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ADAR2通过编辑MAVS基因的3'UTR降低其在细胞中的表达
目的探讨ADAR2在细胞中对线粒体抗病毒信号蛋白MAVS表达的影响及其机制.方法用RT-qRCR检测ADAR家族在细胞中的表达、ADAR2质粒过表达效果以及MAVS的表达;焦磷酸测序验证ADAR2对MAVS的3'UTR区域位点的编辑;双荧光素酶报告质粒检测荧光素酶的相对表达;Western blot检测ADAR2和MAVS蛋白的表达.结果ADAR家族中ADAR1 丰度高,其次ADAR2也有表达,而ADAR3的表达量很低,几乎检测不到(P<0.05);ADAR2对MAVS的3'UTR区域上的chr20:3869744位点发挥RNA编辑作用(P<0.001);MAVS的3'UTR编辑位点上,编辑型G比正常型A的荧光素酶活性显著降低(P<0.01);在转录和翻译水平,ADAR2都显著降低了MAVS的表达(P<0.05).结论ADAR2通过编辑MAVS的3'UTR上的chr20:3869744位点,使其发生A→G的替换,进而抑制了MAVS基因的表达.
关键词： 作用于RNA的腺苷脱氨酶2 线粒体抗病毒信号蛋白 RNA编辑 -
ADAR1通过RNA编辑上调ZNF655表达并促进人肝癌细胞系HepG2中HBV复制
目的 探讨细胞中ADAR1对锌指蛋白ZNF655的作用及其对乙肝病毒(HBV)复制的影响.方法 在人肝癌细胞系HepG2细胞中,利用桑格测序验证ZNF6553′UTR存在ADAR1 RNA编辑位点;RT-qPCR检测ADAR1和ZNF655 mRNA的表达及HBV total RNA 和 HBV 3.5 kb RNA的表达;双荧光素酶报告基因检测荧光素酶的相对表达;Western blot检测ADAR1和ZNF655蛋白的表达;ELISA检测ZNF655对HBV标志物HBsAg和HBeAg的影响.结果 ZNF655基因3′UTR上chr7:99575277位点在DNA水平为纯合型,在RNA水平为杂合型;ZNF655基因3′UTR上chr7:99575277位点的编辑型 G 比正常型 A 的荧光素酶活性显著升高(P＜0.001);在转录和翻译水平,ADAR1都显著增加了 ZNF655的表达(P＜0.001);ZNF655对 HBV 的表达起到促进的作用.结论 ADAR1通过编辑ZNF655的3′UTR上的chr7:99575277位点,使编辑位点A转换成G,上调了基因的表达,进而起到对HBV复制的促进作用.
关键词： 作用于RNA的腺苷脱氨酶1 锌指蛋白655 RNA编辑 乙肝病毒 -
5-HT2C受体的RNA编辑作用
5羟色胺2C(serotonin,5-HT2C)受体是一种G蛋白耦联受体,在中枢神经系统中有着广泛的分布.5-HT2C受体的表达具有特殊的转录后修饰过程,即由腺苷酸脱氨酶(ADAR)介导的腺苷酸(adnosine,A)到肌苷酸(inosine,I)的RNA编辑.由RNA编辑所引起的5-HT2C受体表型的改变,影响着5-HT2C受体介导的一系列功能,包括对情感、认知、焦虑等的调节,并参与精神障碍疾病的发病过程.本综述旨在对目前5-HT2C受体的RNA编辑作用的相关研究加以整合.
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ADAR家族对5-羟色胺2C受体RNA编辑的研究进展
RNA编辑是指转录后RNA分子的编辑过程,包含核苷酸的插入、删除和替换.RNA依赖腺嘌呤脱氨酶(RNA dependent adenosine deaminases,ADARs)是一类可以将5-羟色胺2C受体基因(HTR2C)的前体mRNA特定位点上的腺苷酸(adenosine,A)脱氨基转化为肌苷酸(inosine,Ⅰ)的酶.A-to-Ⅰ RNA编辑终引起氨基酸的改变.本篇综述主要阐述ADAR家族对HTR2C的RNA编辑作用的相关研究进展,为防治HTR2C的RNA编辑异常引起的相关疾病提供理论依据.
