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健脾解毒方对脾虚肝癌大鼠TCRVβCDR3基因谱系变化的影响
目的 观察健脾解毒方对脾虚肝癌大鼠模型的抗癌作用与T细胞受体β链超变区第3互补决定区(the third complementary-determining region of the variable region of T cell receptorβ-chain,TCRVβCDR3)基因谱系的关系.方法 将大鼠按随机数字法分为空白对照组(正常组,灌胃生理盐水,每日1次),脾虚模型组(脾虚组),肝癌模型组(肝癌组),脾虚肝癌模型组(脾虚肝癌组),健脾解毒方(中药)高、中、低剂量(75.00、37.50、18.75 g/kg灌胃,每日1次)组和胸腺五肽(5 mg/kg,肌肉注射,每周2次)组(西药组),每组8只.采用苦寒泻下法制备脾虚模型,原位移植法制备肝癌模型.基因扫描检测大鼠胸腺、肝、肝癌20个TCRVβCDR3亚家族基因片段谱系.结果 中药中、高剂量健脾解毒方可延缓肝癌的体积增长(P＜0.05),且其肝指数和胸腺指数与正常组相当(P＞0.05).正常胸腺组织和肝组织TCRVβCDR3亚家族数量(20、19)、基因片段数量(220、113)、谱系准高斯分布比例(100％、42.1％)、片段荧光峰面积(6539 ±2 325、1238±439)在各组中均处于高水平.中药中、高剂量组胸腺和肝组织TCRVβCDR3表达接近正常组,西药组、脾虚组和肝癌组居中,脾虚肝癌组差.西药组肝癌组织TCRVβCDR3表达佳.结论 健脾解毒方对肝癌细胞增殖的抑制作用可能与其增强TCRVβCDR3基因谱系表达有关.
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从一例慢性嗜酸性粒细胞白血病发现克隆性增殖T淋巴细胞
利用TCRβV基因指纹图谱分析1例慢性嗜酸粒细胞白血病(CEL)患者的外周血T细胞克隆变化,了解与CEL疾病相关的T细胞受体(TCR)β可变区主要接触抗原的CDR3序列特征.用RT-PCR扩增CEL患者的外周血TCRβV 1-24个家族的基因序列,在变性测序胶上电泳,形成TCRβV基因指纹图谱,切割克隆性增生的电泳条带进行测序分析.结果显示: TCRβV基因指纹图谱在βV13.2家族中的分子量较小处出现一条明显扩增的条带,切割此条带并测序证实为单克隆性T细胞增殖,其CDR3的氨基酸序列为: SFSYEQY,其中SFSY基序为特异性保守序列,其它家族无异常改变.结论:该CEL患者TCRβV13.2家族中出现了单克隆性增殖的T淋巴细胞群,可能是针对CEL恶性肿瘤细胞反应性增生的T细胞克隆.
关键词： 慢性嗜酸粒细胞白血病 克隆性增殖T淋巴细胞 T细胞受体 互补决定区 -
T细胞抗原受体复合体信号转导及其与疾病关系的研究进展
T细胞抗原受体(TCR)是由TCRαβ或TCRγδ组成的异源二聚体,它与CD3分子组成跨膜蛋白复合体结构.抗原在诱导幼稚T细胞或记忆性T细胞进行增殖进而分化成效应细胞时,需要有两个信号刺激,第一信号来自TCR与抗原的特异性结合,第二信号来自抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)表面的协同刺激因子与T细胞表面相应受体的相互作用.TCR通过胞外部分可变区(V区)的互补决定区(CDR)特异性识别结合抗原;胞内部分在CD3、CD4/CD8和CD28等分子的辅助下,将胞外刺激信号经磷脂酶C(PLC)-γ活化途径和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinaes,MAPK)活化途径传递至胞内,使转录因子活化,这一过程称为T细胞活化的信号转导.而这一过程可使T细胞活化而发挥其生物学作用.TCR/CD3复合体介导的信号转导是T细胞活化并发生抗原特异性免疫反应的重要途径,很多疾病的发生都与其信号转导异常有关,因此更深入地了解T细胞信号转导的分子机制显得尤为重要.本文对TCR介导的信号转导途径作了较为系统地阐述,并简要介绍了其异常与几种重要疾病的关系.
