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脊髓灰质炎病毒三类检测方法的灵敏度比较
目的 对三种脊髓灰质炎病毒检测方法的灵敏度进行比较.方法 将Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰病毒标准株(TR株),从1×101倍系列稀释至1×107倍.选用三类方法对制备的脊灰病毒稀释液系列进行检测,比较不同检测方法的灵敏度,三类方法分别为:RD和L20B细胞分离脊灰病毒、肠道病毒通用引物EV1/EV2和脊灰病毒特异性引物UC11/UG1分别进行RT-PCR检测脊灰病毒核酸、三种商业性肠道病毒Realtime RT-PCR检测试剂盒检测脊灰病毒核酸.结果 RD和L20B细胞分离脊灰病毒的检测限可达脊灰病毒标准株的104倍稀释度;基于肠道病毒通用引物(EV1/EV2)和脊灰病毒通用引物(UC11/UG1)的两种普通RT-PCR检测限分别为103、102倍稀释度;达安、金豪、基因格三种商业性实时荧光RT-PCR试剂盒的检测限分别为:101、103、104倍稀释度.结论 RD和L20B两种细胞分离脊灰病毒的灵敏度并不亚于现有的核酸检测方法.目前部分商业性的肠道病毒通用型核酸检测试剂盒主要针对手足口设计,对脊灰病毒的检测灵敏度反而不够,应慎重选用.
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Caveolin-1mRNA及蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及其与Cyclin-D1、P16的相关性研究
目的 研究小窝蛋白1(Caveolin-1)mRNA及蛋白在食管癌及癌旁正常食管黏膜中的表达及其意义,进一步探讨Caveolin-1与食管癌组织中细胞周期素-D1 (Cyclin-D1)、P16及临床病理学指标的相关性.方法 收集食管鳞癌及对应癌旁组织标本90例,分别采用RT-PCR、免疫组化方法检测Caveolin-1 mRNA及蛋白的表达情况,进一步分析Caveolin-1与食管癌组织中Cyclin-D1、P16及临床病理学指标的相关性.结果 Caveolin-1 mRNA及蛋白在食管癌中的表达均高于食管癌旁组织中的表达(P＜0.05),且C aveolin-1 mRNA的表达与Cyclin-D1和淋巴结转移有关.结论 Caveolin-1在食管癌中高表达,可能与食管鳞癌的发生、发展以及浸润转移有关.
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2009～2011年北京市石景山区手足口病流行特征分析
目的 了解2009 ～ 2011年北京市石景山区手足口病流行特征,为手足口病防控提供科学依据.方法 采用描述性流行病学方法对数据进行分析.结果 2009～2011年石景山区共报告手足口病病例3153例,其中重症病例30例,年平均发病率为172.66/10万.鲁谷街道和苹果园街道发病数和重症病例多,5～8月为发病高峰.病例中男性多于女性,以散居儿童和幼托儿童为主,5岁以下儿童占87.50％.病原学监测结果显示,2009年手足口病病原以Cox A16为主,2011年转变为以EV71为主.结论 石景山区手足口病发病有明显的地区、季节、年龄、性别和职业特征,病原以Cox A16和EV71为主.做好重点地区、重点时段、重点人群的防控工作尤为重要.
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GPC3mRNA在原发性肝细胞癌患者外周血的表达及临床意义
目的:探讨了GPC3mRNA在肝细胞癌(HCC)患者外周血的的表达和临床意义.方法运用巢式RT-PCR技术检测19例根治性原发性肝细胞癌患者术前GPC3mRNA和术后7天GPC3mRNA水平.结果在行根治性外科治疗的19例肝癌患者中,10例(52.6%)术前检出GPC3mRNA,其中5例术后7天复查仍持续阳性(A组);5例患者术后7天检测呈阴性(B组);其余9例围手术期检测均为阴性(C组).在术后长10个月的随访期间,转移复发的病例是A组3例(3/5)、B组2例(2/5)、C组4例(4/9).术前GPC3mRNA的检出和术后的转移复发无显著相关性(P>0.05).A组的复发率与B、C组有显著差异(P=0.016/2),术后外周血GPC3mRNA的检出和术后转移复发有显著相关性(P<0.05).结论术前GPC3mRNA的检出和术后复发无显著相关性.但术后GPC3mRNA的检出是早期发现肝癌术后复发、评估预后一项可信的指标.
