载体pET32a(+),由上海生工生物工程技术公司完成,测序证实序列无误.
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SARS-CoV核衣壳蛋白重组表达及单克隆抗体特性鉴定
SARS-CoV具有与其他冠状病毒相类似的结构.在有关动物冠状病毒的研究中发现,N蛋白是病毒主要的免疫原蛋白和良好病毒抗体检测抗原.在所有冠状病毒的结构蛋白中,无论从mRNA水平还是蛋白表达水平,N蛋白是病毒在整个感染过程中含量丰富的蛋白.
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SARS-CoV核衣壳蛋白单克隆抗体识别抗原位点的分析
SARS-CoV主要的结构蛋白包括刺突糖蛋白(spike glycoprotein, S)、包膜小蛋白(small envelope, E)、膜蛋白(membrane, M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, N).研究发现,N蛋白诱导机体产生很强的免疫应答[1],我们用SARS-CoV全病毒免疫小鼠制备的单克隆抗体,发现有80%是针对N蛋白的抗体,证明N蛋白具有很强的免疫原性,这与以往对动物冠状病毒N蛋白研究结果是一致的[2].本研究通过对SARS-CoV N蛋白单克隆抗体结合抗原位点分析,以及用SARS-CoV抗体阳性血清与单抗对N蛋白进行竞争抑制试验,分析自然状态下机体对N蛋白抗原位点的抗体应答,同时初步观察了临床应用情况.此结果有益于SARS-CoV生物学性状、蛋白组学、发病机制及诊断试剂的研究.
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SARS-CoV核衣壳蛋白抗原性鉴定和基因免疫研究
目的了解SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的抗原性及其基因疫苗的免疫原性.方法用大肠杆菌表达SARS-CoV的N蛋白,用SARS患者恢复期血清对其进行抗原性鉴定.再构建N蛋白基因疫苗,肌肉注射接种小鼠,检测小鼠血清中的抗N蛋白IgG抗体、脾细胞增殖和迟发型超敏反应.结果大肠杆菌重组表达的SARS-CoV N蛋白具有强抗原性,其基因疫苗能在小鼠有效诱导N蛋白特异性抗体和CD4+、CD8+ T淋巴细胞免疫应答.结论 SARS-CoV的N蛋白可作为重要的SARS血清学诊断抗原,并对于SARS的特异性预防和治疗有潜在的应用价值.
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HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性T细胞克隆及其靶细胞的建立
目的建立肾综合征出血热(HFRS)患者汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)特异性CTL克隆,为HTNV NP T细胞表位鉴定及HFRS患者T细胞免疫功能研究奠定基础.方法采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC),用灭活HTNV和IL-2体外刺激,有限稀释法建立T细胞克隆,流式细胞术鉴定克隆表型.并用EB病毒(EBV)转化B淋巴细胞,建立B淋巴母细胞样细胞系(B-LCL),以含HTNV S 基因的重组痘苗病毒感染B-LCL作靶细胞,以CTL 克隆作效应细胞进行细胞毒杀伤试验,测定T细胞克隆的抗原特异性.结果 T细胞克隆能特异性识别表达NP的B-LCL.在5名患者中,3名有较高的杀伤率,并自2名患者建立了5株HTNV特异性CTL克隆,其表型为CD8+均大于60%.结论成功建立了HFRS患者HTNV NP特异性CTL克隆及其靶细胞.NP是HFRS患者HTNV特异性CTL应答的主要靶抗原之一.
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四株中国狂犬病病毒核衣壳蛋白和糖蛋白抗原性分析
狂犬病病毒核蛋白(NP)单克隆抗体可以清楚地区分狂犬病病毒和狂犬病相关病毒.用抗狂犬病病毒单抗还可以在同一血清型内进一步的分组以及分析毒株传播的宿主动物和地理位置,从而有可能找到流行的线索.病毒间的差异同样表现在与病毒GP单抗的特异反应中.用特异性GP单抗进行中和试验对大量毒株的分析,认识到一些狂犬病街毒在GP抗原结构上与疫苗株有明显不同,疫苗免疫的失败和疫苗株与街毒之间抗原差异的程度有关.为了解我国狂犬病毒NP和GP抗原变异情况,用抗NP和GP单克隆抗体分析的方法对我国人用狂犬病疫苗株(aG)、实验室减毒株( CTN-181)及分离自宁夏的2株街毒进行了NP和GP抗原结构的分析和研究.