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CDR3谱型分析在肿瘤研究中的应用进展
肿瘤特异性T细胞通过其表面T细胞受体(Tcell receptor,TCR)识别肿瘤,进而杀伤肿瘤细胞,其所介导的细胞免疫在机体抗肿瘤免疫应答中发挥极其重要的作用.寻找肿瘤特异性T细胞克隆是当前肿瘤研究领域的热点,而应用广泛、灵敏地寻找肿瘤特异性T细胞的方法是通过基因扫描(Ge-neScan)对TCR互补决定区3(complementary deter-mining region 3,CDR3)谱型进行分析.
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噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体
目的:制备丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)的特异性人源化单链可变区抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍.用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性.其中有30株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱(P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(P24)阳性克隆.提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTAB5E载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区(FR)及互补决定区(CDR)的序列结构.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv.
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原因不明复发性流产患者母-胎界面T淋巴细胞受体β链可变区基因的表达水平和频率
目的 通过分析母-胎界面T淋巴细胞受体(TCR)β链可变区(BV)基因的表达水平和频率,探索T淋巴细胞参与原因不明复发性流产(RSA)发生的作用机制.方法 采集18例原因不明RSA患者(研究组)和4l例正常早孕人工流产妇女(对照组)的蜕膜组织,基因组扫描方法 检测两组患者蜕膜内TCR BV基因的表达,分析TCR BV基因表达水平和频率的分布与原因不明RSA的关系.结果 (1)研究组患者蜕膜组织中TCR BV基因的表达水平,BV19为0.029±0.031,高于对照组(0.013±0.010),而BV5.2的表达水平(0.040±0.035)低于对照组(0.067±0.052),两组间分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).其余各家族的表达水平两组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).(2)研究组TCR BV家族中表达频率高的前4位为BV2、BV6、BV7和BV3,其表达频率分别为66.7%、66.7%、66.7%和61.1%,均超过了50%.研究组中,BV15、BV19和BV20的表达频率分别为33.3%、38.9%和33.3%,均高于对照组(分别为7.3%、14.6%和7.3%);BV4和BV7的表达频率分别为33.3%和66.7%,均低于对照组(分别为65.9%和92.7%),两组间分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).其余各家族的表达频率两组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 原因不明RSA患者蜕膜组织内的TCR BV家族表达存在差异,表达频率变化显著的TCR BV家族可能导致免疫有关的流产发生的易感性.
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乳腺癌患者T细胞受体基因重排及CDR3区序列分析
目的 分析乳腺癌转移淋巴结穿刺标本中T细胞受体(TCR)β链克隆性基因重排及互补决定区3(CDR3)区序列.方法 应用RT-PCR扩增2例反应性增生淋巴结及3例乳腺癌转移淋巴结T细胞24个TCR Vβ亚家族的CDR3基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物进行测序.结果 乳腺癌转移淋巴结T细胞中TCR存在限制性取用,仅表达3～5个Vβ亚家族.增生的T细胞存在克隆性特点,增生形式包括寡克隆及多克隆.CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列.结论 乳腺癌转移淋巴结中存在T细胞克隆性增生,其TCRVβ呈限制性取用,不同T细胞克隆的CDR3序列不同.
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乳腺癌患者TCR BV、BJ限制性取用及序列分析
目的 分析乳腺癌TCR BV、BJ亚家族限制性取用及序列分析.方法 选取乳腺癌转移淋巴结,提取RNA后反转录,多重PCR扩增TCR β全长序列,构建重组质粒并测序,利用网上TCR资源分析序列.结果 2例患者共获得5个TCR β链全长序列.BV亚家族分别限制性取用BV 2、BV 14、BV29S1,BJ亚家族分别限制性取用BJ1S1、BJ2S2、BJ2S3、BJ2S5.序列分析增生T细胞克隆CDR3区有不同的氨基酸序列.结论 乳腺癌患者TCR BV、BJ亚家族具有限制性取用,不同T细胞克隆的CDR3序列不同.
