IL-15基因佐剂对HIV-1B亚型gp160 DNA及腺病毒载体疫苗的免疫效果的影响

本研究构建了IL15质粒以评估其对表达HIV-1gp160的DNA和腺病毒5型载体疫苗的免疫效果的影响.我们构建表达IL15的质粒pVR-IL15,将pVR-IL15联合pVR-HIVgp160初免Ad5-HIVgp160加强方式免疫BALB/c小鼠,用IFN-γ ELISPOT和ELISA等方法比较疫苗单独免疫组小鼠与疫苗加IL15佐剂组小鼠诱导的细胞免疫和体液免疫反应的强度.结果显示疫苗加IL15佐剂组小鼠诱导的细胞免疫反应和体液免疫反应比疫苗单独免疫组小鼠相均有显著增强.构建的IL15基因佐剂可以增强HIV DNA疫苗初免和腺病毒疫苗加强免疫策略的免疫效果.

艾滋病疫苗：赋予猴子持久的免疫力

亚特兰大Emory大学的Harriet Robinson在重新设计艾滋病疫苗实验中获得了激动人心的结果——发现一种两步艾滋病疫苗，这种疫苗能激发持久的免疫力。 Robinson与她在Emory以及国家过敏反应和传染病研究院(NIAID)的同事合作，围绕一种实验室制备的杂交病毒SHIV 设计了他们的实验。这种病毒是由部分HIV和部分SIV(一种猴的艾滋病病毒)组成的。他们首先将含有连接在细菌DNA 上的几种SHIV基因的疫苗给24只猴子注射。然后，用含有重组的改良牛痘Ankara(MVA，被用作天花疫苗的一种病毒)携带的一系列SHIV基因的试剂对动物加强免疫。裸DNA和MVA都能刺激免疫系统以消除被感染的细胞，而不只是防止感染。Robinson与其同事计划将SHIV置于动物直肠“攻击”已接种过疫苗的猴子来检验这种疫苗。他们进行了3次实验，成功地制备了攻击物，即用已在猴子身上确定了的能直肠接种感染的小量的SHIV。接种过疫苗的24只猴都被SHIV感染了，但20周后其中的23只控制住了感染且未受到免疫损害。4只未接种疫苗的对照猴却相反，它们的血中均具有高的SHIV水平，随后都死于艾滋病。这种DNA/MVA疫苗的HIV变体被批准于明年初在美国进行人类实验。 (Science，2001，291:1879～1881)(马兵李学军)

含HIV-1 gag基因的重组腺病毒5型与35型嵌合病毒免疫效果研究

目的 探讨含HIV-lgag基因的重组腺病毒5型与35型嵌合病毒(rAd5/F35)在BALB/c小鼠中的免疫效果.方法 PCR,间接免疫荧光鉴定HIV-1 gag基因在重组腺病毒(rAd5/F35-mod.gag)的正确插入和体外细胞水平的表达,用rAd5/F35-mod.gag以不同的方式免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中的p24特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测小鼠的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答.结果 重组腺病毒rAd5/F35-mod.gag在体外细胞水平可以很好的表达目的基因gag;在小鼠体内重组腺病毒rAd5/F35-mod.gag可诱导特异性的CTL应答和血清IgG抗体反应,用rAd5/F35单独免疫2次,所诱发的CTL和血清IgG反应强.但Ad5初次感染后,产生的抗Ad5抗体可以抑制rAd5/F35疫苗的特异性免疫反应.结论 重组腺病毒rAd5/F35-mod.gag单独免疫可在小鼠体内诱导特异性的CTL应答和血清IgG抗体反应.只改变Ad5纤突蛋白Fiber,不能避免抗Ad5抗体的抑制作用.

表达HIV-1 gag-pol△和gp 140 TM蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及免疫效果研究

目的构建表达人免疫缺陷病毒Ⅰ型gag-pol△和gp140TM基因的非复制型重组腺病毒.方法首先将HIV-1的gag-pol△和gp140TM基因插入穿梭载体,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183,获得重组子.转化293细胞后获得重组病毒.重组腺病毒与DNA疫苗联合免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清中的抗体.结果获得两株重组腺病毒vAd-gag-pol△和vAd-gp140TM,能正确表达Gp140TM、Gag蛋白以及经剪切加工的P24蛋白,与DNA疫苗联合免疫小鼠后能产生高滴度的HIV-1特异性的抗体.结论成功构建了表达HIV-1结构基因的重组腺病毒,能有效诱导HIV-1特异性抗体.

