首页 > 文献资料
-
ADAR2通过编辑MAVS基因的3'UTR降低其在细胞中的表达
目的探讨ADAR2在细胞中对线粒体抗病毒信号蛋白MAVS表达的影响及其机制.方法用RT-qRCR检测ADAR家族在细胞中的表达、ADAR2质粒过表达效果以及MAVS的表达;焦磷酸测序验证ADAR2对MAVS的3'UTR区域位点的编辑;双荧光素酶报告质粒检测荧光素酶的相对表达;Western blot检测ADAR2和MAVS蛋白的表达.结果ADAR家族中ADAR1 丰度高,其次ADAR2也有表达,而ADAR3的表达量很低,几乎检测不到(P<0.05);ADAR2对MAVS的3'UTR区域上的chr20:3869744位点发挥RNA编辑作用(P<0.001);MAVS的3'UTR编辑位点上,编辑型G比正常型A的荧光素酶活性显著降低(P<0.01);在转录和翻译水平,ADAR2都显著降低了MAVS的表达(P<0.05).结论ADAR2通过编辑MAVS的3'UTR上的chr20:3869744位点,使其发生A→G的替换,进而抑制了MAVS基因的表达.
关键词： 作用于RNA的腺苷脱氨酶2 线粒体抗病毒信号蛋白 RNA编辑 -
应用CRISPR/Cas9技术构建MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株
目的 运用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术,构建线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,研究MAVS对细胞生长的影响.方法 针对MAVS基因第一外显子设计小向导RNA(sgRNA),构建pX459-sgRNA重组质粒.然后利用嘌呤霉素筛选ZR-751 MAVS基因敲除的阳性克隆,Western印迹检测MAVS基因敲除情况,提取克隆基因组进行测序鉴定.平板克隆实验检测MAVS被敲除后对细胞增殖的影响,再利用MTS实验检测在DFX培养基刺激下,MAVS对细胞死亡的影响.结果 Western印迹结果说明ZR-751细胞株内MAVS已完全敲除;且在凋亡诱导剂DFX刺激下,MAVS被敲除后促进细胞增殖.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,初步实验提示MAVS抑制乳腺癌细胞生长,为后续研究MAVS在肿瘤中的功能奠定了基础.
关键词： 线粒体抗病毒信号蛋白 CRISPR/Cas9系统 基因敲除 乳腺肿瘤 嘌呤霉素 -
H5N1禽流感病毒感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白SYBR Green Ⅰ相对荧光定量PCR检测方法的建立及应用
目的 建立H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)SYBR Green Ⅰ相对荧光定量PCR检测方法,并检测H5N1AIV感染前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平.方法 提取豚鼠肺脏组织RNA,反转录合成cDNA,将cDNA模板按10倍系列稀释为9个浓度(1.00E+ 10～ 1.00E+02copies/μl),进行PCR扩增.以β-actin为内参,建立标准曲线,比较两基因的扩增效率,验证该方法的引物特异性、重复性及灵敏度.同时用该方法检测H5N1AIV攻毒前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平.结果 cDNA模板佳稀释度范围为1.00E+09～1.00E+04.豚鼠MAVS和β-actin基因的标准曲线斜率差值＜0.1,R2=0.999,扩增效率分别为100.2％和100.3％;两基因扩增溶解曲线峰单一,可扩增出清晰的目的条带,且无非特异性扩增;两基因Ct值的变异系数(CV)均＜10％;灵敏度为1.00 E+03 copies/μl.感染H5N1AIV的豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平下调.结论 成功建立了H5N1AIV感染豚鼠体内MAVS的SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并发现H5N1AIV感染可导致豚鼠体内MAVS表达水平下调.
-
线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体.方法 通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增获得线粒体抗病毒信号蛋白基因的完整序列,进而纯化回收后连接到pMDTM 18-T载体上,将pcDNA6/myc-HisA载体和带有目的片段的pMDTM 18-T载体同时进行双酶切,酶切产物过夜连接转化至大肠杆菌JM109,挑取阳性克隆pcDNA6/myc-HisA-MA VS扩增后,提取重组质粒;利用PCR和核酸测序验证线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体构建的正确性;应用Western blotting的方法检测融合蛋白的表达.结果 线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体构建成功,并且该载体能够在OL细胞中表达融合蛋白.结论 成功构建线粒体抗病毒信号蛋白真核表达载体,为进一步研究该蛋白的功能和作用机制奠定基础.
