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锌指蛋白Kaiso的甲基化特异性结合功能分析
目的 研究人锌指蛋白Kaiso特异性识别甲基化CpG序列的结构域.方法 构建人锌指蛋白Kaiso不同区段的原核表达载体,诱导表达获得融合蛋白,凝胶迁移实验分析其与甲基化cpG探针的特异性结合能力.结果 缺失蛋白结合段POZ结构域的GST-KaisoZF能够特异性结合甲基化的E-cadherin启动子区CpG岛探针;单纯的Kaiso三锌指或二锌指则无结合甲基化探针的能力.结论 人Kaiso蛋白锌指区能够特异性结合甲基化CpG,这种结合需要锌指结构侧翼序列的辅助.
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慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞中的表达
研究慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)中的表达情况,并检测其下游基因Nkx2.5和Flk-1的表达。方法 多位点Gateway载体构建技术构建2K7puro/EF 1α-Isl1慢病毒表达载体(由EF1α启动子启动Isl1基因表达)。包装细胞293FT细胞获得慢病毒,再转染至hMSC。利用嘌呤霉素抗性筛选出Isll阳性细胞。应用RT-PCR、Western blotting检测hMSC中Isl1基因在转染后1～6周的mRNA和1～4周的蛋白表达情况。结果 成功构建了慢病毒载体EF1α-Isl1,转染后hMSC中检测出Isl1基因mRNA和蛋白的表达,其mRNA表达随着培养时间延长而上调,第3周表达量(0.65±0.14)较1、2周增多(0.36±0.09,0.37±0.05,均P＜0.05),3周后表达趋于稳定。转染后在无任何诱导剂的情况下,检测到Isl1下游基因Nkx2.5的表达,但尚未见Flk-1的表达。结论通过慢病毒载体将Isl1基因转染hMSC后,可获得长期稳定的表达,并在无任何诱导剂的情况下,能促进下游基因Nkx2.5的表达。
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靶向Atp6i和T细胞免疫应答cDNA7的小干扰RNA载体构建及其腺相关病毒重组颗粒的制备
目的 构建靶向Atp6i和T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)的RNA干扰重组体,包装成腺相关病毒(AAV)重组颗粒,为使用该干扰重组体进行体内外基因治疗相关疾病提供依据.方法 设计特异性针对Atp6i和TIRC7基因共同区域的小干扰RNA序列,连接到经Xba Ⅰ和BglⅡ酶切线性化的pAAV.H1载体上并转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后进行测序分析.将酶切及测序分析鉴定成功的小干扰RNA序列与pAAV-RC、pHelper采用磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞,复制、包装组成AAV.H1Atp6i重组病毒颗粒,以磷酸盐缓冲液(PBS)作为空白对照组,AAV.H1Luc作为阴性对照组,荧光显微镜观察转染效率.Western免疫印迹检测AAV.H 1Atp6i重组病毒颗粒对TIRC7蛋白表达的影响.结果 成功构建靶向Atp6i和TIRC7的RNA干扰重组体.重组质粒、pAAV-RC及pHelper成功转染AAV-293细胞,转染效率近100％,成功包装成AAV.H1Atp6i重组病毒颗粒.Western免疫印迹显示TIRC7蛋白在空白对照组、阴性对照组及AAV.H1Atp6i处理组均有表达,相对分子质量为75 000,AAV.H1Atp6i处理组TIRC7蛋白表达较空白对照组和阴性对照组均下降了80％ (0.271 ±0.072比0.988±0.042、0.992±0.053,均P＜0.05).结论 成功获得靶向Atp6i和TIRC7的RNA干扰重组体以及AAV.H1Atp6i重组病毒颗粒,可以干扰TIRC7蛋白的表达.
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基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用
目的 构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体.方法 通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列；通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体.为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的整合型酿酒酵母工程菌.提取该工程酵母的基因组,通过紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的特异引物进行扩增,确认紫穗槐-4,11-二烯合酶基因是否已整合到酵母基因组上.发酵酵母工程菌,对发酵产物进行GC-MS检测,确认是否产生紫穗槐-4,11-二烯.结果 构建了1个酵母整合载体,具有如下特点:①能将外源基因表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上,增加目的基因的拷贝数;②选择标记能反复应用,方便获得多拷贝的整合形式;③整合片段不需要酶切线性化,节省了内切酶,而且简化了操作程序.酵母基因组PCR结果表明,紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上.以朱栾倍半萜为标准品,对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行GC-MS检测,发现其能产生紫穗槐-4,11-二烯,产量达到(91.33±7.57) mg/L朱栾倍半萜当量.结论 初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载体.
