首页 > 文献资料
-
痘苗病毒主要核心蛋白水解的研究进展
痘苗病毒(vaccinia virus,VV)是痘病毒科正痘病毒属的dsDNA病毒,具有独特的形态及宿主细胞质复制位点[1].其病毒颗粒有4个结构组分:核心、侧体、外膜和包膜(只存在细胞外包膜病毒中)[2].该病毒的基因组大约185 ～ 200kb,编码200多种不同的病毒蛋白[3].VV在复制晚期(即病毒DNA合成后)发生了一系列复杂反应,用以形成成熟的病毒粒子[4].
-
痘苗病毒载体在冠状病毒反向遗传学中的应用
反向遗传学方法是研究RNA病毒的主要方法,痘苗病毒载体则是感染性克隆技术的主要媒介,目前这一技术已趋向成熟并扩大其应用领域及对象.本文对痘苗病毒载体的构建、在冠状病毒反向遗传学中的应用情况以及目前该领域的进展作一综述.
-
按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1 gag基因提高表达水平的研究
为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1 gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究.结果显示:①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7.5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Western blot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17%.上述结果表明:按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素.
-
正痘病毒基因结构及功能研究的几项进展
正痘病毒载体在重组疫苗研究中有广泛前景,但其罕见但较为严重的副反应阻碍了发展.正痘病毒属中具有较宽宿主范围的痘苗病毒和牛痘病毒具有典型的宿主范围基因K1L、CP77和C7L.这三个基因对不同宿主细胞具有选择性,可以扰乱宿主细胞信号通路,并且与病毒的毒力相关.
-
适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体的构建
为构建适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体,利用标记瞬时稳定的原理,在痘苗病毒单选择标记载体psc65的基础上,构建成带有neo和LacZ双选择标记的痘苗病毒载体pVI75.为检验载体pVI75的有效性,将HIV-1合成基因syngpnef插入到载体pVI75上,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,并与天坛株752-1痘苗病毒共转染CEF细胞.筛选得到的重组病毒经PCR和Dot blot检验表明,标记基因已被删除,而目的基因被整合到痘苗病毒基因组上.Westem blot检测结果表明,目的基因的表达正确.痘苗病毒载体pVI75的构建使得疫苗株筛选的工作量大为降低,时间大大缩短,为利用痘苗病毒载体构建重组病毒疫苗株的研究提供了参考.
-
表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建
为研制HPV16的治疗性疫苗,首先将表达质粒pJSA1175与非复制型痘苗病毒NTVJTK+进行同源重组,构建了痘苗重组病毒NTVJLac.再将表达质粒pJSDME6E7R与NTVJLac进行同源重组,构建了表达HPV16 E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7,并对获得的重组病毒进行了鉴定.Southern杂交显示,重组痘苗病毒NTVJmE6E7基因组中有E6和E7基因插入.该重组病毒在人源细胞中不复制.Western blot显示,重组病毒在人源TK-143细胞中能表达E6和E7蛋白.非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7可作为HPV16相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的实验性疫苗株.
-
免疫酶技术在修饰的安卡拉痘苗病毒感染性滴度检测中的应用
修饰的安卡拉痘苗(modified vaccinia Ankara,MVA)是MVA病毒在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中经过一系列的传代得到[1],在人体内可以表达MVA病毒蛋白及其携带的外源基因蛋白,但却不形成完整的病毒颗粒,为人体内复制缺陷性病毒[2],安全性好,即使在免疫功能缺陷病人和免疫抑制的恒河猴体内也未显示出明显的副作用.
-
HIV复制型痘苗病毒载体疫苗免疫原性分析
目的分析比较HIV复制型痘苗病毒载体疫苗在小鼠和家兔体内的免疫原性.方法 HIV痘苗病毒载体疫苗vTKgpe以肌内、皮下、皮内3种途径接种小鼠,每周采血检测HIV特异性抗体和针对痘苗病毒载体的抗体,4周时取脾细胞用流式细胞仪检测细胞免疫.此外vTKgpe 皮内途径接种2只家兔,每周采血检测抗体.结果肌内和皮下免疫的小鼠在2周时开始出现HIV特异性抗体,4周时开始消失;针对痘苗病毒载体的抗体滴度在4周时急剧升高;血清吸附实验表明痘苗病毒抗体的升高对HIV特异性抗体检测有一定的掩盖.细胞免疫仅在皮内免疫的小鼠中检测到.家兔的HIV特异性抗体在2周时出现,并能维持一段时间.结论在小鼠体内,肌内和皮下注射2种途径倾向于诱导体液免疫,而皮内接种则以诱导细胞免疫为主.家兔对痘苗病毒的敏感性要高于小鼠.
