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两种方法分离免疫细胞用于高通量测序TCR组库分析的比较
目的 探讨两种方法分离免疫细胞进行高通量T细胞表面的T细胞变体(TCR),组库分析的区别及可行性.方法 分别采用免疫磁珠分选纯化CD3阳性T细胞和Ficoll-Paque梯度离心法分离外周血淋巴细胞的方法制备TCR测序所需样品各1例,提取DNA后多重聚合酶链式反应(PCR)扩增CDR3区域,将扩增得到的PCR产物纯化后构建免疫组库,进行高通量测序及生物信息学分析.结果 两种方法获得的免疫细胞提取DNA后均能够满足TCR免疫组库建库需要,高通量测序结果显示互补决定簇3 (CDR3)区域长度呈高斯分布,来自健康志愿者的TCR具有丰富多样性,肿瘤患者TCR多样性呈寡克隆分布.结论 纯化的T细胞或者直接分离得到的淋巴细胞均可用于免疫组库构建及后续TCR CDR3受体库高通量测序分析,TCR CDR3多样性可能直接反应机体免疫状态.
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再生障碍性贫血T细胞受体Vβ基因表达及生血合剂对其的干预作用
目的 利用免疫学和分子生物学技术,着重从T细胞受体β链可变区(TCR Vβ)亚家族基因表达角度探讨再生障碍性贫血(AA)的免疫发病机制及中药复方生血合剂的治疗作用.方法 AA患者分别用生血合剂(治疗组10例)和环孢霉素(对照组10例)治疗6个月以上,采用RT-PCR、基因扫描方法检测治疗前后外周血单个核细胞TCR Vβ基因表达的变化.结果 20例AA患者Vβ 24个亚家族基因谱型倾斜,寡克隆亚家族所占百分率明显增多,与健康人(10名)比较差异有显著性(P＜0.01).30%～50%的AA患者存在Vβ2、Vβ5、Vβ6、Vβ15、Vβ16、Vβ22、Vβ23寡克隆亚家族,50%以上的患者存在Vβ8、Vβ21寡克隆亚家族.治疗后两组寡克隆亚家族均比治疗前减少(P＜0.05).结论 多个克隆性增殖的T细胞家族参与了AA的发病过程,生血合剂可改善TCR Vβ谱型倾斜程度,降低异常T细胞克隆性增殖,从而减少异常克隆的T细胞对造血组织的免疫损伤,有利于骨髓造血功能的恢复.
关键词： 再生障碍性贫血 生血合剂 T细胞受体 β链可变区亚家族基因 T细胞克隆性 -
健脾解毒方对脾虚肝癌大鼠TCRVβCDR3基因谱系变化的影响
目的 观察健脾解毒方对脾虚肝癌大鼠模型的抗癌作用与T细胞受体β链超变区第3互补决定区(the third complementary-determining region of the variable region of T cell receptorβ-chain,TCRVβCDR3)基因谱系的关系.方法 将大鼠按随机数字法分为空白对照组(正常组,灌胃生理盐水,每日1次),脾虚模型组(脾虚组),肝癌模型组(肝癌组),脾虚肝癌模型组(脾虚肝癌组),健脾解毒方(中药)高、中、低剂量(75.00、37.50、18.75 g/kg灌胃,每日1次)组和胸腺五肽(5 mg/kg,肌肉注射,每周2次)组(西药组),每组8只.采用苦寒泻下法制备脾虚模型,原位移植法制备肝癌模型.基因扫描检测大鼠胸腺、肝、肝癌20个TCRVβCDR3亚家族基因片段谱系.结果 中药中、高剂量健脾解毒方可延缓肝癌的体积增长(P＜0.05),且其肝指数和胸腺指数与正常组相当(P＞0.05).正常胸腺组织和肝组织TCRVβCDR3亚家族数量(20、19)、基因片段数量(220、113)、谱系准高斯分布比例(100％、42.1％)、片段荧光峰面积(6539 ±2 325、1238±439)在各组中均处于高水平.中药中、高剂量组胸腺和肝组织TCRVβCDR3表达接近正常组,西药组、脾虚组和肝癌组居中,脾虚肝癌组差.西药组肝癌组织TCRVβCDR3表达佳.结论 健脾解毒方对肝癌细胞增殖的抑制作用可能与其增强TCRVβCDR3基因谱系表达有关.
