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温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L表达的影响
目的 观察温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤的小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L (Cathepsin L,CatL)表达的影响.方法 体外培养小鼠永生系足细胞,将其分为正常对照组、模型组、地塞米松组、10％温阳活血利水方血清组(简称10％中药血清组)、20％中药血清组及中药血清空白对照组.正常对照组以培养液孵育足细胞24 h,模型组应用嘌呤霉素45 mg/L作用于足细胞24 h;在模型组干预基础上,地塞米松组加用地塞米松1 μmol/L共孵育24 h;10％及20％中药血清组分别加用10％及20％的中药血清共孵育24 h,并设中药血清空白对照组(单用中药血清孵育24 h).采用细胞免疫荧光染色观察各组足细胞CatL 及其底物Synaptopodin荧光表达改变;异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔毒环肽(phalloidin)染色标记足细胞纤维肌动蛋白(F-actin),并采用F-actin外周环评分(cortical F-actin score,CFS)半定量分析足细胞F-actin 分布.结果 与正常对照组比较,模型组足细胞Synaptopodin表达水平明显降低,CatL表达水平升高,Factin排列紊乱,逐渐向细胞外周分布形成F-actin环,CFS评分明显升高(P＜0.01).与模型组比较,地塞米松组、10％、20％中药血清组足细胞Synaptopodin蛋白表达升高,CatL表达水平降低,CFS评分亦降低(P ＜0.05,P＜0.01).与地塞米松组比较,10％中药血清组Synaptopodin表达降低(P＜0.05),20％中药血清组CFS评分明显降低(P＜0.05).结论 温阳活血利水方能上调嘌呤霉素损伤的足细胞Synaptopodin表达,下调CatL表达水平,减少骨架蛋白F-actin的重构,有助于稳定足细胞actin骨架,改善足细胞融合.
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大鼠脊髓微血管内皮细胞的分离培养与鉴定
脊髓微血管内皮细胞(spinal cord microvascular endothelial cells,SCMECs)参与构成血脊髓屏障,其功能变化与多种脊髓相关疾病相关.目前分离SCMECs的文献很少.本研究拟基于分离多种原代内皮细胞的经验[1-2],建立分离纯化SCMECs的方法.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂:DMEM(高糖)、胎牛血清(FBS)、Ⅱ型胶原蛋白酶、双抗、庆大霉素、谷氨酰胺和l×PBS(北京协和医学院细胞中心);牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、胶原蛋白酶/分散酶(collagenase/dispase)(Roche公司);嘌呤霉素(Sigma公司);内皮细胞培养基(ECM)(Scien Cell公司);兔抗大鼠yon Willebrand factor(vWF)抗体(SantaCruz公司);抗GFAP抗体和抗α-SMA抗体(Abcam公司);FITC标记和TRITC标记的二抗(北京中衫金桥公司).
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杜氏利什曼原虫遗传转化中潮霉素及嘌呤霉素适宜浓度的筛选
通过基因打靶构建基因缺失株是利什曼原虫分子水平研究的有效方法,而筛选特定的转化体是研究成功的第1步.筛选转化体常用抗生素筛选法.本文通过观察潮霉素和嘌呤霉素不同质量浓度对杜氏利什曼原虫四川分离株的生长抑制情况,确定了在抗性基因转化的阳性克隆筛选中,潮霉素及嘌呤霉素的适宜筛选浓度分别为32和10μg/Ml.本实验的结果为下一步筛选杜氏利什曼原虫基因缺失株提供了可靠的实验依据.
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嘌呤霉素肾病鼠足突形态改变的形态计量学研究
目的:定量研究嘌呤霉素肾病大鼠模型从建立到恢复过程中,足突的形态变化规律.方法:用透射电镜摄片,图像分析仪分析并应用形态计量学的方法,研究了33例大鼠(嘌呤霉素注射实验组及生理盐水注射对照组)不同时间点的足突形态变化.结果:注射嘌呤霉素后,足突表现出由变宽到融合又逐渐恢复的形态变化,形态计量学的结果进一步表明,各时间点实验组足突宽度,体积密度,比表面与对照组相比有高度显著性差异(P＜0.01),表面积密度在2--15天与对照组差异显著(P＜0.05).且实验组内相邻的不同时间点间比较,足突宽度、体积密度、表面积密度、比表面差异均具有高度统计学意义(P＜0.01).结论:形态计量学对嘌呤霉素肾病足突形态研究,定量表现出足突由变宽到融合以后逐渐恢复的动态过程,为今后对功能与分子水平的研究提供早期准确的实验形态依据.