关键词： 线粒体抗病毒信号蛋白 真核表达载体 序列分析 -
丙型肝炎病毒感染过程中其NS3/4 A蛋白酶切割线粒体抗病毒信号蛋白的动态过程
已知丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)可通过其蛋白酶NS3/4A切割线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)来逃逸天然免疫识别,但尚不清楚其切割动力学及切割在抑制干扰素中的作用.本研究旨在细胞模型中探讨 HCV感染过程中病毒复制建立及病毒 NS3/4A切割MAVS的动态过程,探究NS3/4A切割MAVS对病毒逃逸宿主天然免疫建立感染的贡献.首先构建基于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的 MAVS 切割报告系统(GFP-NLS-MAVS-TM462),用HCV Jc1-Gluc感染Huh7.5/GFP-NLS-MAVS-TM462细胞.结果显示,病毒复制早期MAVS切割效率较低;NS3/4A高效切割MAVS发生于 HCV复制晚期,且其切割效率与NS3蛋白水平相关.利用带有 GFP ypet的HCV报告病毒Jc1-378-1感染Huh7.5/RFP-NLS-MAVS-TM462细胞,在单细胞水平观察HCV感染阳性细胞中MAVS被切割情况,发现HCV复制细胞中仅部分细胞MAVS被切割.进一步研究发现,不同基因型NS3/4A切割MAVS的效率仅与NS3表达水平相关.以上结果提示,HCV蛋白酶NS3/4A切割MAVS依赖NS3/4A蛋白在病毒复制过程中的累积,对在病毒复制早期逃逸宿主天然免疫建立感染可能无显著贡献.
关键词： 丙型肝炎病毒 非结构蛋白3/4A 线粒体抗病毒信号蛋白 干扰素 -
乙型肝炎病毒e抗原对Bewo细胞RIG-Ⅰ和MAVS表达的作用
目的 探讨乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)对Bewo细胞维甲酸诱导基因-I(retinoic acidinducible-Ⅰ,RIG-Ⅰ)和线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)表达的作用.方法 首先以终浓度2 μg/mL的RIG-Ⅰ配体poly(dAT∶dAT)处理Bewo细胞24 h,观察RIG-Ⅰ、MAVS mRNA的表达.然后将5μgHBeAg重组质粒pcDNA3.1 (+)-HBe转染Bewo细胞,转染48 h后,以2μg/mL的poly(dAT∶ dAT)刺激24 h.采用实时荧光定量反转录PCR和酶联免疫吸附测定分别检测细胞RIG-Ⅰ、MAVS mRNA表达及上清干扰素-β(interferon-β,IFN-β)水平.并采用免疫荧光染色法观察HBeAg对细胞核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)p65入核的影响.结果 poly(dAT∶ dAT)可诱导Bewo细胞RIG-Ⅰ、MAVS mRNA表达(27.86±9.49,21.75±8.04),高于对照组(14.51±6.27,11.59±4.73)(P＜0.01).转染5μg HBeAg重组质粒组poly(dAT∶ dAT)可诱导Bewo细胞RIG-Ⅰ、MAVS mRNA表达(13.33±4.23,10.48±3.17)及IFN-β产生[(14.20±5.01)pg/mL],低于对照组[27.86±9.49,21.75 ±8.04;(47.69± 14.3)pg/mL](P＜0.01),但与pcDNA3.1-HBe-5组[11.82±3.58,9.39±3.22;(10.82± 3.75)pg/mL]比较,差异无统计学意义(P＞0.05).且HBeAg可干扰poly(dAT∶dAT)诱导Bewo细胞NF-κB p65入核,抑制NF-κB的激活.结论 HBeAg可下调Bewo细胞RIG-Ⅰ、MAVS mRNA的表达,并抑制NF-κB入核及IFN-β产生,这可能是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)逃避宿主免疫应答的一种重要策略.
-
RIG-Ⅰ配体poly(dAT:dAT)诱导Bewo细胞抑制乙型肝炎病毒复制的研究
目的 探讨维甲酸诱导基因-I(retinoic acid inducible gene Ⅰ,RIG-Ⅰ)配体poly(dAT:dAT)抑制人滋养层细胞Bewo中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的作用及机制,为防治HBV宫内感染提供依据.方法 首先将2μg1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染Bewo细胞12h后,以RIG-Ⅰ配体poly(dAT:dAT)处理24h.然后,以poly(dAT:dAT)处理Bewo细胞,观察干扰素-β(interferon-β,IFN-β)表达的动力学.采用微粒子酶免疫分析法和荧光定量聚合酶链反应法分别检测HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平,并以酶联免疫吸附测定和逆转录PCR分别检测IFN-β水平,RIG-Ⅰ、线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)、干扰调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF 3)和核因子-κB(NF-κB)的表达.结果 poly(dAT:dAT)可显著诱导Bewo细胞产生IFN-β(P<0.05),呈时间和剂量依赖性.与对照组比较,poly(dAT:dAT)处理组HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平显著下降(P<0.05),可显著抑制Bewo细胞中HBV复制.且poly(dAT:dAT)可诱导HBV重组质粒转染的Bewo细胞表达RIG-Ⅰ、MAVS、IRF 3和NF-κB mRNA.结论 通过RIG-Ⅰ/MAVS信号途径诱导Bewo细胞产生IFN-β,RIG-Ⅰ配体poly(dAT:dAT)可显著抑制HBV复制.
关键词： 维甲酸诱导基因-Ⅰ 线粒体抗病毒信号蛋白 乙型肝炎病毒 病毒复制 信号传导