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ADAR1同工型基因在小鼠急性T淋巴细胞白血病模型中的表达
本研究探讨RNA编辑酶ADAR1的2种同工型P110和P150在小鼠白血病发展中的表达变化规律.采用Notch1过表达小鼠急性T淋巴细胞白血病移植模型,在发病不同阶段分离骨髓单个核细胞,并在发病晚期用流式细胞术分选CD45.2+GFP+白血病细胞,用实时定量PCR方法检测ADAR1的表达变化.结果表明:对照组和白血病组小鼠骨髓细胞均表达ADAR1的2种同工型P110和P150 mRNA;Notchl过表达导致的小鼠白血病发展过程中2种同工型的表达水平变化不同;随着白血病的发展,P110的表达水平逐渐升高,而P150表达水平逐渐降低,在移植后的第14天降至对照组的1/4.分选后的CD45.2+GFP+白血痛细胞高表达P110而低表达P150.结论:ADARl的亚型P11和P150 mRNA在小鼠白血病中的表达变化规律存在差异,提示二者介导的RNA编辑可能在白血病发展中发挥不同作用.
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脊索瘤中microRNA的差异性表达及其RNA编辑
目的:检测脊索瘤组织中microRNA (miRNA)的差异性表达情况,探讨其RNA编辑.方法:使用RT-qPCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction)技术检测骶骨脊索瘤组织1 1种候选miRNA的表达水平,将其与髓核组织中的表达水平进行比较,对表达异常的miRNA前体(pri-miRNAs)的DNA和cDNA序列进行对比,检测是否存在RNA编辑.使用蛋白印迹法(Western blot)检测脊索瘤组织中RNA编辑的关键酶RNA腺苷脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADARs)的表达.构建ADAR的表达载体,同时构建ERBB2和HOXA1的3'-非翻译区报告载体并转染miRNA模拟物和抑制物,将其和ADAR的表达载体共转染至人胚肾细胞293T(HEK293T细胞),用qRT-PCR检测miRNA的表达水平,并通过荧光素酶报告基因活性分析法对已测得异常表达的miRNA的靶基因ERBB2和HOXA1进行活性分析,检测ADAR与测得异常表达的miRNA的靶基因的关系.结果:与髓核组织相比,脊索瘤组织中miR-10a和miR-125a的相对表达程度明显下调(P＜0.05).脊索瘤组织中miR-10a和miR-125a的前体cDNA序列中出现了腺苷酸向鸟苷酸(A-G)突变,而在髓核组织中miR-10a和miR-125a前体的cDNA序列中无此改变,miR-10a和miR-125a在成熟过程中出现了A-IRNA编辑.4组脊索瘤组织中有3组存在ADAR1过度表达,2组存在ADAR2过度表达.转染了miRNA抑制物的HEK293T细胞中ADAR1表达出现上调,而miR-10a和miR-125a的表达出现下调,miR-10a的靶基因ERBB2和miR-125a的靶基因HOXA1的荧光素酶活性显著增高;相反,转染了miRNA模拟物的HEK293T细胞中ADAR1表达出现下调,而miR-10a和miR-125a的表达出现上调,ERBB2和HOXA1的荧光素酶活性显著降低.结论:ADAR1的过度表达可能通过介导A-I RNA编辑影响miR-10a和miR-125a的成熟和表达,参与脊索瘤发生中的细胞异常增殖调控.
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苯乙酸抑制胰腺癌BXPC-3细胞增殖及RNA编辑酶表达的研究
目的 探讨苯乙酸对胰腺癌诱导分化作用及RNA编辑在胰腺癌细胞增殖分化过程中的作用机理.方法 采用MTT比色法和流式细胞术检测苯乙酸对胰腺癌BXPC-3细胞系增殖抑制作用及对BXPC-3细胞周期的影响.RT-PCR方法检测RNA编辑酶ADAR mRNA在胰腺癌细胞系和胰腺癌组织中的表达以及应用苯乙酸后ADAR mRNA表达的变化.结果 人胰腺癌组织及胰腺癌BXPC-3细胞中均可检测到编辑酶ADAR2.应用1.0及2.0mmol/L苯乙酸后24h及72 h,BXPC-3细胞增殖抑制率增加,G0/G1期比例下降,S期比例显著升高.ADAR2 mRNA表达降低,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 ADAR2可能在胰腺细胞增殖分化过程中发挥作用,且苯乙酸可能通过调控ADAR2 mRNA的表达来发挥诱导分化作用.