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钙离子载体A23187联合嘌呤霉素激活行卵母细胞质内单精子注射后未受精卵母细胞的研究
目的观察钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对卵母细胞质内单精子注射(ICSI)后未受精卵母细胞的激活作用.方法将体外成熟(IVM)-ICSI和常规ICSI后未受精卵母细胞,按行ICSI后体外培养的时间,分为IVM-ICSI 22 h组(33个)、IVM-ICSI 44 h组(18个)、ICSI 44 h组(37个)、ICSI 68 h组(25个),分别采用钙离子载体A23187联合嘌呤霉素进行激活处理.应用荧光原位杂交(FISH)技术,对来源于双原核合并第二极体合子的激活胚胎进行性染色体分析.结果钙离子载体A23187联合嘌呤霉素能激活行ICSI后22～68 h未受精的卵母细胞.其中IVM-ICSI 22 h组卵母细胞激活率为88%(29/33)、总卵裂率为62%(18/29)、4细胞阶段胚胎发育率为28%(5/18),1个胚胎发育到桑椹胚阶段;而IVM-ICSI 44 h组、ICSI 44 h组、ICSI 68 h组的未受精卵母细胞激活率分别为56%(10/18)、65%(24/37)、52%(13/25);总卵裂率分别为20%(2/10)、42%(10/24)、46%(6/13),仅ICSI 44 h组有1个胚胎发育到4细胞阶段.FISH对激活胚胎的分析显示,4个胚胎为XX,9个胚胎为XY.结论钙离子载体A23187联合嘌呤霉素能有效激活行ICSI失败的卵母细胞;行ICSI后22 h内,是对未受精卵母细胞进行辅助激活较为理想的时机.激活的双原核合并第二极体胚胎中有雄原核的存在.
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嘌呤霉素损伤小鼠肾小球足细胞系中podocin表达与分布的影响及其意义
目的 Podocin是构成肾小球足细胞裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)完整性的重要分子,其表达异常与大量蛋白尿的形成有关.本研究采用体外培养肾小球足细胞系,探讨足细胞损伤过程中,podocin mRNA表达和分布变化与足细胞损伤的关系.方法 将体外培养的足细胞采用随机数字表法设立为实验组与对照组.实验组采用嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN) 刺激(剂量为50 μg/mL), 分别于8 h,24 h和48 h观察细胞形态、提取总RNA和细胞免疫组化观察podocin的分布.对照组用含10% FBS的RPMI 1640培养液培养.细胞图像应用Image J图像处理软件,计算实验组与对照组在上述各时间点200倍镜下随机选择的30个细胞的相对面积,半定量RT-PCR和间接免疫荧光法检测podocin mRNA表达和分布变化.结果 对照组呈星形伸出树枝状突起,相邻细胞间形成相互连接.实验组细胞体缩小,足突回缩、消失, 细胞间失去相互连接.上述各时间点两组间podocin mRNA表达比较,差异无显著意义(P>0.05).Podocin在对照组呈细丝状均匀分布于细胞核膜、细胞质及细胞膜;在实验组主要沿细胞核膜呈点线样分布,刺激后8 h和24 h细胞质有少许分布,刺激48 h后出现细胞膜、细胞质分布缺失.结论 Podocin分布异常与足细胞损伤密切相关,损伤早期即有变化;podocin分布异常是足细胞损伤过程中的重要分子效应.
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应用CRISPR/Cas9技术构建MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株
目的 运用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术,构建线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,研究MAVS对细胞生长的影响.方法 针对MAVS基因第一外显子设计小向导RNA(sgRNA),构建pX459-sgRNA重组质粒.然后利用嘌呤霉素筛选ZR-751 MAVS基因敲除的阳性克隆,Western印迹检测MAVS基因敲除情况,提取克隆基因组进行测序鉴定.平板克隆实验检测MAVS被敲除后对细胞增殖的影响,再利用MTS实验检测在DFX培养基刺激下,MAVS对细胞死亡的影响.结果 Western印迹结果说明ZR-751细胞株内MAVS已完全敲除;且在凋亡诱导剂DFX刺激下,MAVS被敲除后促进细胞增殖.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,初步实验提示MAVS抑制乳腺癌细胞生长,为后续研究MAVS在肿瘤中的功能奠定了基础.