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贫铀对大鼠肺诱导型一氧化氮合酶基因表达的影响
目的通过研究贫铀(depleted uranium,DU)颗粒气管灌注大鼠肺中的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达的变化,揭示DU对肺组织的毒性作用机制.方法Wistar大鼠20只随机分为4组,1个对照组,3个染铀组,剂量分别为1、3、5 mg/ml气管灌注不同剂量DU颗粒3个月后,将大鼠肺组织iNOS mRNA进行RT-PCR并通过凝胶成像分析系统扫描RT-PCR产物,用内参半定量法分析iNOS mRNA的变化.结果对照组无iNOS mRNA表达,各染铀组扩增产物电泳条带吸光度值(A)明显高于对照组(P<0.05);其中1、3 mg组产物电泳条带A值逐渐增高,3 mg组到达高峰,5 mg组产物电泳条带A值明显低于1、3 mg组(P<0.05).结论DU颗粒气管灌注能使大鼠肺组织iNOS mRNA表达水平升高,并与DU剂量呈正相关.DU剂量增高到一定程度则使iNOS mRNA表达水平降低,这种变化可能与DU化学毒性和辐射损伤的复合作用有关.
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2,5-己二酮对大鼠神经丝mRNA水平的影响
目的 探讨2,5-己二酮(HD)对神经组织神经丝(NF)mRNA水平的影响.方法 Wistar雄性大鼠27只,分为3组(1个对照组,2个染毒组),每组9只,经腹腔染毒,剂量分别为200和400 mg/(kg·d),连续8周.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测坐骨神经、脊髓、大脑组织中高分子量NF(NF-H)、中分子量NF(NF-M)和低分子量NF(NF-L)mRNA水平.结果 200和400 mg/kg剂量染毒后,坐骨神经NF-L mRNA水平分别为对照组的126%(P＜0.05)和152%(P＜0.01),NF-M mRNA未检测到,NF-H mRNA未发生明显变化;在脊髓、大脑组织中,NF-L mRNA下降为对照组的34%～54%(P＜0.01),NF-M mRNA未发生明显变化,400 mg/kg剂量组中NF-H mRNA下降为对照组的85%(P＜0.05).结论 HD染毒导致大鼠神经组织中NF亚单位mRNA水平的变化.
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GST-π基因cDNA真核表达载体构建的研究
目的构建人GST-π基因cDNA真核表达载体pEGFP-N1-π,为进一步开展GST-π基因功能和毒理学研究提供试验工具.
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磷酸三邻甲苯酯对母鸡中枢神经组织神经丝蛋白表达的影响
目的观察磷酸三邻甲苯酯(tri-ortho-cresylphosphate,TOCP)诱发迟发性神经毒性(organophosphate ester induced delayed neurotoxcity,OPIDN)母鸡中枢神经组织细胞骨架蛋白神经丝亚单位蛋白质水平和mRNA水平的变化,进一步探讨OPIDN发生的分子机制.
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登革病毒实时荧光PCR快速检测技术研究
目的 建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒.方法 利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3'端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法.并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增.结果 RT-PCR检测8份临床血清标本,2份阳性,阳性率为25%.实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0.17pg/μl,病毒液灵敏度为10-5 TCID50,与乙脑病毒无交叉反应,检测8份临床血清标本,5份阳性,阳性率为62.5%.从RNA提取到检测结果仅需4 h.结论 Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强,可作为登革病毒的快速检测方法,应用于登革热的临床早期诊断.
关键词： 登革病毒 RT-PCR Taqman MGB 实时 PCR -
A型流感病毒NP基因核酸疫苗的构建与体外表达鉴定
目的构建A型流感病毒核蛋白核酸疫苗,研究核酸疫苗主动免疫保护效应.方法从A型流感病毒逆转录获得NP基因,与表达载体pSECTAG 2/Hygro A构建核酸疫苗,采用脂质体转染法转染VERO细胞,经ELISA鉴定,A型流感病毒NP基因核酸疫苗在VERO细胞中得到了表达.结果结果显示,在转染后36h得到大化表达,其A450达到0.382.在36到60h时间范围内,NP蛋白表达量基本没有变化(在48h和60h的A450分别为0.385和0.387).结论成功构建了A型流感病毒核蛋白核酸疫苗,为进一步研究该疫苗体内实验奠定了基础.