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人喉癌Hep-2细胞膜钾离子通道与RNA编辑酶1的相关性
目的研究人喉癌细胞系Hep-2细胞膜钾离子通道特性及其与RNA编辑酶1(RNA-dependent adenosinedeaminase1,ADAR1)的相关性.方法以Hep-2细胞为研究对象,采用穿孔膜片钳全细胞记录法研究钾离子通道特性,用逆转录聚合酶链反应检测四乙胺(tetraethylammonium,TEA)阻断钾离子通道前后Hep-2细胞ADAR1 mRNA的表达.结果 Hep-2细胞膜的静息膜电位为(-29.8±1.9)mV,在钳制电压-40 mV,阶跃电压在-80～+80 mV,记录到一种跨膜电流,该跨膜电流具有电压依赖、外向整流特性,该电流在延迟25ms后大激活,800 ms内不失活,可被阻断剂TEA阻断.Hep-2细胞钾离子通道被TEA阻断前后ADAR1mRNA相对表达量存在显著性差异.结论 Hep-2细胞膜上存在延迟整流钾离子通道,此钾离子通道可能和ADAR1 mRNA的表达密切相关.
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ADARs在肿瘤中的研究进展
RNA特异性腺苷脱氨酶(ADARs)在RNA转录后的修饰过程中发挥重要作用,是导致生物多样性的原因之一,通过对RNA编码区或非编码区相关位点的编辑,影响人类疾病的发生、发展.尽管它已成为多种疾病研究中的热点,但其完整的生物学意义尚未完全阐明.ADARs的表达失衡与人类肿瘤的进展及肿瘤患者的预后密切相关,但是,到目前为止,其确切的作用机制尚未完全阐明.因此,通过对ADARs及其编辑位点的进一步研究,在转录后水平阐明肿瘤发生的潜在机制,可以为肿瘤的诊断、治疗新方法的探索提供理论基础.
关键词： 肿瘤 RNA特异性腺苷脱氨酶 RNA编辑 -
神经纤维瘤肿瘤抑制基因的研究
Ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1,NF1)是一种常染色体显性遗传病,发病率为1/3 500.Nf1基因突变导致Ⅰ型神经纤维瘤病,因此Nf1基因为肿瘤抑制基因,表达产物neurofibromin为肿瘤抑制蛋白.导致NF1疾病发生的一个重要机制是C→U RNA编辑.
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胶质瘤细胞中ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式的分析
目的：比较胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式的差异。方法：RFPCR产物测序检测胶质瘤细胞和正常胶质细胞中GluR2 Q/R位点的A-to-I编辑水平。根据前期研究鉴定出的选择性剪接位点设计特异性引物，RT-PCR方法检测胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中不同剪接转录本的相对表达量，比较胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2 mRNA前体剪接模式的差异。结果：胶质瘤细胞中GluR2 Q/R位点的A-to-I编辑水平明显下降。RT-PCR检测到在胶质瘤细胞中，Exon 1a（+）/1a（-）、Exon 2（+）/2（-）的比值在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中无显著性差异。Exon 5a（+）/5a（-）的比值明显高于正常星形胶质细胞HA1800。结论：Exon 5a位点的剪接在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中有显著性差异，Exon 5a（+）转录本的表达增加可能是导致胶质瘤细胞中ADAR2编辑活性下降的原因。
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鹅新城疫病毒P基因的RNA编辑及其相关蛋白的分子特征
应用 RT-PCR方法对鹅新城疫病毒安徽分离株WF00G P基因进行了RNA编辑分析,发现WF00G P基因在保守的编辑位点上插入一个G,使得P基因增加编码V蛋白,而且它的大ORF的长度为1188 bp,编码395个氨基酸的P蛋白.WF00G株和参考毒株的P基因的同源性和系统发育分析表明,WF00G株与水禽源毒株NA-1、ZJ1、FP1/02、PX2/03、Duck/1/05和SF02等亲缘关系较近,与传统疫苗株或弱毒株HB92、LaSota和Clone30以及F48E9等的亲缘关系相对较远.进一步对其V蛋白羧基端序列分析发现,虽然编辑位点氨基酸序列(132KKG134)和羧基端的5个Cys残基位点是高度保守的,但是V蛋白C末端氨基酸存在较大变异,APMV-1毒株V蛋白羧基端氨基酸的突变呈现"基因型一致性".