关键词： 线粒体抗病毒信号蛋白 CRISPR/Cas9系统 基因敲除 乳腺肿瘤 嘌呤霉素 -
嘌呤霉素致足细胞损伤细胞模型的建立
目的:建立小鼠足细胞损伤的细胞模型,为进一步从细胞、分子水平研究足细胞的牛物学作用,以及足细胞特别是裂孔隔膜(slit diaphragm)分子在蛋白尿发生、发展中的分子机制提供稳定、可靠的足细胞损伤模型.方法:应用不同浓度的嘌呤霉素(15 ms/L、45 ms/L和75 ms/L)作用于足细胞,通过流式细胞仪检测作用24 h和48 h后足细胞的凋亡情况,以确定嘌呤霉索的作用浓度和时间,建立足细胞损伤的细胞模型;并以噻唑蓝(MTT)检测足细胞损伤后的活力,应用免疫荧光染色观察裂孔隔膜关键分子Nephrin、Podocin以及骨架蛋白F-actin在足细胞损伤中的分布来评价足细胞损伤.结果:45 mg/L嘌呤霉素作用48 h以及75 ms/L嘌呤霉素作用24 h或48 h,足细胞明显凋亡.结论:嘌呤霉素可以呈时间和剂量依赖件诱导小鼠足细胞凋亡,45 mg/L嘌呤霉素作用 48 h后诱导的足细胞损伤模型稳定、可靠,可应用于足细胞损伤的研究.
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MiR-30c-2-3p对足细胞活力及Nephrin和Podocin蛋白表达的影响
目的 探讨MiR-30c-2-3p对足细胞活力及Nephrin和Podocin蛋白的表达影响.方法 采用嘌呤霉素(PAN)诱导的足细胞体外模型,将足细胞分成4组,即空白组、PAN组、阴性质粒+PAN组、阳性质粒+PAN组.通过LipofectamineTM 2000瞬时转染MiR-30c-2-3p mimic.通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞活力、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中MiR-30c-2-3p表达、Western blot检测Nephrin和Podocin蛋白的表达.结果 ①CCK-8结果提示PAN组足细胞活力明显低于空白组,差异有高度统计学意义(P＜0.01),阴性质粒+PAN组较PAN组差异无统计学意义(P＞0.05),阳性质粒+PAN组足细胞活力与PAN组和阴性质粒+PAN组相比均有所提高,差异有统计学意义(P＜ 0.05或P＜0.01).②qRT-PCR显示PAN组MiR-30c-2-3p的表达较空白组明显下降,差异有高度统计学意义(P＜0.01);阴性质粒+PAN组较PAN组表达差异无统计学意义(P＞0.05),而阳性质粒+PAN组MiR-30c-2-3p的表达较PAN组和阴性质粒+PAN组均提高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).③Western blot提示PAN组Nephrin和Podocin蛋白的表达较空白组明显下降,差异有高度统计学意义(P＜0.01);与PAN组相比,阴性质粒+PAN组两者蛋白的表达差异无统计学意义(P＞0.05),而阳性质粒+PAN组Nephrin和Podocin蛋白的表达较单纯PAN组和阴性质粒+PAN组均增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PAN对足细胞的活力,MiR-30c-2-3p含量及Nephrin和Podocin蛋白的表达有抑制作用,而通过外源性增加MiR-30c-2-3p表达后可提高足细胞的活力,同时可增加Nephrin和Podocin蛋白的表达.
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丹参酮ⅡA对嘌呤霉素诱导肾足细胞损伤的保护作用?