-
缺失IFN-γ受体基因的天坛株减毒重组痘苗病毒载体的构建
目的构建缺失IFN-γ受体基因的天坛株重组痘苗病毒载体,初步研究其毒力的改变及B8R缺失区插入外源基因表达的稳定性.为研制表达多价抗原重组痘苗病毒载体、提高痘苗病毒载体安全性进行探索.方法采用PCR技术、多步克隆构建带有天坛株痘苗病毒B8R基因外左右侧同源臂、痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列的转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ.将痘苗病毒VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组,经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因(IFN-γ受体基因同源序列)缺失为LacZ所取代的重组病毒VTT△B8RLacZ.结果经酶切、测序鉴定转移质粒构建正确,核酸水平、外源基因生物学活性检测表明VTT△B8RLacZ在CEF细胞连续培养传代中B8R基因的缺失和插入外源基因LacZ表达均很稳定.VTT△B8RLacZ在细胞中的繁殖复制水平与VTT相当.兔皮内毒力实验表明B8R基因缺失显著降低VTT的毒力.结论本研究表明B8R基因缺失可显著降低痘苗病毒天坛株的毒力并可作为外源基因的插入区,缺失B8R基因的重组痘苗病毒可能作为新一代的表达多价抗原痘苗病毒载体.
-
痘苗病毒增强子样序列的筛选及应用研究
目的 从痘苗病毒基因组中筛选原核增强子样序列,构建携带原核增强子样序列的表达载体,探讨其对干扰素基因表达的影响.方法 采用氯霉素乙酰转移酶基因(cat)作为报告基因,从痘苗病毒基因组中筛选具有原核增强子样活性的序列,构建携带增强子样序列VV1的表达载体,表达干扰素基因和检测干扰素活性.结果 从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选出18个在大肠埃希菌中具有增强活性的序列,从中筛选到两个原核增强子样序列VV1和VV16,VV1正反向分别可使lacZ基因活性提高10.9倍和3.8倍,VV16正反向分别可使lacZ基因活性提高9.0倍和4.1倍;证实它们的增强活性体现在转录水平;用痘苗病毒增强子样序列VV1构建的表达载体,其表达的IFN-α2b型干扰素比原表达载体活性高2.6倍.结论 从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选到2个原核增强子样序列-携带有痘苗病毒增强子样序列的表达载体可提高干扰素基因的表达水平.
-
痘苗病毒VV1原核增强子样序列的克隆及其功能和应用研究
目的 从痘苗病毒基因组中克隆原核增强子样序列VV1,并对其结构、功能和应用进行研究.方法 采用氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)作为报告基因,从痘苗病毒基因组中筛选具有原核增强子样活性的序列,采用末端定向缺失试验对原核增强子样序列进行结构与功能研究,用携带增强子样序列表达载体表达干扰素基因.结果 从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选到原核增强子样序列VV1,正反向分别可使lacZ基因活性提高10.9倍和3.8倍,末端定向缺失试验证实,5'末端20 bp的核苷酸序列和3'末端20 bp的核苷酸序列对于VV1的活性具有重要作用,因为缺失任意一个都会导致增强活性的大幅度下降.而5'末端30～50 bp的核苷酸序列对于保持VV1片段的基本活性非常重要,缺失它时VV1的活性完全消失.用携带VV1的表达载体表达的IFN-α2b型干扰素比原表达载体活性提高2.6倍.结论 从痘苗病毒天坛株DNA基因组中筛选到原核增强子样序列VV1,末端定向缺失试验证实VV1功能区,携带痘苗病毒增强子样序列VV1的表达载体可提高干扰素基因的表达水平.
-
应用痘苗病毒载体表达的重组甲肝抗原特性的研究
目的 探讨以痘苗病毒载体表达的甲肝病毒培养合适的细胞系和重组病毒灭活以及甲肝病毒抗原保存条件.方法 将构建成功的表达甲肝抗原的重组痘苗病毒分别接种于K4、143、HEL、Hep-2和Vero等细胞,用ELISA测定重组甲肝抗原的表达产量和不同方法灭活重组病毒后的抗原活性.结果 在K4、143和HEL细胞表达重组甲肝抗原的产量略优于Hep-2和Vero细胞,重组病毒经β-丙内酯和甲醛灭活后,甲肝抗原活性不变,制备的重组甲肝抗原稳定性好.结论 痘苗病毒表达载体可以提高甲肝抗原表达效率,具有十分广阔的应用前景.