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论RNA编辑研究进展
RNA编辑是一种转录后的基因修饰方式,可实现对单个核苷酸的编辑处理来促使经过转录以后的RNA与标准DNA编码顺序不完全相同.伴随着当前在分子生物学领域研究工作的持续深入,部分新型RNA编辑也逐渐被人们所发现,部分编辑类型的研究还表明了RNA编辑具备有记忆能力.本文就从RNA编辑的机制、功能、生物学意义及研究进展展开讨论.
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血管内皮生长因子分子多样性及其与肿瘤的关系
血管内皮生长因子是肿瘤发生发展过程中起重要作用的一类糖蛋白,其在基因水平存在较多的SNP位点以及在RNA剪切水平上存在选择性剪切.研究表明,这些变异与各种肿瘤的发生、发展、恶性程度有着密切的关系.
关键词： 血管内皮生长因子 单核苷酸多态性(SNP) 选择性剪切 RNA编辑 -
RNA异常与肿瘤调控研究进展
肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过程,其根本原因是细胞稳态的失衡.近年研究发现,在肿瘤的发生、发展中除了蛋白质功能紊乱、DNA突变之外,还存在着大量RNA的异常,包括异常的microRNA(miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,IncRNA)、循环RNA等；此外,肿瘤细胞中还存在RNA转录、加工及调控功能的异常,如RNA选择性剪接、RNA编辑、竞争性内源RNA调控等.这些非编码RNA可以在转录后水平及表观遗传学水平调控癌基因和抑癌基因的功能,影响肿瘤的发生和发展,是肿瘤诊断、治疗及预后判断的潜在靶标.竞争性内源RNA使得lncRNA与mRNA通过miRNA相互调控,以“miRNA结合位点”为媒介,形成RNA调控网络.RNA选择性剪接使得癌基因或抑癌基因产生功能异常的转录本,进而影响其生物学功能.肿瘤中究竟哪些机制导致这些RNA表达及功能的异常,RNA表达及功能的异常又如何影响肿瘤的发生和发展,有哪些表达或功能异常的RNA可以作为肿瘤诊断及预后判断的标志物,又有哪些RNA可以作为肿瘤靶向治疗的靶标?等等问题亟待深入探讨,RNA异常与肿瘤调控已成为肿瘤研究的前沿热点领域.
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在未编辑的谷氨酸受体2 Q/R部位促使RNA2的次黄嘌呤腺苷脱氨酶丢失引起运动神经元的缓慢死亡
目的 研究小鼠未编辑的谷氨酸受体2(GluR2)Q/R部位缺失RNA2的次黄嘌呤腺苷脱氨酶(ADAR2)是否引起缓慢的运动神经元死亡.方法 利用Cre/loxP重组系统制作一个条件性基因敲除ADAR2小鼠品系(AR2),利用基因组PCR和反转录PCR技术,将AR2小鼠的运动神经元ADAR2基因条件性定位,观察及检测AR2小鼠、携带内源性GluR2等位基因的未编辑GluR2 Q/R小鼠(AR2res)和对照组小鼠的GluR2 Q/R部位编辑率、行为特征、电生理以及组织形态.结果 AR2小鼠GluR2 Q/R部位编辑率降低,脊髓与脑运动神经核细胞显示因ADAR2缺乏引起的运动神经元死亡,并且出现运动神经功能衰退症状,而GluR2 Q/R部位的编辑率在动眼神经核无明显减少.当失去ADAR2活性的AR2小鼠携带内源性的GluR2等位基因时,细胞和表型的变化可以被阻止.结论 ADAR2失活可以引起运动神经元α-氨基-3-羟基-5甲基-4异恶唑-丙酸受体介导的死亡,而在未编辑的GluR2 Q/R部位缺乏ADAR2可以引起运动神经元缓慢死亡.
