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T细胞克隆扩增与骨髓增生异常综合征
骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性的克隆性造血干细胞异常疾病,病人常伴有免疫学异常.T细胞介导的造血前体细胞抑制而导致细胞减少与MDS的发生发展有一定相关性.本文总结了目前基于T细胞受体(TCR)谱系等分析所研究的MDS病人T细胞克隆扩增特点,论述的主要问题包括有:MDS病人自身免疫现象和T细胞介导造血抑制的相关性,MDS病人中T细胞克隆扩增特点,MDS病人T细胞谱系变化,MDS病人胸腺近期输出功能变化,免疫抑制治疗效果与MDS病人T细胞克隆的相关性,以及T细胞克隆分析的临床应用价值等.
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白血病过继免疫治疗时外周血T淋巴细胞诱导培养后的克隆性变化
本研究分析白血病细胞免疫时自体树突细胞(DC)和多种细胞因子诱导外周血淋巴细胞后T细胞克隆性的变化.采集21例化疗缓解后行细胞免疫治疗的白血病患者的骨髓和外周血,加入细胞因子培养,获得树突细胞(DC)和激活T细胞.用RT-PCR扩增代表T细胞克隆性的T细胞受体β链可变区(T-cell receptor β variable region,TCRBV),用TCRBV基因扫描的方法观察培养前后T细胞克隆的特征性变化;对T细胞克隆的TCRBV进行序列分析.流式细胞术(FCM)检测CD3+、CD4+、CD8+、CD56+和CD4+ CD25str+FOXP3+,确定其细胞毒T细胞、辅助T细胞、调节T细胞和NK-T细胞的比例变化.结果表明:临床缓解后的白血病患者的T细胞呈寡克隆分布,分属在24个TCRBV家族中一些TCRBV基因家族的淋巴细胞克隆消失,仅少数保持多克隆分布,其中TCRBV 24基因家族均为克隆性的分布(100%).分析患者的TCRBV24基因序列特征时发现.3例在CDR3区共用motif VAG,2例共用GGG,表明这些TCRBV 24有可能识别同一抗原,其中1例(例5)患者除TCRBV24在CDR3区有motif GGG外,TCRBV8也有GGG,也可能会识别同一抗原.外周血淋巴细胞经过13天的体外抗原和细胞因子培养后,培养前出现的一些寡克隆以及克隆完全缺失的状态随即出现了明显变化,培养后都出现完整多克隆分布.将培养前后T细胞进行流式细胞术分析显示,培养后淋巴细胞数目为培养前的3.38±1.20倍,CD3+ 数培养前为(71.1±11.8)%细胞,培养第13天后为(95.4±3.2)%,明显增加;CD4+数培养前为(26.7±11.4)%,培养第13天后为(27.0±13.1)%,无明显变化(p>0.01);CD8+数培养前为(35.7±12.9)%,培养第13天后为(55.5±13.8)%,明显增加(p<0.01);CD3+ CD56+数培养前为(3.1±1.6)%,培养第13天后为(9.8±6.1)%,增加2倍多(p<0.01);CD4+CD25str+ FOX P3+数培养前为(0.12±0.1)%,培养第13天后为(0.22±0.18)%(p<0.01).结论:T淋巴细胞诱导培养方法的主要作用是促进CTL和NK细胞增殖,缓解后白血病患者体内淋巴细胞群往往呈寡克隆增殖,一些克隆会共用同样的TCRBV CDR3模体,识别同样的抗原,细胞因子联合诱导与DC共培养后淋巴细胞恢复多克隆免疫状态,产生以CTL和NK-T为主的效应细胞.