目的：探讨丹参酮ⅡA对嘌呤霉素诱导肾足细胞骨架蛋白F-actin、synaptopodin损伤的作用及其可能的作用机制。方法：条件永生性人肾足细胞株AB8/13随机分为对照( control)组、嘌呤霉素氨基核苷( puromycin aminonucleoside, PAN)组、不同剂量(10,20,40,80μmol)丹参酮ⅡA干预(tanshinone ⅡA,TⅡA)组。采用细胞免疫荧光法检测各组细胞骨架蛋白F-actin、synaptopodin在足细胞内的分布及形态；通过DAPI染色法观察各组细胞核的变化；免疫印迹法检测各组细胞p-Rac1/Cdc42蛋白的表达量。结果：(1)F-actin、synaptopodin细胞免疫荧光染色：较control组,PAN组F-actin、synaptopo-din结构紊乱,胞质回缩,细胞边缘褶皱,凋亡小体增多。各浓度TⅡA组上述情况较PAN组显著改善。(2) p-Rac1/Cdc42蛋白表达量,与对照组相比,PAN组p-Rac1/Cdc42蛋白表达量显著上调。与PAN组相比,TⅡA组p-Rac1/Cdc42蛋白表达量显著下调,且呈浓度依赖方式。结论：TⅡA可改善PAN诱导的足细胞骨架蛋白F-actin、synaptopodin的重排及结构紊乱,对足细胞具有一定保护作用,其机制可能与下调Rac1/Cdc42磷酸化水平,减少足细胞丝状伪足、层状伪足形成,从而稳定PAN诱导的细胞骨架变构有关。
关键词： 丹参酮ⅡA 肾足细胞 嘌呤霉素 骨架蛋白 p-Rac1/Cdc42 -
MiR-30c-2-3p对足细胞Nephrin、 Podocin保护作用及雷公藤甲素干预作用研究
目的:探讨miR-30c-2-3p对小鼠足细胞Nephrin、Podocin保护作用及雷公藤甲素(TP)干预作用.方法:采用嘌呤霉素(PAN)致小鼠足细胞损伤的体外模型,将足细胞分成5组:空白组、转染阴性质粒组(阴性质粒组)、转染阴性质粒+ PAN组(阴性质粒+PAN组)、转染miR-30c-2-3p+ PAN组(阳性质粒+PAN组)、转染miR-30c-2-3p+ PAN+TP组(阳性质粒+PAN+ TP组).瞬时转染miR-30c-2-3p mimics,质粒终浓度均为50 nmol/L,转染6h后进行药物干预,PAN干预浓度均为45 mg/L,TP干预浓度均为1 ng/ml,药物干预时间均为48 h.CCK-8法检测足细胞活力;实时荧光定量PCR检测细胞中miR-30c-2-3p表达;Western Blot检测足细胞Nephrin、Podocin蛋白表达.结果:(1)阴性质粒+PAN组足细胞活力明显低于空白组及阴性质粒组(P＜0.01),阳性质粒+ PAN组较阴性质粒+PAN组足细胞活力提高(P＜0.05),使用TP干预后其活力进一步提高(P＜0.05).(2)与空白组、阴性质粒组比较,阴性质粒+PAN组miR-30c-2-3p表达减少,差异有统计学意义(P＜0.01);与阴性质粒+PAN组相比,阳性质粒+PAN组、阳性质粒+PAN +TP组miR-30c-2-3p表达均增加(P＜0.05);但与阳性质粒+PAN组相比,雷公藤甲素干预组未见统计学意义(P＞0.05).(3)与空白组及阴性质粒组比较,阴性质粒+ PAN组Nephrin、Podocin两者表达均减少,差异有统计学意义(P＜0.01);与阴性质粒+PAN组相比,阳性质粒+ PAN组Nephrin、Podocin蛋白表达增加(P＜0.05);在使用了TP干预后两者表达进一步增加(P＜0.05).结论:PAN能降低足细胞活力,降低miR-30c-2-3p表达,而增加其表达可以上调足细胞活力以及Nephrin、Podocin的表达.TP可以减轻PAN诱导的足细胞损伤以及Nephrin、Podocin的表达下降,但其作用机制似乎与miR-30c-2-3p无关.
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肾炎灵颗粒剂治疗慢性原发性肾小球疾病研究(2)--病理细胞学研究部分
病理1材料与方法1.1材料健康成年Wistar雄性大白鼠16只,体重为(185±13)g,由中科院上海实验动物中心提供.造模药物为1%的嘌呤霉素,购自Sigma化学公司.治疗药物肾炎灵颗粒剂由本院制剂室配制,批号:960715.