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pGenesil-siHBV X对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果研究
目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA(siRNA)表达载体质粒pGenesil-siHBV X对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性.方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil-siHBV X.分别用培养液(空白对照)、脂质体Metafectene、pGenesil空载体、pGenesil-siHK(阴性对照)、pGenesil-siAFP(特异性对照)、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次.于每次转染后24 h,取各组细胞培养上清液,用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量,用化学发光法检测AFP含量,用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平.结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达,且抑制作用随转染次数增加而增强.第3次转染后,pGenesil-siHBV X组细胞上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为(6.26±1.07)ng/ml、(0.13±0.05)Ncu/ml和(3.01±0.40)×107拷贝/ml,与空白对照组的(22.50±1.39)ng/ml、(1.12±0.11)Ncu/ml和(12.33±1.28)×107拷贝/ml比较,差异有统计学意义(t值分别为12.80、12.21、9.71,P＜0.05);pGenesil-siHBV X转染不影响细胞对AFP的表达(t=0.18,P=0.86).结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2.15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达.
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慢病毒靶向携带survivin-siRNA抗肺腺癌裸鼠体内研究
目的 探讨慢病毒载体介导survivin-siRNA对人肺腺癌裸鼠移植瘤的体内抑瘤活性.方法 参考siRNA的设计策略,构建表达survivin-siRNA 的慢病毒载体;于各BALB/C裸鼠右侧腋窝皮下接种人肺腺癌A549细胞悬液,构建人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型,肿瘤组织局部注射survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤的体积及随时间变化的生长曲线: 通过碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色检测细胞凋亡情况;流式细胞术检测肿瘤细胞周期变化.结果 慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠人肺腺癌A549的抑瘤率为46.07%:经过PI和Annexin-V染色区分凋亡早晚期的细胞为30%～35%,荧光显微镜下观察肿瘤细胞凋亡;G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少.结论 慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌A549的survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡.
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miR-23a-27a表达载体构建及功能初探
目的 构建miR-23a-27a簇真核表达载体并初步探讨该簇的靶基因及其功能.方法 应用分子克隆的方法构建联合表达pre-miR-23 a-27a簇及单独表达pre-miR-23a、pre-miR-27a的真核载体,应用双荧光素酶报告基因试验和real-time PCR验证该载体表达的有效性,应用microRNA靶基因预测软件和双荧光素酶报告基因试验寻找及鉴定pre-miR-23a-27a的靶基因,应用Western blot和real-time PCR的方法在乳腺癌细胞MCF-7中初步探讨miR-27a的功能.结果 (1)pre-miR-23a-27a-pcDNA3.1、pre-miR-23a-pcDNA3.1、pre-miR-27a-pcDNA3.1重组质粒能够在真核细胞HEK293T中有效转录加工出相应的miR-23a和miR-27a;(2)miR-23a和miR-27a能够同连有Sprouty2基因MRE序列的pRL-TK重组质粒作用,但是只有miR-27a能够同连有Sprouty2基因3'-非翻译区(UTR)全长序列的pRL-TK重组质粒作用,而将Sprouty2基因3'-UTR中同miR-27a结合位点定点突变后,miR-27a无法同其作用;(3)在人乳腺癌细胞MCF-7中转染pre-miR-27a-pcDNA3.1真核表达载体,能够在蛋白水平显著影响Sprouty2基因的表达,但是对其RNA水平没有显著影响.结论 Sprouty2可能是miR-27a的功能靶基因,pre-miR-23a-27a-pcDNA3.1、pre-miR-23a-pcDNA3.1、pre-miR-27a-pcDNA3.1载体的构建为下一步深入研究miR-23a和miR-27a的功能奠定了基础.
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缺失IFN-γ受体基因的天坛株减毒重组痘苗病毒载体的构建
目的构建缺失IFN-γ受体基因的天坛株重组痘苗病毒载体,初步研究其毒力的改变及B8R缺失区插入外源基因表达的稳定性.为研制表达多价抗原重组痘苗病毒载体、提高痘苗病毒载体安全性进行探索.方法采用PCR技术、多步克隆构建带有天坛株痘苗病毒B8R基因外左右侧同源臂、痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列的转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ.将痘苗病毒VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组,经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因(IFN-γ受体基因同源序列)缺失为LacZ所取代的重组病毒VTT△B8RLacZ.结果经酶切、测序鉴定转移质粒构建正确,核酸水平、外源基因生物学活性检测表明VTT△B8RLacZ在CEF细胞连续培养传代中B8R基因的缺失和插入外源基因LacZ表达均很稳定.VTT△B8RLacZ在细胞中的繁殖复制水平与VTT相当.兔皮内毒力实验表明B8R基因缺失显著降低VTT的毒力.结论本研究表明B8R基因缺失可显著降低痘苗病毒天坛株的毒力并可作为外源基因的插入区,缺失B8R基因的重组痘苗病毒可能作为新一代的表达多价抗原痘苗病毒载体.