关键词： 白血病 过继免疫治疗 T细胞克隆 T细胞受体亚家族(TCRBV) 基因扫描 -
卵清白蛋白特异性T细胞克隆的建立及T细胞受体使用情况分析
目的体外建立可长期培养的抗原特异性T细胞系及克隆,并分析其T细胞受体的使用情况.方法用卵清白蛋白(OVA)免疫BALB/c小鼠,取淋巴结细胞在体外用抗原反复刺激建立抗原特异性T细胞系,通过有限稀释法进行克隆,应用锚定PCR方法分析其特异的T细胞受体的应用. 结果建立了H-2d限制的OVA特异性T细胞系,获得了3株特异性较高的T细胞克隆,T细胞系中TCR AV11S4和BV4S1应用频率高,3株T细胞克隆的TCR均为AV5S2和BV2S1,这些T细胞所使用的TCR α链和β链在CDR3区有明显的共性.结论获得了卵清白蛋白特异的T细胞系和克隆,且其T细胞受体的应用有一定的限制性.
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HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性T细胞克隆及其靶细胞的建立
目的建立肾综合征出血热(HFRS)患者汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)特异性CTL克隆,为HTNV NP T细胞表位鉴定及HFRS患者T细胞免疫功能研究奠定基础.方法采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC),用灭活HTNV和IL-2体外刺激,有限稀释法建立T细胞克隆,流式细胞术鉴定克隆表型.并用EB病毒(EBV)转化B淋巴细胞,建立B淋巴母细胞样细胞系(B-LCL),以含HTNV S 基因的重组痘苗病毒感染B-LCL作靶细胞,以CTL 克隆作效应细胞进行细胞毒杀伤试验,测定T细胞克隆的抗原特异性.结果 T细胞克隆能特异性识别表达NP的B-LCL.在5名患者中,3名有较高的杀伤率,并自2名患者建立了5株HTNV特异性CTL克隆,其表型为CD8+均大于60%.结论成功建立了HFRS患者HTNV NP特异性CTL克隆及其靶细胞.NP是HFRS患者HTNV特异性CTL应答的主要靶抗原之一.
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T细胞克隆与甲胎蛋白相关的研究进展
T细胞克隆(T cell clone)指将单个T细胞从细胞群中分离出来后单独培养,使之重新繁殖成为单一克隆的T细胞群体.凭借T细胞克隆技术,可获得遗传背景一致且T 细胞受体(T cell receptor,TCR)均一的单克隆T细胞群体.甲胎蛋白(alpha-fetroprotein,AFP)是一种糖蛋白,主要由肝细胞粗面内质网上的核糖体合成.它只是胎儿时期肝脏内合成的一种糖蛋白,成人后血清中水平很低,而发生恶变的肝细胞则又可恢复其合成的能力.因此AFP的血清含量变化对于肝癌的早期发现、疗效的检测有着重大意义.
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多发性硬化患者T细胞克隆中CD3CD56双阳性细胞的分析
目的多发性硬化(MS)是一种器官特异的自身免疫病,病变侵犯中枢神经系统.MS不仅有T,B细胞介导,而且与脑淋巴瘤的发生有密切关系.方法本文用T细胞克隆技术,细胞表型分析技术和细胞毒活性分析经MBP抗原肽治疗的MS患者外周血的T,B淋巴细胞(另文发表).结果经MBP抗原肽诱导的T细胞克隆中有相当一部分T细胞系不仅高表达CD3CD56双阳性标志(NKT细胞),50.7%±4.9%,对照为6.0%和3.0%,而其他神经系统疾病分别是11.0%和20.0%,且这种双阳性细胞群不同于NK细胞能特异杀伤神经胶质瘤(59.7%±4.9%)而NK细胞仅为17.3%±4.5%,具有统计学差异.结论用MBP抗原肽诱导的T细胞克隆可用作疫苗治疗MS患者,而这种高表达CD3CD56双阳性标志(NKT细胞)对神经胶质瘤细胞较NK细胞潜在的更强的杀伤活性.至于其抗瘤机制正在研究之中.