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重症/难治性结缔组织病患者自体外周血干细胞移植治疗前后 TCRBV和CDR3的变化规律
目的 探讨结缔组织病患者经造血干细胞移植后T细胞受体BV亚家族(T cell receptor BV,TCRBV)的重建规律.方法 重症/难治性结缔组织病13例,其中系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)8例,类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)4例,原发性干燥综合征1例.分别于动员前、动员后、移植后第2周、1月、3月、6月、12月及18月,共8个时间窗,取外周血,通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和基因扫描方法,观察TCRBV和互补决定区3(complementarity determinative region 3,CDR3)表达的动态演变.结果 动员前的TCR BV亚家族和CDR3谱型呈一定程度的偏移性/寡克隆性表达;移植后2周,其偏移性/寡克隆性呈现一过性增强;而后再向多克隆化演变.结论 移植后的TCRBV和CDR3的免疫重建具有自身反应性TCR的优势表达和CDR3的寡克隆性增殖受抑的特点,有向正常人表达类型发展的趋势.
关键词： 自体外周血干细胞移植 T细胞受体 互补决定区3 -
基因扫描分析AML-M2a病人外周血的TCR Vβ亚家族T细胞的克隆性增殖
目的了解AML-M2a患者外周血中TCR Vβ亚家族T细胞的分布和克隆性情况.方法利用RT-PCR扩增14例AML-M2a患者外周血单个核细胞中24个TCR Vβ亚家族基因的CDR3,了解TCR Vβ亚家族T细胞的分布.阳性产物进一步经基因扫描分析了解其克隆性.结果 14例AML-M2a患者选择性表达3～10个Vβ亚家族,其中部分Vβ亚家族呈寡克隆增殖.结论 AML-M2a患者TCR Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布和克隆性增殖,可能是机体对M2a细胞刺激所产生的特异性免疫反应.
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T细胞克隆扩增与骨髓增生异常综合征
骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性的克隆性造血干细胞异常疾病,病人常伴有免疫学异常.T细胞介导的造血前体细胞抑制而导致细胞减少与MDS的发生发展有一定相关性.本文总结了目前基于T细胞受体(TCR)谱系等分析所研究的MDS病人T细胞克隆扩增特点,论述的主要问题包括有:MDS病人自身免疫现象和T细胞介导造血抑制的相关性,MDS病人中T细胞克隆扩增特点,MDS病人T细胞谱系变化,MDS病人胸腺近期输出功能变化,免疫抑制治疗效果与MDS病人T细胞克隆的相关性,以及T细胞克隆分析的临床应用价值等.
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从一例慢性嗜酸性粒细胞白血病发现克隆性增殖T淋巴细胞
利用TCRβV基因指纹图谱分析1例慢性嗜酸粒细胞白血病(CEL)患者的外周血T细胞克隆变化,了解与CEL疾病相关的T细胞受体(TCR)β可变区主要接触抗原的CDR3序列特征.用RT-PCR扩增CEL患者的外周血TCRβV 1-24个家族的基因序列,在变性测序胶上电泳,形成TCRβV基因指纹图谱,切割克隆性增生的电泳条带进行测序分析.结果显示: TCRβV基因指纹图谱在βV13.2家族中的分子量较小处出现一条明显扩增的条带,切割此条带并测序证实为单克隆性T细胞增殖,其CDR3的氨基酸序列为: SFSYEQY,其中SFSY基序为特异性保守序列,其它家族无异常改变.结论:该CEL患者TCRβV13.2家族中出现了单克隆性增殖的T淋巴细胞群,可能是针对CEL恶性肿瘤细胞反应性增生的T细胞克隆.
关键词： 慢性嗜酸粒细胞白血病 克隆性增殖T淋巴细胞 T细胞受体 互补决定区 -
抗磷脂综合征识别相关抗原的T细胞克隆受体分析
为了了解识别抗磷脂综合征相关抗原的T细胞受体特征,用基因谱型图的方法分析一例抗磷脂综合征患者体内的T细胞特征.结果发现: 优势T细胞呈寡克隆性增生;进一步分析2群主要T细胞克隆的T细胞受体(TCR) 基因特征表明,其TCRβ链基因主要由TCRβV8和TCRβV23家族基因编码,T细胞接触抗原的TCRβV CDR3区氨基酸序列分别是: CASSLLVAGGPRAYNEQFFGPG和CASSLAGFGQPQHFGDG,其CDR3区模体YNEQFFGPG和QHFGDG与报道的特发性血小板减少性紫癜和系统性红斑狼疮高度一致. 结论: 这些自身免疫病增殖的T细胞克隆可能识别同样的抗原.