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E2F1促进内源性XRCC1启动子的表达
目的 探讨E2F1对XRCC1的调节作用及其意义.方法 将受四环素调节的启动子控制的E2F1表达载体(tet-E2F1)和突变的E2F1(tet-132E)表达载体分别转染至Saos2细胞,构建XRCC1启动子荧光报告载体,同时转染特异的XRCC1启动子荧光报告载体和不同数量的E2F1表达载体以及E2F2、E2F4、E2F4表达载体进入Saos2细胞,收集细胞,进行荧光素酶分析,570 nm波长读取吸光度值.结果 转染E2F1表达载体和XRCC1启动子荧光报告载体,提高E2F1载体的数量可以增加荧光素酶的活性,相反.突变的E2F1(132E)不能激活XRCC1启动子荧光报告基因.结论 E2F1能够激活XRCC1启动子,并且能够使XRCC1启动子表达增强.
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含H5N1-HA基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导免疫应答的初步探讨
目的 构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗并探讨其免疫效果.方法 用Admax系统构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗,并用PCR、Western-Blot等方法对重组病毒疫苗进行鉴定;疫苗免疫小鼠后,通过HI实验和ELISPOT实验检测其体液免疫和细胞免疫反应,评价其免疫效果.结果 成功得到了含有H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗;基因表达鉴定表明,HA基因能够在细胞中进行表达;血凝抑制实验结果显示小鼠产生的针对HA抗体滴度在1:320和1:640之间;ELISPOT结果显示实验组和对照组(PBS)相比斑点数量差异有统计学意义(P<0.05),以上免疫结果表明重组腺病毒载体疫苗可以诱导小鼠产生良好的特异性体液和细胞免疫反应.结论 含H5NA-HA的重组腺病毒疫苗可以诱导小鼠产生良好的免疫反应,为研制人禽流感疫苗打下基础.
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Tat融合蛋白表达载体TAT-KLF4的克隆化及蛋白表达研究
目的 构建重组表达载体TAT-KLF4,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白.方法 经PCR获得编码人KLF4的开放读码框基因序列,酶切并连接到原核表达载体PET-28b-TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-KLF4,转化大肠埃希菌,IPTG诱导TAT-KLF4融合蛋白的表达.表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导HSF细胞的效果.结果 成功构建了TAT-KLF4融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot实验提示获得了特异性的融合蛋白.免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内.结论 为通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供了物质基础.
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增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建
目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.
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5株类鼻疽伯克霍尔德菌fur基因检测报告
目的 检测fur基因序列,探讨类鼻疽伯克霍尔德菌的毒力相关因素.方法 对5株类鼻疽伯克霍尔德菌标本进行培养和鉴定,使用PCR法扩增类鼻疽伯克霍尔德菌fur基因序列,测序结果与GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌基因组的序列进行Blast比对.结果 依据形态及生化特征,5株均被确认为类鼻疽伯克霍尔德菌.PCR法扩增fur基因片段后,经测序,其序列与GenBank中类鼻疽伯克霍尔德菌基凶组的fur基因序列同源性为99%.结论 来源于海南不同县市的5株类鼻疽伯克霍尔德菌均含有致病力的fur基因.
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病毒性肝炎遗传修饰动物模型研究进展
病毒性肝炎在全球的广泛分布和传播是一个严重的公共卫生问题，探索治疗病毒性肝炎的方法及预防用疫苗的研发都离不开合适的动物模型。本文对相关受体的发现和遗传修饰动物模型的发展、用途及优缺点进行综述，并对未来动物模型的研究发展方向进行了展望。
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幽门螺杆菌低分子质量外膜蛋白的基因克隆和重组载体构建
目的构建幽门螺杆菌26000u外膜蛋白的基因重组载体,为Hp的疫苗开发、快速诊断试剂盒的研究奠定基础方法用PCR方法从Hp染色体DNA基因组扩增26000u外膜蛋白的基因片段,将目的基因、pQE30质粒同时经BamHI、HindⅢ双酶切、纯化、连接、转染以及筛选含插入片段的重组载体.结果经酶切、测序分析插入的基因片段为表达Hp26000u外膜蛋白基因,有1.1%碱基发生变异,以及1 51%氨基酸残基改变.与文献相比,其同源性高达98%.结论 Hp外膜蛋白基因克隆、重组载体的构建将有可能为一种有效蛋白质疫苗以及快速诊断试剂盒的开发打下基础.