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外周T细胞淋巴瘤TCR基因重排及CDR3谱型分析
目的 分析外周T细胞淋巴瘤穿刺标本中T细胞受体(TCR)β链克隆性基因重排及互补决定区3(CDR3)谱型.方法 应用RT-PCR扩增TCR V β 24个亚家族的CDR3基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物测序分析其CDR3序列.结果 4例淋巴瘤患者TCR表达受到明显抑制,仅表达1～4个Vβ亚家族.所有患者均存在1个或多个Vβ亚家族的克隆增生T细胞,增生形式包括单克隆、双克隆及寡克隆增生趋势.CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列.结论 外周T细胞淋巴瘤患者存在T细胞克隆性增生,其TCR V β呈限制性取用,不同克隆T细胞具有不同的CDR3谱型.
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重症肌无力患者循环T细胞受体β链3号互补决定区的研究
目的研究重症肌无力(MG)患者循环T细胞受体(TCR)β链基因亚家族的优先表达,以及β链3号互补决定区(CDR3)基因片断的长度谱型特征,以探讨MG患者体内是否存在病理性T细胞的单克隆或寡克隆增殖.方法收集64例初诊MG患者和16名健康献血者外周静脉血,通过反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增样本中不同亚家族含CDR3的大片段,分析TCR Vβ6、8、12、15亚家族的表达,用长度谱型技术研究CDR3谱型特征.结果 64例MG患者中,41例优先表达TCR Vβ6、8、12、15中1～2种亚家族,且部分为单克隆或寡克隆性T细胞增殖,另一部分为多克隆增殖;而16名健康对照外周血表达TCR Vβ6、8、12、15中3～4种亚家族,且全部为多克隆分布.结论TCR Vβ6、8、12、15亚家族在MG患者中呈优势表达、优先表达或倾斜性分布,并出现T细胞的克隆性扩增(单克隆或寡克隆),提示这些亚家族参与MG的致病.
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慢性无症状乙型肝炎病毒携带者外周血T细胞受体谱型分析
目的分析慢性无症状乙型肝炎病毒携带者(AsC)外周血T细胞TCR-β链CDR3谱型的变化,了解AsC患者T淋巴细胞克隆性增生情况.方法利用逆转录-聚合酶链反应扩增T细胞受体(TCR)各BV家族CDR3区基因,利用谱型分析技术比较各家族CDR3长度分布,了解AsC T淋巴细胞克隆性增生情况.对单克隆或寡克隆性增生家族的PCR产物进行序列测定和氨基酸序列分析,进一步了解克隆增生T淋巴细胞的均一性.结果4名正常人的TCR CDR3谱型均呈现正态分布,而9例AsC中均存在不同BV家族的T细胞克隆性增生,CDR3区直接测序结果证实增生的T细胞克隆具有不同长度和序列的氨基酸序列.结论AsC外周血T淋巴细胞存在克隆性增生,且增生的T淋巴细胞不具有均一性.
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快速分析和鉴定肿瘤抗原研究
γδT细胞是近10多年来人们新认识的一种T细胞亚群,尽管其在抗原识别及其对多数肿瘤细胞的细胞毒作用中所独有的特性[1]而受到越来越多学者的关注,但目前尚未发现可用于肿瘤免疫治疗靶点的γδT细胞所识别的肿瘤抗原.如何发现和快速分析潜在的肿瘤抗原呢?研究表明γδT细胞是以MHC非限制性直接识别的方式识别抗原的,并且T细胞受体(TCR)与抗原之间特异性反应部位是抗原表位,而与抗原表位特异性结合的是TCR的互补决定区3(complementary determining regions 3,CDR3),同时,以surface plasmon resonance(SPR)biosensor为检测仪器的biomolecular interaction analysis(BIA)技术为生物分子之间相互作用,尤其是膜分子间的相互作用提供了一个不需标记的实时检测平台[2].为此,我们利用SPR biosensor,用卵巢上皮癌(ovarian epithelium carcinoma,OEC)肿瘤组织浸润的γδT细胞(tumor infiltrating γδT lymphocyte,γδTIL)TCRδ链的CDR3短肽快速分析和鉴定其所识别的肿瘤抗原肽.