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Ph+和Ph-CML病人外周血TCR Vβ T细胞分布特点
为了解Ph+和Ph-慢性粒细胞白血病(CML)病人外周血TCR Vβ亚家族T细胞的分布特点,利用RT-PCR分别扩增13例CML病人(Ph+-b3a2型5例,Ph+-b2a2型5例,Ph-型3例)外周血单个核细胞的TCR Vβ的24个亚家族基因片段,了解病人各Vβ亚家族的利用情况.研究结果:发现与正常人有所不同,病人仅存在部分TCR Vβ亚家族T细胞,Ph+-b3a2型CML表达4-16(平均10.2)个Vβ亚家族,Ph+-b2a2型CML表达8-11(平均8.8)个Vβ亚家族,而Ph-者表达5-6(平均5.7)个Vβ亚家族.各病人表达的Vβ亚家族分布有所不同,在Ph+(b3a2型)全部病人表达Vβ10和Vβ16,其次为Vβ9和Vβ22;Ph+(b2a2型)除与Ph+(b3a2型)相同全部病人表达Vβ10和Vβ16外,还全部表达Vβ24,其次为Vβ8;而Ph-者全部表达Vβ24,其次为Vβ3,Vβ10,Vβ13和Vβ22.结论:提示Ph+和Ph-CML病人外周血的TCR Vβ亚家族T细胞存在倾斜性分布现象,不同类型CML病人T细胞的TCR Vβ选择性利用有所不同,这可能与CML细胞相关抗原的差异以及个体特异性免疫反应的差异有关.
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T细胞中TCR Vα40与TCR Dδ3,Jδ1和ψJα重排的特点
利用巢式PCR扩增10例正常人外周血单个核细胞、4例分选的外周血CD3+细胞和7例心胸外科手术的非免疫性疾病和非肿瘤病人的正常胸腺细胞DNA的TCR Vα40基因与Jδ1,Dδ3和ψJα重排的情况,从对不同含量DNA的PCR分析,了解其重排分布频率.结果显示,TCR Vα40分别与Jδ1,Dδ3和ψJα的重排均可见于多数外周血T细胞和胸腺细胞中,对不同含量DNA的PCR分析显示TCR Vα40重排的分布频率在外周血和胸腺细胞有所不同.研究结果提示,TCR Vα40-ψJα的重排常见于成熟和未成熟T细胞中,而TCR Vα40-Dδ3则在未成熟T细胞中发生频率更高.
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TCRVβ7.1基因修饰的T细胞对肝癌细胞体外杀伤及体内靶向识别作用的研究
目的 探讨 TCRVβ7.1基因修饰的T细胞对肝癌细胞的体外杀伤活性及其在体内靶向识别肝癌细胞的作用.方法 ①体外实验:以特异性识别肝癌细胞的TCRVβ7.1基因转染健康人外周血单个核细胞(PBMC),转染前和转染后24、48 h用流式细胞术检测转染基因的表达.将人肝癌 BEL-7402 细胞分为4组,其中3组分别与未经修饰的PBMC(PBMC组)、转染pcDNA3.1空质粒的PBMC(空质粒组)、转染TCRVβ7.1基因的PBMC(基因修饰组)共培养,1组作为阴性对照组.共培养前和共培养24、48 h,以噻唑蓝(MTT)法检测PBMC对人肝癌BEL-7402细胞的杀伤活性.②体内实验:用重度联合免疫缺陷小鼠建立荷肝癌动物模型,于肿瘤周围皮下注射基因修饰的PBMC,于注射后2、7、14、28、42d 各处死2只小鼠,分别取肿瘤、脾、肝、肺、肠、卵巢、心、脑、肾组织,检测基因修饰的 PBMC 在小鼠体内的存活时间及组织分布情况.结果 ①体外实验:流式细胞术检测表明TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达.MTT法检测显示,基因修饰组T细胞对肿瘤细胞的杀伤率(24、48 h分别为31.24%±2.26%、40.95%±3.45%)明显高于PBMC组(分别为6.92%±3.12%、7.84%±2.29%)和空质粒组(分别为9.23%±2.46%、10.36%±3.34%),差异均有统计学意义(P＜0.01).②体内实验:肿瘤周围注射基因修饰的PBMC后2d,小鼠肿瘤组织已经出现PBMC(8个/视野),随时间延长PBMC数量呈上升趋势,28d达大值(18个/视野).取材于不同时间的小鼠组织标本的检测显示,基因修饰的PBMC只分布于肿瘤组织,而在其他组织中没有出现.结论 TCRVβ7.1基因修饰可诱导T细胞活化并提高T细胞对肝癌细胞的杀伤活性;外源性TCRVβ7.1基因修饰T细胞在荷肝癌小鼠体内的分布具有肿瘤靶向性.