含密码子优化的SIV gag基因的DNA疫苗与rAd5疫苗构建及免疫原性评价

目的 构建含有SIVgag基因的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗,为后期在SIV感染的猴模型中进行多载体疫苗联合免疫策略的治疗效果评价奠定基础.方法 将SIV gag基因按照哺乳动物偏嗜密码子进行优化并构建至pVR载体,作为DNA疫苗.以Western Blot方法比较优化前后gag基因表达水平.将优化后的gag基因插入重组腺病毒载体,构建rAd5-SIVgag疫苗.在BALB/c小鼠中分别比较DNA疫苗及rAd5-SIV.gag疫苗单独及联合免疫的效果.结果 密码子优化的SIVgag基因的表达水平远高于野生型SIVgag基因.重组腺病毒疫苗免疫一次或两次诱导的细胞免疫反水平分别高于DNA疫苗免疫一次或两次.两种疫苗联合免疫的反应水平与腺病毒疫苗免疫两次的水平相当,高于DNA疫苗单独免疫及腺病毒疫苗单独免疫一次的结果.结论 成功优化了SIV gag基因,使其不依赖Rev高水平表达；成功构建了表达优化后SIV gag基因的DNA疫苗和rAd5疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.

表达HIV-1 gag基因的重组AAV2/1和Ad5疫苗免疫原性比较

目的 在小鼠体内比较表达HIT-1 gag基因的重组AAV2/1和Ad5疫苗的免疫原性.方法 分别用rAAV2/1-gag或rAd5-gag单独免疫BALB/c小鼠一次或两次,于免疫后不同时间点用CFSE染色法和胞内细胞因子染色法检测Gag特异性细胞免疫应答,用ELISA方法检测Gag特异性抗体反应.结果 单次免疫结果显示,在所有检测点rAd5-gag所诱导的Gag特异性CTL应答都比rAAV2/1-gag强,抗体反应在免疫后4周无明显差异.两次免疫后4周的检测结果表明,rAd5-gag所诱导的Gag特异性CTL应答比rAAV2/1-gag强,但抗体反应比rAAV2/1-gag组弱.结论 rAd5-gag诱导了很好的HIV-1特异性细胞和抗体反应,而rAAV2/1-gag诱导的HIV-1特异性抗体反应很强,但细胞免疫应答较弱.

含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒疫苗联合免疫的研究

目的探讨含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒(rAAV)和重组腺病毒(rAdV)疫苗在BALB/c小鼠中联合免疫的效果.方法将密码子优化的HIV-1 gp120基因分别插入腺相关病毒(AAV)和腺病毒(AdV)载体质粒,构建含该基因的rAVV和rAdV载体疫苗.将两种疫苗以不同的联合方式免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中的gp120特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测小鼠的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答.结果两种重组病毒均可表达目的基因gp120;在小鼠体内两种重组病毒联合免疫可诱导特异性的CTL应答和血清IgG抗体反应,但用rAAV初免2次,再用rAdV加强3次所诱发的CTL和血清IgG反应强.结论rAAV和rAdV疫苗联合免疫可在小鼠体内诱导特异性的CTL应答和血清IgG抗体反应.

含密码子优化型HIV-1 gp120基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

目的构建能表达野生型和密码子优化型人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)B亚型中国流行株gp120基因的非复制型腺病毒.方法按哺乳动物细胞偏好的密码子对HIV-1 B亚型中国流行株Ch gp42的gp120基因进行优化,合成优化基因.将野生型和密码子优化的gp120基因插入穿梭质粒,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183,获得重组子,转染293细胞后获得重组病毒.分别以两种重组腺病毒疫苗免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清中的特异性抗体,乳酸脱氢酶法检测小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.结果获得两株重组腺病毒rad-wt.gp120和rAd-mod.gp120,能正确表达Gp120.rAd-mod.gp120比rAd-wt.gp120蛋白表达水平明显提高.重组腺病毒免疫小鼠后能产生HⅣ-1特异性的抗体及CTL反应,rAd-mod.gp120组明显优于rAd-wt.gp120组结论成功构建了表达野生型和密码子优化的HIV-1 gp120基因的重组腺病毒,能诱导HIV-1特异性体液和细胞免疫反应.

HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因改造及其重组DNA疫苗的构建

目的 构建表达含有密码子优化的HIV-1 CRF01_AE亚型env基因的DNA疫苗,为多载体艾滋病治疗性疫苗的应用提供候选疫苗.方法 对HIV-1感染者血液样本进行型别分析,分型得到的AE亚型标本采用亚型特异性引物克隆env基因,通过序列比对获得其共有序列,对该序列按照哺乳动物密码子使用的偏嗜性进行优化,将人工合成的优化基因克隆至pVR载体,构建DNA疫苗.通过Western Blot方法比较优化前后env基因的表达.结果 成功获得32条具有完整的开放性阅读框的env克隆,型别分析确认均为CRF01_AE亚型.成功对其共有序列进行了优化、合成并构建了DNA疫苗pVR-mod.AE env,该疫苗与野生型的env基因(wt.AE env)相比可以高水平表达env基因,且不依赖Rev的存在.结论 对HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的优化改造及重组DNA疫苗的构建是成功的.