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TCRVβ基因谱系分析在AIDS疾病T细胞克隆性研究中的应用
对于T淋巴细胞TCRVB基因家族以及T细胞的克隆性的研究是近年的热点问题.通过对艾滋病人(模型)的TCRVβ基因谱系分析,测定特定CDR3长度及序列出现的频率能反映T细胞克隆扩增的程度和功能状态,进而有助于对MDS的临床诊断、免疫机制、药物或疫苗的治疗效果等的理解.
关键词： T细胞受体 Vβ家族 T细胞克隆 获得性免疫缺陷综合征 -
T细胞克隆应用研究进展
T细胞克隆指将单个T细胞从细胞群中分离出来后单独培养,使之重新繁殖成为单一克隆的T细胞群体.它是研究T细胞的有效手段,广泛应用于T细胞受体、T细胞治疗、T细胞表位、移植免疫以及细胞因子分泌和细胞间的协调作用等研究领域,并已取得了重要进展,本文拟就有关内容作一综述.
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基因扫描分析人T细胞受体CDR3谱型检测T细胞克隆技术的建立
目的 建立人T细胞受体(TCR)互补决定区3(CDR3)基因谱型的基因扫描分析术,为分析T细胞克隆提供研究方法.方法 分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照,应用RT-PCR方法扩增5例健康志愿者外周血T细胞的34个TCR Vα亚家族和26个TCR Vβ亚家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性.结果 T细胞株Jurkat细胞仅表达TCR Vα1.1和Vβ8基因,且为单克隆,而B细胞株Raji细胞则不表达所有的TCR Vα和Vβ基因.5例健康人表达所有的TCR Vα和Vβ基因,均为多克隆T细胞.结论 基因扫描分析人TCR CDR3基因谱型是检测T细胞克隆性的精确敏感方法.
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基因扫描分析小鼠T细胞受体CDR3谱型检测T细胞克隆技术的建立
目的 建立小鼠T细胞受体(TCR)互补决定区3(CDR3)谱型的基因扫描分析术,为分析T细胞克隆提供研究方法.方法 应用RT-PCR方法分别扩增近交系小鼠C57BL/6H-2b,Balb/CH-2d和F1代小鼠[Balb/cx C57BL/6 F1H-2d/b,CB6F1)脾脏T细胞的21个TCK Va家族和18个TCK VB家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性.结果 3种小鼠脾脏T细胞均表达所有的TCR Vα和Vβ CDR3基因,基因扫描显示全部TCK CDR3谱型呈高斯(钟型)分布,提示均为多克隆T细胞.各家族CDKs基因表达频率接近,但呈现不同的多态性和长度分布.结论 基因扫描分析TCR.αβ CDR3基因谱型是检测小鼠T细胞克隆性的精确敏感方法.
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单纯疱疹病毒胸苷激酶基因导入T细胞克隆治疗溃疡性结肠炎大鼠
目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因导入T细胞克隆治疗溃疡性结肠炎(UC)大鼠的作用.方法 将HSV-TK基因导入T细胞克隆回输至27只UC大鼠,观察刺激指数(SI)、CD4+、CD8+及白细胞介素(IL)-13和IL-4水平的变化,并比较治疗前后结肠病变的情况.结果 uc大鼠结肠壁病变于tk+细胞克隆回输治疗2-3 d出现炎性反应吸收改变,7-10 d后结肠炎性反应基本消失;回输前SI值为7.39±1.24,回输后为2.67±0.87(P《0.05),CD4+、CD8+水平、IL-13和IL-4水平明显下降,差异有统计学意义(P《0.05).结论 T细胞克隆疫苗诱导和tk基因导入后杀伤效应的双重作用导致结肠自身抗原特异性免疫耐受的终形成,HSV-TK自杀基因导入T细胞克隆回输方案是UC基因治疗研究和靶点设计的有效手段.