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卵清白蛋白特异性T细胞克隆的建立及T细胞受体使用情况分析
目的体外建立可长期培养的抗原特异性T细胞系及克隆,并分析其T细胞受体的使用情况.方法用卵清白蛋白(OVA)免疫BALB/c小鼠,取淋巴结细胞在体外用抗原反复刺激建立抗原特异性T细胞系,通过有限稀释法进行克隆,应用锚定PCR方法分析其特异的T细胞受体的应用. 结果建立了H-2d限制的OVA特异性T细胞系,获得了3株特异性较高的T细胞克隆,T细胞系中TCR AV11S4和BV4S1应用频率高,3株T细胞克隆的TCR均为AV5S2和BV2S1,这些T细胞所使用的TCR α链和β链在CDR3区有明显的共性.结论获得了卵清白蛋白特异的T细胞系和克隆,且其T细胞受体的应用有一定的限制性.
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HIV-1感染者CD4+T细胞受体基因多样性特点及其与病毒载量的相关性
目的 分析HIV-1感染者CD4+T细胞受体(TCR)基因的多样性特征及其与病毒载量的相关性.方法 应用抗CD4单克隆抗体从25份HIV-1感染者和10份HIV-1阴性对照样本外周血单个核细胞(PBMC)中分离CD4+T细胞,提取细胞总RNA,然后通过逆转录及巢式多聚酶链反应(nestedPCR)对TCR 22个Vβ基因家族的互补决定区3(CDR3)进行扩增,利用ABI3700测序仪对扩增的PCR产物进行扫描,定分析HIV-1感染者TCRCDR3区多样性变化特征及其与病毒载量的相关性.结果 HIV-1感染者CD4+T细胞TCR CDR3区平均D(distance)值显著高于正常对照组(P＜0 05),TCR Vβ基因各家族CDR3长度谱型成寡克隆分布,TCR CDR3区的紊乱与病毒载量呈正相关(r=0 494,P＜0 05);HIV-1感染引起TCR多样性的改变不仅表现在不同Vβ基因家族上,而且也表现在CDR3长度上,其中感染者Vβ8、Vβ22、Vβ23基因家族的变化与正常人差异有统计学意义.结论 HIV-1感染能引起CD4+T细胞TCR基因多样性的减少及高斯(Gaussian)分布的破坏,TCR CDR3区的紊乱与病毒载量呈正相关.
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PCR-SSCP分析急性淋巴细胞白血病TCR基因寡/亚克隆重排及临床意义
目的为研究急性淋巴细胞白血病(ALL)TCR基因寡/亚克隆重排及与临床关系. 方法采用PCR-SSCP技术分析81例ALL TCR VγⅠ-Jγ基因重排. 结果 65例(80.2%)ALL病人存在TCR VγⅠ-Jγ基因重排,8例(8.6%)病人存在寡/亚克隆重排;寡/亚克隆ALL的白细胞计数显著高于非寡/亚克隆ALL(P<0.01);寡/亚克隆ALL的完全缓解率为37.5%,显著低于非寡/亚克隆ALL(80.7%)(P<0.005). 结论应用PCR-SSCP方法可确定ALL的寡/亚克隆性,ALL病人寡/亚克隆检测有助于预测疗效和预后判断.
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T细胞受体库及细胞因子表达与胃癌进展及转移的关系
目的了解在胃癌的发展过程中,肿瘤细胞与机体免疫系统间相互作用的特征. 方法采用高敏感的放射性标记半定量RT-PCR技术检测胃癌病人癌组织、非癌性粘膜组织及外周血各细胞亚群中细胞因子及T细胞受体亚家族mRNA的表达. 结果进展期胃癌外周血CD8+ T细胞中的增殖性T细胞克隆数低于早期胃癌(P=0.05).有淋巴结转移病例外周血CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中的增殖性T细胞克隆数较无转移组明显减少(P=0.00017、P=0.016).有淋巴结转移病例的癌组织,其CD8+ T细胞中IL-6、IL-8、TNF-α和CD4+ T细胞中IL-4 mRNA的水平(0.43±0.17、0.42±0.11、0.18±0.05、0.08±0.03)均较非癌性粘膜组织中的(0.08±0.02、0.17±0.05、0.08±0.03、0.01±0.00)增高(P=0.040、P=0.020、P=0.017、P=0.034);而无淋巴结转移病例的癌组织与非癌性粘膜组织中各细胞因子的表达均未发现统计学差异. 结论胃癌病人T细胞受体库及细胞因子表达与胃癌进展及转移相关,进展期胃癌及发生转移的病例免疫系统受到抑制.