-
表达HPV18E7E6的重组痘苗病毒构建及免疫效果的初步研究
目的 构建表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,并对E7E6蛋白的免疫原性进行研究.方法 将去除了转化活性的HPV18E6、E7基因融合,插入痘苗病毒重组质粒,通过同源重组构建表达HPV18E7E6的重组痘苗病毒,观察其免疫效果.结果 构建了表达E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,PCR鉴定及测序表明融合基因序列与设计相符,正确插入到痘苗病毒TK区域;Western-Blot检测表明该重组病毒能表达HPV18E7E6融合蛋白.免疫后的小鼠可产生E6、E7特异性抗体,但ELISPOT没检测到E7肽库刺激小鼠脾细胞产生分泌IFN-丫的阳性反应.结论 构建了一株表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒,可以有效诱发小鼠产生针对E6、E7的体液免疫,但不能诱发产生相应的细胞免疫,为进一步研究不同动物模型中HPV18E6E7的细胞免疫特点提供了实验基础.
-
表达IL-2的重组非复制型痘苗病毒的构建及活性检测
目的 构建表达IL-2的重组非复制型痘苗病毒株并体外检测其生物活性.方法 以非复制型痘苗病毒天坛株为载体,通过同源重组、蓝白斑纯化筛选表达IL-2的非复制型重组痘苗病毒rNTV1175IL2H6LacZ,并通过PCR对其进行IL-2基因插入鉴定,Western Blot鉴定IL-2的表达,同时对其进行体外生物活性检测.结果 经PCR鉴定,痘苗病毒TK区7.5启动子下正确插入了IL-2基因511bp,Western Blot结果表明其表达IL-2蛋白相对分子质量大小为15000,与标准品IL-2一致.rNTV1175 IL2H6LacZ分泌表达在细胞培养液中的IL-2能使IL-2依赖CTLL-2细胞株生长,MTT法测得重组病毒表达在细胞培养液中的IL-2生物活性值为8.79 IU/ml.结论 成功构建了表达具有生物活性IL-2的重组非复制型痘苗病毒株rNTV 1175 IL2 H6 LacZ,为其作为病毒载体佐剂应用打下了基础.
-
痘苗病毒实验室获得性感染病例的状况及特征分析
目的 通过分析文献报道的痘苗病毒实验室感染病例状况与特征,为预防和控制我国痘苗病毒实验室获得性感染提供相关建议与措施.方法 选择PubMed、Embase、Biosis以及涵盖SCIE、SSCI、CPCI-S和CPCI-SSH的Web of Science作为数据源,检索痘苗病毒实验室获得性感染文献,对获取病例资料从是否接种疫苗、症状出现时间、发病部位、症状特征、发生原因等方面信息进行分析.结果 52％病例从未接种过疫苗,82.4％病例在从事痘苗病毒相关研究10年内未接种过疫苗,52.9％病例是在进行动物实验过程中意外针刺手部而导致感染,70.6％病例感染部位发生在手部,暴露后平均5.1天出现感染症状.结论 虽然在开展痘苗病毒相关研究工作之前是否接种疫苗还存在争议,但严格遵守生物安全操作要求,加强个人防护,出现意外情况后立即采取现场应急措施,及时就诊并向医生提供研究背景信息应是预防和控制痘苗病毒实验室获得性感染的重要方面.
-
去除痘苗病毒显性表位B8R对外源抗原免疫原性的增强
目的 去除B8R对外源抗原免疫原性的影响,为降低载体的免疫优势从而提高疫苗的有效性提供参考.方法 利用针对痘苗病毒的pSC11质粒,构建插入OVA的质粒pSC11-OVA,在CV-1细胞中与去除B8R的痘苗病毒重组,筛选纯化获得重组病毒.利用体外培养细胞,检测B8R缺失和外源抗原插入对病毒感染复制特性的影响；利用感染小鼠模型,检测重组病毒诱发的针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应；采用体征及神经行为学评分系统,检测重组病毒的毒力.结果 B8R缺失和OVA导入对痘苗病毒的生物学特性无明显影响；去除B8R后,外源性OVA成为显性表位,针对OVA的细胞免疫应答和免疫记忆效应明显增强；去除B8R还可显著降低痘苗病毒的毒力.结论 去除B8R可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应,增加外源性抗原的免疫原性.去除痘苗病毒本身的显性表位,可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体.