关键词： T细胞克隆 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 溃疡性结肠炎 免疫耐受 大鼠 -
基因扫描分析非小细胞肺癌病人外周血和骨髓T细胞克隆性增殖及分布特点
目的:分析非小细胞肺癌(non smallcelllungcancer,NSCLC)病人的T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性增殖特点.方法:利用RT PCR和基因扫描方法分析3例NSCLC外周血和骨髓单个核细胞中24个TCRVβ基因的CDR3长度,了解TCRVβT细胞的分布及其克隆性.结果:3例病人仅存在1～5个TCRVβ亚家族,主要为Vβ3、Vβ7和Vβ9,2例病人出现Vβ7寡克隆性增殖T细胞,另1例发现Vβ3的寡克隆T细胞.结论:NSCLC病人外周血或骨髓的TCRVβ亚家族出现倾斜性分布和克隆性增殖T细胞,主要为Vβ3和Vβ7亚家族T细胞,这可能是由肺癌细胞相关抗原引起的特异性免疫反应的T细胞克隆.
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利用异源性饲养细胞建立人抗原特异性T淋巴细胞克隆
目的 摸索利用有限稀释法建立抗原特异性T淋巴细胞克隆操作中的佳培养条件,并探讨利用异体来源的饲养细胞作为替代方案的可行性.方法 MTT法测定细胞增殖活性,判断T细胞生长的佳PHA、IL-2作用浓度以及用丝裂霉素处理法制作饲养细胞的浓度、时间条件,观察IL-4对克隆生长形态的影响.探讨异体饲养细胞进行有限稀释法T细胞克隆时的克隆生长特点和影响因素.结果 克隆时PHA 25 μg/ml、IL-2 27 u/ml,饲养细胞丝裂霉素处理60 μg/ml、80 min为比较理想的操作条件.IL-4可以促进CD4+细胞亚群的克隆生长,但异体饲养细胞法形成的T细胞克隆的抗原特异性难以保障.结论 IL-4对CD4+细胞克隆生长具有促进作用,异体饲养细胞法得到的T细胞克隆抗原特异性不高.
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慢性苯中毒病人相关TCR Vα12和Vα19 T细胞克隆性研究
目的:了解慢性苯中毒病人外周血中TCR Vα克隆性增殖T细胞特点.方法:利用RT-PCR方法扩增3例慢性苯中毒病人外周血单个核细胞中29个TCR Vα基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性.克隆性增殖T细胞PCR产物进行CDR3区序列分析.结果:3例慢性苯中毒病人外周血中Vα12和Vα19亚家族T细胞呈克隆性增殖,序列分析显示3例慢性苯中毒病人Vα12(1例)和Vα19(2例)CDR3区氨基酸序列分别是FCALSDRNTGGF,YICAVSHSGGGA和VYICAVNYGGS已被GenBank收录(EU285264、EU379941和EU429520).结论:在慢性苯中毒病人中发现3个新的TCR Vα亚家族重排序列,外周血T细胞出现的TCR Vα12和Vα19克隆性增殖T细胞可能是机体接触苯后所发生的特异性免疫反应.
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再生障碍性贫血儿童TCR Vβ亚家族T细胞克隆性增殖及其与HLA-DRB1*15的关系
[目的]探讨再生障碍性贫血(再障)儿童TCR Vβ24个亚家族T细胞克隆性及其与HLA-DRB1*15的关系.[方法]再障儿童17例(SAA 14例,MAA 3例),采用RT-PCR和基因扫描分析外周血或骨髓TCR Vβ24个亚家族基因的表达和克隆性,SSP-PCR检测HLA-DR.[结果]再障儿童外周血T细胞仅表达4～22个Vβ亚家族,而正常儿童外周血T细胞几乎表达所有Vβ亚家族.12例(包括初诊SAA 4例,CR 4例,复发1例和MAA 3例)再障儿童存在不同程度T细胞克隆性增殖,但个体间差异较大,正常外周血和骨髓均为多克隆性T细胞.5例HLA-DRB1*15(+)患儿中4例(80%)有寡克隆T细胞,而12例HLA-DRB1*15(-)患儿中仅3例(25%)见寡克隆T细胞,两组比较差异具有显著意义(P＜0.05).伴寡克隆T细胞的6例SAA儿童经免疫抑制治疗后达CR;不伴寡克隆T细胞的5例SAA儿童接受免疫抑制治疗,其中CR 1例,PR 2例、无效1例,死亡1例.[结论]大多数再障儿童存在T细胞克隆性增殖,寡克隆T细胞多见于SAA,尤其是HLA-DRB1*15(+)的SAA儿童.TCR VβT细胞克隆的检测对进一步了解再障免疫功能状态、预测免疫抑制治疗效果具有一定的参考价值.