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广西壮族IgA肾病患者的TCRCα-560C/T基因多态分布的临床分析
目的 研究广西壮族IgA肾病患者的TCRCα-560 C/T基因多态性,并探讨其与IgA肾病的关系.方法 选择广西壮族IgA肾病患者(观察组)109例和正常健康壮族体检者(对照组)133例.采用PCR-RFLP法和PCR产物直接测序法对其TCRCα-560 C/T基因多态性进行分析.结果 两组基因型及等位基因频率比较,差异无统计学意义(P＞0.05).TCRCα-560 C/T基因型分布频率与性别、24h尿蛋白、是否存在肉眼血尿无关,差异无统计学意义(P＞0.05).而有无感染诱因和是否高血压有关,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 广西壮族IgA肾病患者与其TCRCα-560 C/T基因多态分布并无相关性,但是TCRCα-560 C/T基因多态分布可能与广西壮族IgA肾病患者感染诱因、高血压发生率有关.
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慢性乙型肝炎患者CD8+T细胞TCR-Vβ基因CDR3区克隆化特征的研究
目的:检测慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血T细胞TCR-Vβ基因CDR3的克隆化特征.方法:选择20例慢性乙型肝炎患者设为观察组;选择20例健康体检者设为对照组,采用多引物巢式PCR法两步扩增22个TCR-Vβ基因亚家族,高分辨率琼脂糖凝胶电泳法定性检测两组研究对象的PCR产物的克隆化特征.结果:CHB患者CDs+T细胞TCR-Vβ1、Vβ3、Vβ9、Vβ14出现优势增生.结论:CHB患者外周血CD8+T细胞Vβ1、Vβ3、V9、Vβ14存在克隆性增生.
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狼疮性肾炎患者T淋巴细胞受体Vβ的表达及克隆聚集性
目的检测活动性狼疮性肾炎(LN)患者外周血和肾组织内浸润T淋巴细胞受体(TCR)基因亚家族的限制性取用,以探讨体内自身反应性T细胞克隆存在的证据.方法用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法分析18例活动性LN患者和12名正常对照者的T细胞受体Vβ亚家族的部分基因表达.结果活动性LN患者外周血T淋巴细胞受体Vβ8 基因表达明显高于正常对照组(0.67±0.11 vs 0.36±0.03, P<0.001), 肾活检组织中浸润淋巴细胞Vβ8 基因的表达也明显高于TCR Vβ1、TCR Vβ11、TCR Vβ20这些TCR Vβ家族的其他成员(P<0.001),并呈现出以TCRVβ8为优势克隆的T细胞的大量增殖和聚集.结论在LN的自身免疫性损伤中,存在具同一特征(TCR Vβ8)自身反应性T细胞的克隆聚集、增殖,这一发现提示其在LN中可能具有致病作用.
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T细胞受体V β链基因限制性取用与哮喘患者的关系
目的探讨T细胞受体β链可变区(TCR V β)受体谱限制性取用与哮喘的相关性.方法采用荧光标记半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),借助377 DNA自动测序仪分析36例哮喘患者外周血TCR V β基因取用格局的变化,通过变性聚丙酰胺凝胶电泳及单链构象多态性分析(SSCP),对哮喘患者优势取用的TCR V β基因家族进行基因片段重组长度及碱基差异分析.结果 TCR V β 8在哮喘患者以及其中对屋尘螨过敏者外周血中被优势取用的次数(13/36、10/24)与正常对照组(1/16)比较 ,差异有显著性(P=0.023 0、0.014 7);TCR V β 5.1在屋尘螨过敏哮喘者外周血中被优势取用的次数(10/24)与正常对照组(1/16)比较,差异有显著性(P=0.018 6).值得注意的是,36例哮喘患者中有2例豚草过敏者均优势取用了V β 1.同时发现被哮喘患者优势取用的TCR V β基因家族在正常人中均为多克隆扩增,同时哮喘患者的外周血中大多数亦为多克隆扩增,但有5例哮喘患者V β 8为寡克隆扩增,出现限制性取用.结论 TCR V β 8 、5.1 基因片段可能和哮喘患者屋尘螨过敏有关,哮喘患者的外周血TCR V β基因家族呈寡克隆扩增趋势 .
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特异T细胞免疫与肺癌
特异性T细胞免疫是机体抗肿瘤和抗病毒感染等的重要防御能力.在肿瘤患者中,T细胞免疫的强弱与肿瘤的发生发展和预后密切相关,深入了解其细胞免疫特点,对于预测预后和设计相应的免疫治疗方案有重要意义.