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幽门螺杆菌HSPB基因的克隆与序列分析
幽门螺杆菌(Hp)的研究已普遍受到关注[1-10].毒力因子中,目前研究的一个热点是热休克蛋白(heat shock protein,HSP).已知所有的Hp菌株都产生HSP,它作为分子伴侣对于Hp的生存及其致病具有重要作用[11-13].HSP位于细菌表面,具有较强的免疫原性,抗HSP免疫反应可使机体产生保护性免疫[14],因而存在着发展为疫苗成分的可能性.目前在我国对于Hp的HSP研究较少.因此,克隆中国菌株的HSPB基因,阐明其基因结构特征,对于研究它的生物学功能及探索其基因产物作为疫苗成分的价值有重要意义.
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VEGF165正反义表达载体的构建及其对人胃癌细胞VEGF表达的调节
目的构建VEGF165(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子)正、反义表达载体,将其转染人胃癌细胞,观察其对胃癌细胞VEGF在mRNA和蛋白质水平表达的调节作用.方法用限制性内切酶将VEGF165 cDNA从pGEM-hVEGF165克隆载体上切下来,以正、反方向插入质粒pCDNA3中,构建VEGF165正、反义真核表达载体;用限制性内切酶和Sanger双脱氧终止DNA测序法证明VEGF165正、反义表达载体目的基因的序列和方向的正确性;用脂质体将VEGF165正、反义表达载体转染人胃癌细胞,用RNA斑点杂交及免疫荧光流式细胞仪检测VEGF mRNA和蛋白质的表达水平.结果酶谱分析及DNA测序表明VFGF165正、反义真核表达载体目的基因的序列及方向正确;转染正义表达载体后VEGF mRNA和蛋白质表达水平增加(蛋白免疫强度为75.4%;P＜0.05vs对照组,31.6%),转染反义表达载体后VEGF mRNA和蛋白表达水平降低(蛋白免疫强度为8.9%;P＜0.05vs对照组).结论成功地构建了VEGF165正、反义真核表达载体;构建的载体能在胃癌细胞内有效表达,调节血管内皮生长因子的水平.
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HCV C基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-C的构建、鉴定及表达
目的构建能表达HCV C基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCV C基因的腺病毒载体做准备.方法用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCV C区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV C区基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-C.通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定.以抗HCV C单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-C在人肝癌细胞7721中的瞬时表达.结果酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd.HCV-C插入片段为HCV C区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达.结论构建的质粒pAd.HCV-C可以在7721细胞中瞬时表达HCV C区基因,为包装表达HCV C基因的腺病毒载体奠定了基础.
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人胃癌细胞端粒酶RNA组分hTR基因片段的克隆及其正反义真核表达载体的构建
目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,为以端粒酶为靶目标的肿瘤基因治疗奠定基础.方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列.将该片段插入pEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分(hTR)基因正义真核表达载体(pEF-hTR).随后采用EcoRV和SpeⅠ从pEF-hTR上切下该目的基因片段并反向插入pBluescript Ⅱ KS载体上的EcoRV/SpeⅠ酶切位点上.后采用KpnI和NotⅠ从pBluescript Ⅱ KS载体上切下该目的基因片段并正向插入pEF-hTR的KpnI/NotI酶切位点上从而构建出人端粒酶RNA组分(hTR)基因反义真核表达载体(pEF-ahFR).对所构建的载体均进行酶切鉴定和测序确认.结果所克隆的基因片段其碱基序列与文献报道完全一致,且插入载体的方向完全正确.结论本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分(hTR)基因的部分序列并成功构建其正义、反义真核表达载体,从而为研究反义抑制人胃癌细胞端粒酶活性对胃癌细胞生物学行为的影响奠定了基础.
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人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达
目的从人胎肝cDNA文库中克隆出人肝再生增强因子(human augmenter of liver, regeneration, hALR),并实现hALR在毕赤酵母中的表达.方法利用PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,亚克隆到pPIC9K的α因子下游并置于AOX1启动子控制下,构建成含有ALR基因的酵母表达载体.转化酵母细胞后,挑选出能在浓度为4.0 g@L-1的G418平板上生长的His+的重组酵母,利用PCR鉴定是否插入了hALR基因.重组酵母的表达在甲醇培养中进行,并利用SDS-PAGE分析hALR的表达.结果 PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,实现了其在酵母中的整和表达.结论 hALR在毕赤酵母中的表达是可行的.