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去甲基化KG1a细胞DNA对人外周血单个核细胞杀伤活性和T细胞受体Vαβ T细胞增殖的影响
目的:研究去甲基化的急性髓性白血病细胞KG1a的DNA体外诱导人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的杀伤活性和T细胞受体Vαβ(αβ chain variable gene of T cell receptor,TCR Vαβ)谱系的表达和克隆情况.方法:去甲基化试剂盒对KG1a细胞去甲基化处理,并提取其DNA.应用乳酸脱氢酶释放法检测DNA诱导前后PBMC杀伤KG1a细胞的活性,应用RT-PCR方法扩增各组外周血T细胞的32个TCR Vα亚家族和24个TCR Vβ亚家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性.结果:基因扫描显示去甲基化的KG1a细胞DNA可以诱导出呈单克隆、寡克隆或寡克隆趋势生长的亚家族T细胞,且在效靶比为20:1时去甲基化的KG1a细胞DNA诱导前后PBMC杀伤KG1a细胞的活性差异有统计学意义(P＜0.05).结论:去甲基化的KG1a细胞DNA可提高PBMC杀伤活性,且诱导T细胞呈克隆性增殖.
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CML病人TCR Vβ21寡克隆T细胞及其CDR3序列特点
目的分析慢性粒细胞白血病(CML)病人的克隆性增殖T细胞及其CDR3序列的特点.方法利用RT-PCR扩增3例CML外周血单个核细胞中24个TCR Vβ基因的CDR3,了解TCR VβT细胞的分布.阳性产物进一步经基因扫描分析,了解其克隆性.寡克隆的PCR产物再进行序列分析.结果3例病人仅存在3～9个TCR Vβ亚家族T细胞,部分Vβ亚家族T细胞呈寡克隆性增殖,Vβ21的寡克隆T细胞见于全部的3例病人中.结论CML病人外周血TCR Vβ亚家族T细胞出现倾斜性分布和克隆性增殖,这可能是CML中机体对恶性细胞所引起的特异性免疫反应,但对不同病人的Vβ21寡克隆T细胞序列分析并未能发现完全同源的CDR3序列.
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APL相关TCR Vα 6、Vα10和Vβ23寡克隆T细胞CDR3序列分析
目的:分析急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周m TCR Vα和Vβ克隆性增殖T细胞及CDR3序列特点.方法:利用RT-PCR法扩增1例APL患者外周血单个核细胞中29个TCR Vα基因和24个Vβ基因CDR3,阳性PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析确定其CDR3长度,了解其克隆性;寡克隆的PCR产物再进行CDR3区序列分析.结果:该例APL患者外周血T细胞分别在TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族中出现寡克隆性增殖T细胞,经序列分析显示TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族基因序列分别为Vα6NJα17、Vα10NJα35和Vβ23NDβ1NJβ2.7,其CDR3区氨基酸序列分别为CAMRENSAGNK,YLCAGDELLWECA,CASSSKWAG-GTYEQY,该3个TCR基因已被GenBank收录(登陆号:EU544946、EU544947和EU647219).结论:APL患者外周血T细胞出现的TCR Vα6、Vα10和Vβ23克隆性增殖T细胞可能是机体对抗白血病细胞所引起的抗原特异性免疫反应;这3个独特TCR重排序列将进一步作为开展APL特异性免疫治疗研究提供资料.