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强直性脊柱炎患者外周血T细胞受体β链可变区基因谱系多态性的初步研究
目的 探讨强直性脊柱炎(AS)患者外周血T细胞受体β链可变区互补决定区3(TCRBV CDR3)谱系多态性,为AS免疫发病机制研究提供实验依据.方法 采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增AS患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞TCR BV的26个亚家族CDR3,经免疫扫描谱型技术分析TCR BV CDR,3的谱系多态性情况.结果 20例活动期AS患者TCR BV CDR3扫描谱型均出现非正态的异常峰型,包括单峰、寡峰/寡峰趋势、偏峰和不规则异常峰型.其中有18例患者部分亚家族出现寡克隆/寡克隆趋势增生,有1例患者BV16和BV18的2个亚家族出现单克隆增生.5名健康对照PBMC TCR BV CDR3谱型绝大多数呈高斯分布.结论 AS患者外周血TCR BV CDR3谱系具有显著多态性和谱系漂移特点,进一步表明T细胞在AS免疫发病机制中扮演重要角色.单/寡克隆增生的T细胞有可能是AS发病中的自身反应性T细胞.
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抗病毒治疗对CHB患者外周血TCRβ链CDR3谱系的影响
目的:分析慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒治疗前后T淋巴细胞受体(TCR) β链各家族互补决定区3(CDR3)谱系的变化,了解抗病毒治疗前后T细胞应答的变化.方法:采用荧光定量 PCR(FQ-PCR)溶解曲线法对11例CHB患者抗病毒治疗前后外周血单个核细胞(PBMC) T淋巴细胞受体β链可变区(TCR BV) 基因各家族CDR3谱系进行分析,了解抗病毒治疗前后T细胞应答的变化.分析TCR CDR3谱系与CHB患者血清病毒载量的关系.结果:11例CHB患者抗病毒治疗后多个TCR CDR3谱系均出现了不同程度偏移.低病毒载量组(HBV DNA≤104拷贝/ml) 治疗后谱型偏移率显著高于高病毒载量组(HBV DNA≥105拷贝/ml).结论:CHB患者抗病毒治疗后单寡谱型偏移率与治疗前血清HBV DNA的水平相关.
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B细胞BCR CDR3受体库的高通量测序分析概况
B细胞是介导机体体液免疫应答的主要细胞群,其识别、结合抗原主要依赖互补决定区(CDR),它决定着抗体的特异性,而互补决定区3(CDR3)比CDR1、CDR2更具多样性[1],通过观察机体B细胞BCR CDR3受体库的多样性、重叠率的大小、CDR3区的基因/氨基酸组成特征、各亚家族的偏向取用等,可以观察生理及病理状态下机体免疫的相关情况.高通量测序能对一个物种的转录组和基因组进行全貌、细致的分析,目前在国外已开展并应用于B细胞BCR CDR3受体库测序.
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免疫组库及高通量分析技术在原发性胆汁性胆管炎中的研究进展
原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种器官特异性自身免疫性肝脏疾病,发病机制尚不明确.T淋巴细胞受体(TCR)和B淋巴细胞受体(BCR)互补决定区3氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性,构成容量巨大的抗原识别受体库,即免疫组库.采用第二代测序技术结合多重PCR或扩增子救援多重PCR技术研究PBC患者免疫组库特征是近年的研究热点,目前发现PBC存在特异性CD4+T淋巴细胞大量克隆扩增,B淋巴细胞克隆多样性、体细胞高频突变及类别转换现象明显减少,熊去氧胆酸治疗后克隆多样性增加.上述发现有待通过大范围体内和体外试验及不同的免疫组库研究策略进行验证.
