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中国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gei/07-30磷蛋白基因的分子特征及其编码蛋白特性分析
对我国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30进行磷蛋白基因序列测定,并进行分子生物学特征分析.首先应用逆转录聚合酶链式反应扩增出病毒磷蛋白基因片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析.小反刍兽疫病毒china/Tib/Gej/07-30磷蛋白基因由1 655个核苷酸组成,编码2个相互交叠的开放阅读框(0RF).第一个ORF长度为1530个核苷酸.编码的P蛋白长度为509个氨基酸.第二个ORF长度为534个核苷酸,编码的C蛋白长度为177个氨基酸.第一个ORF通过基因编辑在751位插入1个G核苷酸,转录生成第二个mRNA,长度为897个核苷酸,编码的V蛋白长度为298个氨基酸.小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的P蛋白与其他分离株氨基酸序列同源性为86.1%～97.3%,C蛋白氨基酸序列相似性为84.3%～94.9%,V蛋白为82.9%～96.3%.China/Tm/Gej/07-30的P蛋白第315～387位氨基酸是一段高度保守的七肽重复序列.
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我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析
首次对我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的核农壳蛋白(N)基因和基因组启动子(GP)区进行序列测定和分子生物学特征分析.首先应用逆转录聚合酶链式反应从发病山羊病料中扩增出小反刍兽疫病毒N基因片段,用cDNA 3'末端快速扩增方法获得基因组启动子区片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,绘制系统发生树.我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的N基因由1 689个核苷酸组成,编码525个氨基酸,与India/Jhansi/03等6个已知N基因全序列的PPRV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.7%～97.6%和94.9%～98.5%.小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30N蛋白与磷蛋白作用的结构序列之一为495LFRLQAM501保守序列,N蛋白281-289位氨基酸含有一个T细胞表位,为281YPALGLHEF289保守序列.小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的GF区由107个核苷酸组成,与Tur-key 2000等5株其他PPRV毒株同源性为91.8%～98.2%.N基因核苷酸序列和相应的氨基酸序列系统进化分析表明小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30与亚洲国家分离株关系近.
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小反刍兽疫病毒环介导等温扩增检测方法的建立
目的 建立快速、简便和特异的小反刍兽疫病毒(PPRV)分子生物学诊断方法. 方法 针对PPRV N基因保守区设计2对特异性引物和1套环引物,对反应体系中的Mg2+、Betaine、Bst DNA Polymerase、dNTP、环引物和反应温度等条件分别进行优化,建立用于检测PPRV的环介导等温扩增方法(LAMP). 结果 建立的LAMP方法检测PPRV时,在62 ℃水浴锅中反应30 min即可直接观察结果.该方法具有高度特异性,可检测到1.6个TCID50 PPRV.结论建立的PPRV LAMP检测方法具有特异、快速、简便等优点,为小反刍兽疫病提供了一种新的诊断方法.
关键词： 小反刍兽疫病毒 环介导等温扩增(LAMP) 检测 -
小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达条件的优化及反应活性
目的 探讨小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)N蛋白原核表达、条件优化及反应活性.方法 参照GenBank中PPRV (Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-N,转化至BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析.在不同温度、时间、IPTG浓度条件下诱导表达N蛋白,确定佳表达条件.结果 PPRV N蛋白(64.4 kD)成功表达,能被羊PPRV免疫血清所识别.N蛋白主要以包涵体存在,其佳诱导条件:诱导温度28℃、IPTG终浓度2.0 mmol/L、诱导时间16 h.结论 原核表达的PPRVN蛋白具有良好的特异性和反应活性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了技术资料.
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小反刍兽疫病毒M基因的截短表达及多抗血清的制备
目的 截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备.方法 之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平.因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480 bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清.结果 经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性.结论 成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础.
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小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
目的 对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)弱毒疫苗株血凝素蛋白(H)主要抗原表位区进行克隆及原核表达,并制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体.方法 根据GenBank中登录的PPRV弱毒疫苗株H基因序列设计引物,RT-PCR扩增其主要抗原表位区域(去掉信号肽及跨膜区);将扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)后,转化E.coli Transetta(DE3),经IPTG 37℃诱导表达目的蛋白;表达的目的蛋白经带His标签的镍离子蛋白纯化柱纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定;将纯化的H蛋白与弗氏佐剂混合乳化后免疫昆明鼠,3次免疫2周后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体,采用间接免疫荧光试验进行鉴定.结果 质粒pET-30a(+)-H经双酶切鉴定证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约60 000,能同时被抗His标签抗体和PPRV阳性绵羊血清识别,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的48％,纯度可达90％以上;制备的多克隆抗体能够识别PPRV全病毒抗原以及杆状病毒表达的重组PPRV H蛋白.结论 成功构建了质粒pET-30a(+)-H,并表达了PPRV H蛋白,制备的鼠源多克隆抗体为建立针对PPRV H蛋白的ELISA抗体检测方法及研制新型亚单位疫苗奠定了基础.