-
表达HPV-16结构蛋白的重组痘苗病毒疫苗免疫效果研究
目的 研究表达HPV-16结构蛋白L1和L2的重组痘苗病毒(rVVL1L2)的免疫效果.方法 以重组痘苗病毒rVVL1L2免疫C57BL/6小鼠,用酶联免疫(ELISA)和酶联免疫斑点(ELISPOT)方法检测重组痘苗病毒诱发小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平;利用C3肿瘤细胞在C57BL/6小鼠中的成瘤模型,观察重组痘苗病毒在抗肿瘤移植实验和肿瘤生长抑制实验中对小鼠的免疫保护效果.结果 重组痘苗病毒rVVL1L2免疫的小鼠,可以检测到针对L1和L2特异的抗体、L1165～173肽特异性的、分泌IFN-γ的T细胞;同时可以观察到免疫后的C57BL/6小鼠,可以有效预防HPV-16相关肿瘤细胞(1.5×105 C3细胞)的攻击;对已产生的肿瘤,可以延缓肿瘤细胞的生长速度.结论 重组痘苗病毒rVVL1L2可以有效诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,为研究预防和治疗HPV-16感染的疫苗提供了实验资料.
-
改良型痘苗病毒安卡拉株(MVA)作为递送载体在抗感染治疗中的应用
改良型痘苗病毒安卡拉株( modified vaccinia virus Ankara,MVA)是人类在寻求痘苗病毒作为天花疫苗的过程中获得的高度减毒的痘苗毒株. MVA来源于一个土耳其的痘病毒毒株(chorioallantois vaccinia virus Ankara,CVA),CVA在鸡成纤维细胞中传代570代后得到MVA[1]. 对MVA全基因序列测序后发现, MVA基因组全长178 kb,与CVA相比MVA在传代的过程中丢失了大约15%(30 kb)的病毒基因,这些基因大多与病毒的毒力和宿主选择范围密切相关[2].MVA在允许细胞(permissive cell),如BHK-21、CEF等细胞内,可以完成完整的生活周期. 而在非允许细胞( non-permis-sive cell) ,如大部分哺乳动物和人类细胞内,MVA病毒的早期和晚期蛋白都进行了表达,但是病毒不能包装成完整的粒子[3]. 与其他痘病毒一致,MVA在感染细胞后,基因组不进入细胞核,而是在细胞质中依赖自身的启动子与转录系统来完成基因的复制与表达. 传代过程中MVA丢失了6个主要的基因片段,这些部位可以用来插入25 kb以上的外源基因,并且在外源基因插入后并不影响病毒本身的感染能力和表达能力[4].
-
溶瘤痘苗病毒：一种很有前途的癌症治疗药剂
痘苗病毒因其在人类消灭天花中的广泛应用，以及天然具有选择性感染肿瘤细胞并在其内复制进而裂解肿瘤细胞而不影响正常组织的特性，成为一种很有前途的肿瘤治疗生物制品。近些年，有很多策略被成功用于改造痘苗病毒以提高病毒的肿瘤选择性和抗肿瘤活性。到目前，这种经改造的痘苗病毒如JX-594在治疗癌症上取得了可喜的成果，且在临床试验中进展迅速。本文首先简要介绍痘苗病毒，然后重点综述溶瘤痘苗病毒的改造策略和临床试验的新进展情况，后还将探讨痘苗病毒作为溶瘤药物面临的主要挑战和未来发展方向。
-
结晶紫蚀斑法检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗病毒滴度方法的建立
目的 建立重组天坛株痘苗病毒(rTV)艾滋病疫苗的结晶紫蚀斑病毒滴度检测方法,为rTV艾滋病疫苗病毒滴度测定提供更稳定的方法.方法 通过对Vero细胞浓度、病毒吸附时间及温度、病变判定时间等方面进行优化,建立rTV艾滋病疫苗病毒滴度的结晶紫蚀斑检测方法,并应用BioSpot Reader进行蚀斑计数及分析,比对仪器蚀斑计数和人工蚀斑计数的相关性；应用血球吸附法、中性红蚀斑、结晶紫蚀斑3种方法,对多批rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒滴度进行检定,进行3种方法的相关性分析；采用结晶紫蚀斑法重复测定样品,计算变异系数(CV),对方法的精密性进行验证；采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析.结果 确定Vero细胞浓度为5.0×105 ～9.0×105个/ml时,病毒37℃吸附2h后加入含甲基纤维素的维持液,培养72 h,应用BioSpot Reader进行蚀斑计数,与人工计数的相关系数r=0.985,能客观反映不同大小的病毒蚀斑,降低了人工计数引起的非客观因素误差；经过3种方法对不同批次的rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒进行病毒滴度检定,结晶紫蚀斑与血吸附法的相关系数r=0.997,结晶紫蚀斑法与中性红蚀斑法相关系数r=0.980 (P＜0.01),具有高度相关性.结论 建立了可用于rTV艾滋病疫苗病毒滴度检测的结晶紫蚀斑方法.