关键词： 肾炎灵颗粒剂 慢性原发性肾小球疾病 嘌呤霉素 系膜细胞 成纤维细胞 -
真武汤加味对肾病综合征大鼠血清脂谱、总蛋白、白蛋白、尿蛋白及组织形态学的影响
1实验材料与方法1.1动物模型制备、分组与给药用嘌呤霉素100mg/kg体重给予大鼠腹腔注射,其后每隔2W给25mg/kg,共5次.取健康雄性大鼠50只.在实验室正常饲养10d后,开始实验,分别为:空白对照组:在腹腔注射等容量生理盐水.模型对照组:造模至12W末.阳性药对照组造模同时给予雷公藤10mg/kg灌胃至12W末.中药高剂量组:造模同时给予中药真武汤7.2g/kg灌胃至12W末.中药低剂量组:造模同时给予真武汤3.6g/kg灌胃至12W末.
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MiR-122稳定转染细胞系的建立及其脂代谢特征
目的:利用稳定表达人miR-122前体的表达载体,转染低表达miR-122的人肝癌细胞系HepG2细胞,获得过量表达miR-122的稳定转染细胞系,探讨miR-122对肝脏细胞脂代谢的影响及其机制.方法:对已构建完成的表达质粒pEZX-hsa-mir-122和对照质粒pEZX-mir-control进行酶切鉴定,对酶切正确的克隆进行DNA测序,测序正确的克隆应用脂质体试剂转染,绿色荧光蛋白表达监测转染效率,应用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系,实时定量PCR在RNA水平鉴定miR-122的表达,蛋白质印迹法从靶分子水平验证miR-122的抑制功能,尼罗红染色观察细胞内脂质.结果:pEZX-hsa-mir-122质粒成功转染HepG2细胞,质粒携带的miR-122前体序列整合到细胞基因组中,获得过量表达miR-122的HepG2细胞株,细胞内成熟体miR-122可抑制靶基因的翻译,细胞内脂质明显增加.结论:人miR-122前体序列可整合在HepG2细胞基因组中,过量表达miR-122的HepG2细胞出现脂质代谢异常.
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氟伐他汀改善嘌呤霉素作用下足细胞β1整合素的表达
目的：探讨氟伐他汀(FLV)对嘌呤霉素(PAN)刺激下足细胞黏附分子β1整合素表达的影响及可能机制。方法：体外培养的永生化人足细胞分为以下四组：(1)正常对照组；(2)二甲基亚砜(DMSO，1 mg/ml)对照组；(3)PAN(1.0μg/ml)组：PAN分别培养足细胞12h、24h、48h、72h；(4)PAN(1.0μg/ml)+FLV(1×10-8～1×10-5M)组，PAN分别与不同浓度FLV共同培养足细胞48h。用Western印迹和DCFHDA(2'，7'-二氯荧光素-3'，6'-二乙酸酯)分别检测以上四组足细胞β1整合素和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的表达。噻唑蓝[3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，简称MTI]法检测足细胞活力。结果：与正常对照组相比，PAN分别作用24h、48h、72h后，β1整合素表达逐渐下降、ROS表达则明显升高(P＜0.05)。FLV干预后，β1整合素表达水平升高、ROS表达水平下降，以FLV浓度为1×10-7M作用48h效果明显(P＜0.05)。相关性分析发现，PAN组以及PAN+FLV组足细胞β1整合素水平与细胞内ROS表达水平成负相关。MTT结果表明DMSO以及FLV浓度为1×10-8M和1×10-7M对足细胞的存活无明显影响(P＞0.05)，而FLV浓度为1×10-6M和1×10-5M、PAN组、PAN+FLV组，在24h均明显抑制足细胞的活力(P＜0.05)。与PAN组相比，PAN与FLV 1×10-7M共同作用48h足细胞活力有明显的改善(P＜0.05)。结论：PAN可致体外培养足细胞的β1整合素表达下降，FLV上调β1整合素的表达，保护足细胞。此机制与FLV抑制足细胞内ROS的表达相关。
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IQGAP1在调节足细胞细胞骨架重组中的作用
目的:探讨IQ结构域GTP酶活化蛋白1(IQ domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)对足细胞细胞骨架重组的调节作用.方法:嘌呤霉素(PAN)刺激小鼠足细胞后,运用实时定量PCR和Western blot印迹法分别检测细胞内IQGAP1mRNA和蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜观察足细胞骨架F-actin的分布,F-actin肌动蛋白评分系统(CFS)对骨架重组进行分析,并进一步观察上调和下调足细胞IQGAP1表达对PAN诱导的足细胞骨架重组的影响.结果:①与对照组相比,PAN刺激组足细胞内IQGAP1 mRNA和蛋白表达明显下降(P＜0.05),足细胞F-actin排列紊乱,CFS明显升高;②IQGAP1 siRNA进一步抑制IQGAP1表达后,PAN引起的上述足细胞F-actin重组更加明显(P＜0.05);③转染pCantag-myc-IQGAP1质粒促进IQGAP1表达后,PAN诱导的足细胞F-actin排列紊乱显著减轻,CFS明显下降(P＜0.05).结论:IQGAP1能抑制嘌呤霉素诱导的足细胞骨架重组,对维持足细胞正常骨架结构起着重要作用.