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抗体药物的设计及其研究进展
先进的展示技术为重组抗体的筛选和改造提供了有效而灵活的方法.通过展示技术可以获得更适用于诊断和治疗的优化分子,而后者不能直接通过动物免疫接种的方式获得.展示技术可通过自动化或与新一代测序技术和阵列技术联合应用得到进一步提高,形成高通量筛选技术平台,用于筛选多种对应大量基因组编码靶标的抗体.从头设计抗体已开始成为制造新抗体的一种策略,但仍具有技术挑战性.然而,抗体-抗原结构数据库的不断增加和计算工具的不断开发,都表明这些挑战是可以克服的.预计未来以物理分子模拟知识为基础的计算方法,将成为提高抗体设计准确性和成功性的主要驱动力.
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慢性乙型肝炎患者外周血及肝组织中T淋巴细胞受体β链互补决定区3谱系分析
目的 分析慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血及肝组织T淋巴细胞受体(TCR)β链各家族互补决定区3(CDR3)谱系的变化,了解CHB患者T淋巴细胞克隆增生的情况.方法 采用荧光定量PCR(FQ-PCR)溶解曲线法分析4例健康对照者及11例CHB患者外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织T淋巴细胞受体β链可变区(TRBV)基因各家族CDR3谱系漂移情况,比较11例CHB患者TCR β链可变区各家族外周血及肝组织CDR3谱系漂移异常率.率的比较采用卡方检验.结果 11例CHB患者PBMC及肝组织TRBV各家族CDR3溶解曲线谱型图出现数量不等、形态不一的单峰、寡峰、偏峰及极低水平或缺失等现象,肝组织TRBV家族CDR3的谱系漂移异常率明显高于外周血的异常率(x2=23.246,P＜0.01),在同一患者的外周血及肝组织中发现部分相同的TRBV亚家族表达,TRBV13.1、BV17和BV22同时被多例CHB患者的外周血及肝组织限制性取用.结论 CHB患者PBMC及肝组织中的T淋巴细胞均存在不同程度的克隆增生,部分TRBV亚家族被多例CHB患者外周血及肝组织同时限制性取用.
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基于互补决定区移植的单抗人源化进展
人源化单克隆抗体被日益广泛地应用于癌症等重大疾病的靶向治疗.互补决定区(CDR)移植使人源化单抗的大规模制备得以实现.文章就CDR移植的策略和进展进行综述.
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寻常性银屑病患者外周血T细胞受体β可变区优势表达分析
目的 分析寻常性银屑病患者外周血中T细胞受体β可变区(TRBV)的优势表达状况,探讨其在银屑病发病中的作用.方法 以人功能性TRBV家族设计33个上游引物,共同的T细胞受体β恒定区(TRBC)基因设计下游引物,在T细胞受体α恒定区(TRAC)设计引物作为内参,分析寻常性银屑病患者、正常人对照外周血样本各10例,检测各PCR反应管荧光强度,以大于正常人外周血T细胞相应TRBV基因相对表达量(-x+3s)筛选TRBV优势表达基因家族.结果 TRAC扩增产物阈值循环数(Ct)值集中于21～24,银屑病组TRBV2扩增产物Ct与TRAC产物Ct差值平均数银屑病患者为2.98,TRBV5-7为3.24,TRBV6-6/6-9为2.52,TRBV12为2.04,TRBV24为3.56,TRBV29为4.12,其表达与正常人比较均明显增高(P值均＜0.05),其中TRBV6-6/6-9、TRBV12、TRBV29在银屑病患者呈优势表达.结论 银屑病患者外周血TRBV基因家族存在优势表达,可能在银屑病T细胞异常免疫反应中起重要作用.