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补锌糖尿病大鼠差异显示新基因片段的克隆鉴定及组织表达
目的 克隆补锌糖尿病大鼠差异显示的新基因片段并检测其在各组织中的表达分布.方法 对前期研究中分离到的与补锌有关的糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序,同源性分析,对发现的2条新基因(2#差异显示片段及6#差异显示片段)设计特异性引物,进行RT-PCR检测,以观察新基因在各组大鼠肝脏中的表达变化,并检测新基因在不同组织中的表达情况.结果 经克隆、测序、同源性分析,在GenBank中未找到与2#差异显示片段及6#差异显示片段高同源性的序列,确定2#及6#差异显示片段为新的基因片段;2#及6#新基因片段在糖尿病对照组、糖尿病补锌组的表达量均低于正常对照组,糖尿病补锌组的表达量高于糖尿病对照组(P＜0.05);2#新基因片段在大脑及胰腺中表达量较高,在肾脏中表达量较低,在心肌、骨骼肌、胸腺中无表达.6#新基因片段在心肌、骨骼肌、大脑、肾脏、胰腺中均有表达,但在胸腺中无表达;2#及6#新基因片段被GenBank收录,接收号分别为AY952968、AY959770.结论 分离并克隆了2条与补锌有关的糖尿病大鼠差异显示的新基因片段,经RT-PCR检测其在各组大鼠肝脏及其它各组织中表达分布后,在GenBank上成功登录.
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荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒
目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法.方法 根据A型流感M2基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验.结果 A型流感病毒检测反应的灵敏度为2.56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.999,扩增效率为108.5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性.结论 本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测.
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miR-295在前列腺癌组织及细胞株中的表达及意义
目的 探讨miR-295在前列腺癌组织及细胞株中的表达及意义.方法 选取我院前列腺癌样本65例,良性组织样本18例,前列腺癌细胞株PC-3、DU145及正常细胞株RWPE-1正常培养,提取组织miRNA,逆转录成CDNA,QRT-PCR检测miR-295在前列腺癌组织及细胞株中的表达.结果 同正常细胞株RWPE-1相比,PC-3、DU 145中miR-295的表达均下调,miR-295在前列腺癌组织中的表达显著低于良性组织.结论 miR-295在前列腺癌组织及细胞株中表达下调,可能为抑癌基因.
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腺病毒介导的miR-295对前列腺癌细胞增殖的抑制作用
目的 观察腺病毒介导的miR-295对前列腺癌细胞增殖的抑制作用.方法 前列腺癌细胞系PC-3细胞培养后分实验组及对照组,实验组以腺病毒为栽体将miR-295转染,对照组常规培养,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果 实验组转染24、48、72 h miR-295 mRNA的表达与对照组比较明显增强,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组细胞抑制率明显增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 miR-295能够显著地抑制PC-3细胞的增值,miR-295具有抑制前列腺癌细胞增殖的生物学功能,可能成为新的治疗靶点.
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半定量RT-PCR检测肺癌组织S100C的表达及其原核表达载体的构建和鉴定
目的 分析S100C基因在肺癌组织中的表迭情况,并构建S100C蛋白的原核表达栽体.方法 以β-actin为内参,运用半定量RT-PCR技术检测26例肺癌组织和配对癌旁组织S100C基因mRNA的表达水平;运用RT-PCR技术克隆S100C基因的cDNA全长片段,与PET30a连接构建原核表达栽体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,进行阳性克隆筛选鉴定.结果 肺癌组织中S100C mRNA表达水平低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05).成功构建了S100C原核表达载体,序列同源性达100%.结论 S100C基因表达下调在肺癌的发生中可能起重要作用;成功构建了S100C原核表达裁体.