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RNA编辑酶ADAR1对EV71感染及变异的影响
目的 研究RNA编辑酶腺苷酸脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADAR1)对新型肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染及变异的影响.方法 运用RNAi技术筛选ADAR1基因沉默稳定细胞株,通过MTT分析病毒感染后细胞活力变化、噬斑形成分析病毒滴度及细胞对病毒的敏感性,以及Western blot测定病毒蛋白表达水平等,分析ADAR1对EV71感染的影响.由于ADAR1介导的RNA编辑可使基因形成A-G或T-C突变,为确定ADAR1影响EV71感染是否与其编辑EV71基因组导致病毒变异有关,对EV71流行区EV71的突变特征进行分析;并利用EV71感染ADAR1基因沉默细胞,通过对病毒基因组测序分析,研究ADAR1是否直接编辑EV71基因组.结果 ADAR1基因沉默后,与对照细胞相比,病毒感染细胞的存活率下降更快,并形成更多、更大的噬斑.病毒感染细胞中的VP1蛋白和细胞培养基上清中的病毒滴度均明显增加.EV71突变特征分析表明,虽然A-G和T-C之间的变异是病毒突变的主要类型,但EV71感染实验初步证明,ADAR1并不直接编辑EV71病毒基因组.结论 ADAR1可能具有抗EV71感染的作用,但ADAR1可能并不直接编辑EV71基因组.
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CRISPR/Cas9基因编辑技术构建靶向敲除小鼠微小RNA-101a基因的一体化载体系统
目的:利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建两种一体化载体,用于敲除AML12 细胞系中的微小RNA(microRNA, miR)-101a.方法:设计三条小鼠靶向miR-101a 基因的小向导RNA(sgRNA) 以及一条靶向绿色荧光蛋白基因的sgRNA,分别构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-EF1α-WT Cas9),并将sgRNA1 和sgRNA3 构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-U6-sgRNA-EF1α-Cas9 D10A).在AML12 细胞系中转染构建的一体化质粒,72 h 后用T7 核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)检测剪切效率.将pENTRY 一体化质粒通过Gateway 的方式重组到pAD 载体中,再转染293A 细胞进行腺病毒包装.在AML12 细胞系中进行腺病毒感染,72 h 后检测miR-101a 成熟体的表达水平以评估敲除效率.结果:构建的pENTRY 一体化质粒经测序鉴定后正确.质粒转染AML12 细胞系后进行T7EⅠ检测,均发生了明显剪切形成了两条带,表明设计的sgRNA 有效果.pENTRY 一体化质粒重组到pAD 载体中,经酶切鉴定正确.腺病毒转染AML12 细胞系后,实时荧光定量PCR 检测表明细胞中miR-101a 成熟体表达水平较对照组均明显下降(均P <0.01).结论:构建了具有较高敲除效率的靶向小鼠miR-101a 基因的一体化载体系统,为后续微小RNA 功能研究奠定了技术支撑和实验基础,同时也为其他微小RNA 敲除提供了借鉴方法.
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人乳头瘤病毒相关宫颈癌的精准筛查和治疗
宫颈癌是自身和环境共同作用下的复杂疾病.在宿主遗传易感性的基础上,高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染并整合入宿主、宿主基因组的甲基化及体细胞突变等基因组及表观基因组特征变化在宫颈癌的发生和发展中具备分子分型、早期预警及指示预后的关键作用.因此,基于第二代测序技术的HPV等分子检测及动态机器学习模型将更精准地预测真正可能致癌的患者,减轻反复筛查负担;与此同时,基因编辑技术的靶向定点切割将使HPV感染相关宫颈病变的治疗成为可能.本文回顾了HPV相关宫颈癌分子生物学研究进展,提出未来我国宫颈癌精准防治的方向.
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AZIN1慢病毒的制备及 EC109稳定感染细胞株的建立
目的：制备野生型和编辑型AZIN1的慢病毒并建立稳定感染的食管癌EC109细胞株。方法：用RT-PCR法从人食管鳞状细胞癌组织中扩增出AZIN1基因的cDNA序列，选取测序结果中目标位点的A峰与G峰均高且与NCBI公布的基因编码序列一致的PCR产物，克隆至慢病毒表达载体pLenti6／V5-D-TOPO，构建野生型和编辑型AZIN1的重组慢病毒表达载体，经酶切和测序鉴定后，经293 FT细胞包装，制备相应的慢病毒，然后感染EC109细胞株，行RT-PCR、测序和Western blot鉴定稳定感染的EC109细胞株。结果：双酶切重组慢病毒表达载体后产生了1347 bp和6915 bp的片段，经测序证实1347 bp片段为正确的AZIN1基因编码序列；RT-PCR、测序和Western blot结果证实成功建立了稳定感染的EC109细胞株。结论：成功制备了野生型和编辑型AZIN1的慢病毒并建立了稳定感染的EC109细胞株。