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小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其生物信息学分析
目的 原核表达小反刍兽疫病毒(peste-des-petits ruminants virus,PPRV)N基因,评价其抗原性,并进行生物信息学分析.方法 参照GenBank中登录的PPRV(Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),IPTG诱导N基因原核表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot分析.运用Expasy Protparam和SOPMA软件对PPRV N基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.结果 成功表达了PPRV N基因,其融合蛋白相对分子质量约64400,主要以包涵体形式存在,并可被PPRV羊免疫血清特异性识别.PPRV N蛋白含524个氨基酸,相对分子质量约57 900,亲水性氨基酸占57.63％,疏水性氨基酸占42.17％,碱性氨基酸占12.21％,酸性氨基酸占14.12％,等电点理论值为5.11;亲水性平均系数为-0.296,不稳定系数为48.20;二级结构存在242个α螺旋(占46.18％),42个β转角(占8.02％),164个无规则卷曲(占31.3％),76个延伸链(占14.50％).结论 原核表达的PPRV N蛋白具有良好的特异性和抗原性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了参考.
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小反刍兽疫病毒F蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)F蛋白,并制备多克隆抗体.方法 根据GenBank中登录的PPRV Nigeria 75/1株F基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除F基因信号肽和跨膜区的引物,进行RT-PCR扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.表达的重组蛋白纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并初步应用于PPRV的检测.结果 重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPRV-F经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组F蛋白相对分子质量约59 000,诱导6h表达量高,且主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95％以上;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,抗体效价高于1:64000;间接免疫荧光试验显示,制备的多抗能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.结论 原核表达了PPRVF蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为其进一步研究及小反刍兽疫临床快速检测方法的建立奠定了基础.
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小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达、纯化及其抗体间接ELISA检测方法的建立
目的 原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits of ruminants virus,PPRV)N蛋白,纯化后建立其抗体间接ELISA检测方法.方法 人工合成PPRV N蛋白基因序列,并构建重组质粒pSumo-mut-N,转化至大肠埃希菌Arctic Express中,IPTG诱导表达,并对IPTG浓度和诱导时间进行优化.表达的融合蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,以其作为包被抗原建立PPRV抗体间接ELISA检测方法,对临床样本进行检测.结果 重组表达质粒pSumo-mut-N经双酶切和测序证明构建正确.N蛋白佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG于11℃诱导10 h.表达的重组蛋白相对分子质量约71 900,纯化后纯度在80％以上,浓度可达120 μg/ml,与PPRV阳性抗体具有良好的反应原性.基于N蛋白建立的PPRV抗体间接ELISA方法样品检测结果与已知血清之间的符合率为100％.结论 原核表达并纯化了PPRV N蛋白,建立的基于N蛋白的PPRV抗体ELISA检测方法为PPRV抗体间接ELISA检测试剂盒的研制和应用奠定了基础,对于流行病学免疫监测及控制PPRV的流行具有重要意义.
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小反刍兽疫研究概况
小反刍兽疫是严重危害山羊和绵羊等家畜的A类动物传染病,目前该病已经给我国养羊业造成了巨大的威胁.近年来,国内外学者对该病开展了许多研究工作,本文从病原学、流行病学、临床症状、发病机理、病理变化、诊断、防控措施等几个方面对该病研究概况进行了综述,为该病的有效防控提供有益的参考.
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小反刍兽疫病毒对鼠源树突状细胞成熟分化的影响
目的 研究和探讨小反刍兽疫病毒(PPRV)对小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DCs)成熟和分化功能的影响.方法 从小鼠骨髓中分离得到DCs,经过IL-4和GM-CSF诱导成熟;流式细胞术检测DCs表面共刺激分子表达及吞噬FITC-Dextran的能力;ELISA检测细胞因子IL-6、IL-12p40、IL-1β和IL-10的表达水平.结果 利用LPS和PPRV处理DCs 24 h,发现与阳性对照LPS组相比,PPRV作用后显著抑制了CD40和MHC-Ⅱ的表达(P＜0.05);滴度适度的PPRV可以显著增加CD40、CD80和CD86的表达,显著升高IL-6和IL-10的分泌(P＜0.05),吞噬FITC-Dextran的能力并无显著差异,各组之间也无影响,且不同比例的PPRV对DC存活率无显著影响(P＞0.05).结论 PPRV在一定滴度范围内具有潜在的促进小鼠DC成熟的功能,为免疫学研究奠定基础.