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脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠成骨细胞Pax1表达的影响
目的 探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对小鼠成骨细胞骨骼发育相关基因Pax1表达的影响.方法 麻醉后取胎鼠的顶骨,采用改良的组织块培养法体外培养小鼠成骨细胞,碱性磷酸酶法鉴定成骨细胞,将浓度为100、200、500、1000和1500mg/L的DON分别作用于对数生长期的成骨细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测DON对成骨细胞增殖的作用.半定量RT-PCR和Western blotting检测不同剂量DON对体外培养小鼠成骨细胞Pax1 mRNA和蛋白质表达的影响.结果 培养的细胞鉴定为成骨细胞,不同浓度DON能降低小鼠成骨细胞的增殖速度,并可增加小鼠成骨细胞Pax1 mRNA和蛋白质表达,随着DON浓度增加,小鼠成骨细胞Pax1基因表达增多越显著.结论 DON促进小鼠成骨细胞Pax1基因的表达,进而影响骨骼的发育.
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脂多糖诱导小鼠急性肺损伤中细胞因子释放和SP-A表达
目的 探讨小鼠急性肺损伤中细胞因子及SP-A释放的规律.方法 LPS诱导小鼠急性肺损伤模型,ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-α和SP-A,RT-PCR方法检测肺组织中HMGB1.结果 肺泡灌洗液中TNF-α明显增加,在LPS刺激后4 h达高峰,SP-A表现为先减少,然后有所增加;肺组织中HMGB1mRNA在LPS刺激后12 h表达增加.结论 SP-A的释放存在反馈调节,细胞因子可能参与这一过程.
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脂多糖对小鼠巨噬细胞细胞因子产生的影响
目的 研究脂多糖对小鼠巨噬细胞细胞因子产生的影响.方法 分离小鼠肺泡巨噬细胞,LPS刺激后检测巨噬细胞细胞因子产生情况.结果 巨噬细胞在LPS刺激后TNF-α产生较早,培养上清中TNF-α含量随时间延长逐渐增加,并在12h时达高峰;HMGB1产生较迟,刺激后12 h细胞培养上清中检测到HMGB1含量增加,并一直维持到36 h.结论LPS可促进巨噬细胞产生TNF-α、HMGB1,并具有各自的时间依赖性.
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两种不同的检测方法对80例乙型肝炎病毒血清标志物的结果分析
目的 分析两种不同检测方法对80例乙型肝炎病毒血清标志物的检测结果.方法 选择2013年8月至2015年12月在我院进行诊治的80例乙型肝炎患者作为研究对象,所有患者均抽取空腹静脉血后分离血清标本,采用RT-PCR法检测HBV-DNA情况,采用ELISA法检测HBeAg阳性情况.结果 RT-PCR判定为大三阳45例,小三阳25例,其他10例;RT-PCR判定为HBV-DNA阳性67例,占比83.75％;ELISA法判断阳性70例,占比87.50％,不同方法判断的阳性率对比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 RT-PCR与ELISA法检测乙型肝炎病毒血清标志物都有较好的检测效果,可以对乙型肝炎病毒的传染状况进行检测,有很好的应用价值.
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贝类及其产品中甲型肝炎病毒RT-PCR检测方法的研究
目的:建立一种快速、简便、灵敏的检测贝类中甲型肝炎病毒RT-PCR方法,能够有效防止甲肝病毒的传播和对口岸进口贝类产品的监控.方法:通过对病毒富集的3种方法(大体系PEG8000、小体系PEG6000和小体系PEG8000富集法)、提取RNA的2种方法(Trizol法和试剂盒法)以及RT-PCR检测的2种方法(一步法和两步法)进行比较,确立一种快速检测贝类中甲肝病毒的RT-PCR方法.结果:经比较,采用小体系肠道样本检测比采用全贝检测的富集效果更佳,并比较了小体系PEG8000与PEG6000和大体系PEG8000对病毒富集的效果,回收率分别为13.3%、7.5%、10.0%;对HAV总RNA的2种提取方法进行了比较,结果均获得了纯度较高、完整性较好的总RNA,以此为模板采用一步法和两步法进行反转录和PCR反应.经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,从人工污染的阳性样本中扩增得到一段长度为192bp的特异PCR扩增产物.应用本研究建立的RT-PCR方法对大连地区85份贝类及产品进行HAV检测,结果未显阳性,说明样本中不含HAV.整体用时仅为5h.结论:本研究建立的检测HAV的RT-PCR方法灵敏特异、操作时间短,该方法可对贝类及其产品进行确实有效的HAV的检测.