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钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对人体外成熟卵母细胞孤雌激活作用的研究
目的:探讨钙离子载体A23187或联合嘌呤霉素(puromycin)对人类体外成熟卵母细胞的孤雌激活作用.方法:收集体外培养成熟的人卵母细胞124枚,根据体外成熟培养的时间分为24、48、72 h组.分别采用A23187、A23187联合嘌呤霉素进行孤雌激活,然后应用荧光原位杂交(FISH)技术对孤雌胚胎进行性染色体分析.结果:A23187或联合嘌呤霉素能激活体外成熟的卵母细胞,激活率分别为38.9%、71.8%;二者联合应用能有效地提高孤雌胚胎的发育潜能.随着体外成熟培养的时间延长,A23187联合嘌呤霉素对卵母细胞激活率呈下降趋势;其中24、48 h组成熟的卵母细胞激活率和胚胎发育潜能显高于72 h组.FISH对9个孤雌胚胎的性染色体分析示,7个孤雌胚胎为XX,2个为X.结论:钙离子载体A23187联合嘌呤霉素能有效地激活人体外成熟卵母细胞,形成的孤雌胚胎核型多数为双倍体.
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他克莫司稳定肾小球足细胞podocin蛋白表达分布进而抑制嘌呤霉素引起的足细胞损伤
目的 观察他克莫司(Tacrolimus,FK506)及嘌呤霉素(Puromycin,PAN)对小鼠肾小球足细胞podocin蛋白表达和分布的影响,探讨FK506保护肾小球足细胞、影响蛋白尿产生的机制.方法 体外培养小鼠肾小球足细胞(MPC5),实验分为对照组、PAN组和FK506组.处理8 h、24 h和48 h后,观察并收集细胞进行实时荧光定量PCR、Western blot检测podocin mRNA及蛋白的表达,免疫荧光染色检测podocin蛋白的分布.结果 PAN组在8 h、24 h、48 h时胞体面积(6.41 ± 0.22、4.96 ± 0.09、3.76 ± 0.16)较对照组(8.54 ± 0.25、8.27 ± 0.07、7.45 ± 0.13)缩小.FK506组各时间点足细胞胞体面积(7.67 ± 0.06、6.62 ± 0.04、5.57 ± 0.27)较PAN组增大.PAN组在8 h、24 h、48 h荧光定量PCR(0.63 ± 0.12、0.56 ± 0.01、0.48 ± 0.02)、Western blot (0.71 ± 0.03、0.46 ± 0.01、0.34 ± 0.02)及免疫荧光染色结果显示podocin mRNA表达量(1.22 ± 0.15、1.18 ± 0.06、0.87 ± 0.30)较对照组下降,蛋白表达量(0.86 ± 0.03、0.87 ± 0.03、0.61 ± 0.07)降低且分布异常,随着时间的延长mRNA和蛋白表达量明显降低(均P<0.05),分布明显异常.FK506组在8 h、24 h、48 h时podocin mRNA(0.87 ± 0.15、0.78 ± 0.15、0.58 ± 0.12)及蛋白(0.82 ± 0.02、0.62 ± 0.03、0.50 ± 0.02)的表达量较PAN组逐渐升高,分布趋于正常(P<0.05).结论 在PAN损伤足细胞的经典模型中,podocin mRNA及蛋白表达降低,FK506通过稳定 podocin mRNA和蛋白的表达及分布来保护 PAN诱导损伤的足细胞,该作用可能与FK506抑制蛋白尿产生及改善机制有关,可作为研究及治疗肾脏疾病的靶点.