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汉滩病毒核衣壳蛋白C-端T细胞表位鉴定
目的鉴定汉滩病毒核衣壳蛋白(HTNV NP) C-端T细胞表位,为肾综合征出血热(HFRS)发病机理、疫苗研制及抗病毒免疫反应研究奠定基础.方法采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS恢复期患者外周血单个核细胞(PBMC).用IFN-γ ELISPOT实验和T细胞增殖实验,测试7名患者PBMC对23条NP C-端合成多肽的T细胞应答.结果 IFN-γ ELISPOT实验结果表明,2名供体(3、4)可分别检测到对51、70号2条多肽特异性T细胞应答.在供体3,70号肽特异性T细胞频率为45 SFC/106PBMC;在供体4,51号肽特异性T细胞频率为82 SFC/106PBMC.T细胞增殖实验与ELISPOT结果基本一致,但53号肽和64号肽还可分别刺激供体1和供体4的T细胞增殖,而未能诱导IFN-γ分泌.结论 51号和70号多肽可能是NP C-端较强的T细胞表位.
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SARS-CoV、HCoV-229E和OC43核衣壳蛋白的克隆表达及抗原相关性分析
目的克隆表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)和人冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43)核衣壳(N)蛋白,并对其重组蛋白的抗原相关性进行探讨.方法RT-PCR扩增SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的N基因全长序列,克隆到原核表达载体pQE30,IPTG诱导表达重组蛋白,用Western blot和免疫荧光鉴定.结果获得SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43 His-N融合蛋白的相对分子质量(Mr)分别约为47×103、44×103、50×103,与相应预测值相符,Western blot和免疫荧光证实,3种融合蛋白仅与相应的免疫血清特异性结合,3种蛋白的抗原性相互间无交叉反应.结论获得具有免疫原性的SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的核衣壳融合蛋白,其3种N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应.
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呼吸道合胞病毒疫苗研究动态
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿严重下呼吸道感染的重要病毒性病原体,广泛分布于世界各地.其发病率高,多数儿童在两岁前都感染过RSV.老年人和免疫力低下的人群中也会暴发流行.RSV感染的临床表现在不同年龄组往往不同,一般可致鼻炎、中耳炎、哮喘、支气管炎、细支气管炎和肺炎,尤其以后两种疾病为严重,甚至可导致死亡.RSV属副黏病毒科,肺炎病毒属, 病毒粒子直径约150～300 nm.基因组为一条约由15 000个核苷酸组成的单股、负链RNA,主要编码10个蛋白质:3种核衣壳蛋白[核壳蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)]、3种跨膜蛋白[融合蛋白(F)、附着蛋白(G)、小疏水蛋白(SH)];2种基质蛋白(M1、M2)和2种非结构蛋白(NS1、NS2).F蛋白和G蛋白是两种主要的结构蛋白,可诱导机体产生抗体和细胞免疫,因此常被作为RSV疫苗研制的靶抗原.世界卫生组织(WHO)已将研制RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展项目之一.但迄今为止,尚无安全、有效的RSV疫苗获准上市.
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SARS-CoV核衣壳蛋白用于SARS血清学诊断的研究
目的研究SARS患者血清中抗SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳(N)蛋白特异性抗体的产生规律,评价N蛋白在SARS诊断中的作用. 方法采用间接ELISA法测定250例临床确诊、188例临床疑似、62例临床排除SARS患者血清中针对N蛋白IgG抗体,并与其SARS-CoV IgG总抗体水平进行比较. 结果临床确诊病例针对N蛋白和全病毒特异性抗体IgG的阳性率均随着病程的延长而增高.N-IgG在发病第1周检出阳性率为3.45%(4/116),第2周为61.76%(42/68),第3周为81.82%(18/22),22～93 d达到100%(44/44);SARS-CoV IgG第1周检出阳性率为4.31%(5/116),第2周为55.88%(38/68),第3周为77.27%(17/22),22～93 d达到100%(44/44);临床疑似病例N-IgG检出阳性率为3.19%(6/188),SARS-CoV IgG检出阳性率为2.66%(5/188);临床排除病例N-IgG和SARS-CoV IgG检出阳性率均为6.45%(4/62).两种方法检测阳性率差异无统计学意义(χ2=0.180,P<0.001);两者之间符合率为98.20%(491/500),正常人群SARS-CoV N-IgG阳性率为1.88% (14/745). 结论 SARS-CoV N重组蛋白对于SARS诊断试剂的研究具有重要价值.