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嘌呤霉素损伤小鼠肾小球足细胞系中足细胞α-辅肌动蛋白4的表达与分布
目的 观察嘌呤霉素(PAN)对足细胞α-辅肌动蛋白4(α-actin-4)mRNA表达和分布的影响,探讨α-actin-4与足细胞损伤的关系.方法 将体外培养肾小球足细胞系(MPC5)随机分为实验组与对照组.实验组采用PAN刺激(剂量为50 mg/L),分别于8h、24 h和48 h观察细胞形态,提取总RNA和细胞免疫组织化学观察α-actin-4的分布.对照组用100 mL/L FBS的RPMI 1640培养液培养.应用Image J图像软件处理细胞图像,计算2组随机选择的30个细胞在上述3个时间点200倍镜下的细胞相对面积,实时定量荧光聚合酶链反应(RT-PCR)和间接免疫荧光法检测α-actin-4 mRNA表达和分布变化.结果 对照组足细胞生长情况良好,胞体呈不规则星形,与增殖状态足细胞比较,细胞体和细胞核均显著增大,自胞体伸出树枝样突起,相邻细胞间足突相互连接.实验组细胞胞体缩小,足突回缩、消失,细胞间失去相互连接.2组间0-actin-4 mRNA各时间点表达比较,8h差异无统计学意义(P＞0.05),24 h、48 h差异有统计学意义(P均＜0.01),实验组在24 h、48 h后α-actin-4 mRNA表达升高.对照组α-actin-4在胞质内呈细丝状均匀分布,在足突中呈放射状分布;8h后在实验组α-actin-4压力丝纤维变短,排列紊乱,PAN刺激24 h后细胞质中α-actin-4分布明显减少,刺激48 h后出现细胞质分布缺失.结论 α-actin-4表达分布的异常与PAN损伤足细胞的时间呈正相关,α-actin-4是足细胞损伤机制中的一个重要分子.
关键词： 足细胞 足细胞α-辅肌动蛋白4 嘌呤霉素 -
甘草甜素及地塞米松干预嘌呤霉素诱导足细胞损伤的体外研究
目的 观察甘草甜素(GL)及地塞米松(DEX)对受损足细胞凋亡的影响,探讨其细胞学作用机制.方法 建立嘌呤霉素(PAN)致足细胞损伤模型,应用不同水平PAN(12.5mg?L-1“、25.0mg?L-1、50.0 mg?L-1、75.0 mg?L-1、100.0 mg?L-1)作用于足细胞,培养48 h后检测细胞凋亡率,选取合适的PAN作用质量浓度.将体外培养小鼠足细胞(MPC5)分为对照组、PAN组、DEX1组、DEX2组、DEX3组、GL1组、GL2组、GL3组,对照组加入等体积RPMI 1640培养液培养；PAN组加入PAN,终质量浓度50 mg?L-1；DEXL、2、3组同时加入PAN(终质量浓度50 mg?L-1)和DEX(终浓度分别为0.1μmol?L-1、1.0 μmol?L-1、10.0 mol?L-1);GL1、2、3组同时加入PAN(终质量浓度50.0 mg?L-1)和GL(终质量浓度分别为400 n1g?L-1、600 mg?L-1、800 mg?L-1),培养48 h.流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.结果 50.0 nmg?L-1 PAN诱导足细胞凋亡较对照组明显升高(P＜0.05),75.0 mg?L-1、100.0 nmg?L-1PAN诱导足细胞凋亡率显著升高,大部分足细胞死亡(Pa＜0.01).DEX1组、2组足细胞凋亡率明显低于PAN组(Pa＜0.05),DEX 3组(10.0 μmol?L-1)干预后足细胞凋亡率显著低于PAN组(P＜0.01).不同质量浓度GL组干预后足细胞凋亡率均显著低于PAN组(Pa＜0.01),随GL质量浓度升高,其抗足细胞凋亡作用降低(P＜0.05).结论 PAN可呈剂量依赖性诱导足细胞损伤,50.0 mg?L-1 PAN为诱导合适的质量浓度.GL及DEX对PAN诱导足细胞损伤均有保护作用,DEX呈剂量依赖方式抑制足细胞凋亡,GL发挥抗足细胞凋亡作用与剂量有关.