中国HIV-1 CRF01_AE流行株结构基因和调节/辅助基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究

目的 构建表达gag-env融合基因和tat-rev-integrase(c-holf)-vif-nef融合基因的DNA疫苗,并评价其免疫原性.方法 按人源密码子使用频率对AE2f株的gag、env、tat、rev、integrase、vif和nef基因序列进行优化,构建真核表达质粒.用Western blot法验证体外表达情况;用ELISPOT法检测小鼠的细胞免疫反应.结果 限制性酶切及DNA测序结果表明两个融合基因质粒构建正确,可以表达相应的融合蛋白.ELISPOT结果显示,Gag-Env特异性的T细胞反应强度为(3010±566)SFC/10~6脾细胞;Tat-Rev-Integrase(C-half)-Vif-Nef融合蛋白特异性的T细胞反应为(948±737)SFC/10~6脾细胞,均显著高于空载体组.结论 构建的表达HIV-1 CRF01_AE流行株gag-env融合基因和tat-rev-integrase(c-half)-vif-nef融合基因的DNA疫苗可以正确表达所编码的融合蛋白并有效地激活机体的T细胞免疫反应.

人类免疫缺陷病毒膜蛋白变异与广谱中和抗体产生关系的研究进展

自人类免疫缺陷病毒（ HIV）被确定为获得性免疫缺陷综合症（ AIDS）的病原体以来，艾滋病疫苗研发已有近30年的历史，先后已对上百种疫苗进行了临床试验。初的疫苗研究以诱导gp120膜蛋白抗体为主，该类疫苗不能有效预防HIV-1感染或延迟疾病进程［1-2］。之后疫苗研究转至以诱导细胞免疫为主，默克公司以5型重组腺病毒（ Ad5）为载体的疫苗曾被给予厚望，虽然该疫苗诱导了特异性CD8＋T细胞反应，但不能有效预防病毒感染，甚至疫苗免疫组的感染率高于对照组［3］。近，研究人员重新将目光聚焦于大限度地诱导强效、广谱中和抗体的疫苗研究上。2009年，泰国开展的RV144Ⅲ期临床试验，在受试的高危异性恋人群中取得了约31％的保护作用［4］，让人们看到了艾滋病疫苗研究的希望。但是，鉴于该疫苗较低的保护效率，是否推广应用还存在较大争议，还需要极大的努力去改进这类疫苗和研发新疫苗。

结晶紫蚀斑法检测重组痘苗病毒艾滋病疫苗病毒滴度方法的建立

目的 建立重组天坛株痘苗病毒(rTV)艾滋病疫苗的结晶紫蚀斑病毒滴度检测方法,为rTV艾滋病疫苗病毒滴度测定提供更稳定的方法.方法 通过对Vero细胞浓度、病毒吸附时间及温度、病变判定时间等方面进行优化,建立rTV艾滋病疫苗病毒滴度的结晶紫蚀斑检测方法,并应用BioSpot Reader进行蚀斑计数及分析,比对仪器蚀斑计数和人工蚀斑计数的相关性；应用血球吸附法、中性红蚀斑、结晶紫蚀斑3种方法,对多批rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒滴度进行检定,进行3种方法的相关性分析；采用结晶紫蚀斑法重复测定样品,计算变异系数(CV),对方法的精密性进行验证；采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析.结果 确定Vero细胞浓度为5.0×105 ～9.0×105个/ml时,病毒37℃吸附2h后加入含甲基纤维素的维持液,培养72 h,应用BioSpot Reader进行蚀斑计数,与人工计数的相关系数r=0.985,能客观反映不同大小的病毒蚀斑,降低了人工计数引起的非客观因素误差；经过3种方法对不同批次的rTV艾滋病疫苗及天坛株痘病毒进行病毒滴度检定,结晶紫蚀斑与血吸附法的相关系数r=0.997,结晶紫蚀斑法与中性红蚀斑法相关系数r=0.980 (P＜0.01),具有高度相关性.结论 建立了可用于rTV艾滋病疫苗病毒滴度检测的结晶紫蚀斑方法.

抗病毒治疗在阻断艾滋病传播流行中的作用

据2009 年,卫生部和联合国艾滋病规划署、世界卫生组织联合评估报告:我国艾滋病疫情持续上升,流行模式呈多样化[1] .从1981 年艾滋病首次被发现至今的30 年间,人类在艾滋病疫苗、健康教育与行为干预、抗病毒治疗等领域都取得了很多进展.2007 年,随着被认为有希望的艾滋病疫苗研究,Merck 公司以细胞免疫为主的腺病毒重组疫苗Ⅱb 期临床实验宣告失败,整个艾滋病疫苗研究领域进入了低谷,在短期内看不到疫苗研制成功的希望[2-3] .

STEP试验对艾滋病疫苗研究领域的挑战

2007年宣布的艾滋病疫苗的分步试验(STEP试验)中期分析显示,基于复制缺陷性5型腺病毒载体的重组艾滋病疫苗,不仅不能保护人体免受艾滋病病毒(HIV)感染或降低HIV感染者的病毒载量,还可增加部分受试者对HIV感染的易感性.此结果使国际艾滋病疫苗研究面临着空前挑战.该文回顾了STEP试验及其对国际艾滋病疫苗研究策略的影响.

2004年国际艾滋病疫苗大会报告综述

2004年国际艾滋病疫苗会议于2004年8月30日至9月1日在瑞士洛桑举行.世界各地的艾滋病疫苗研究人员约 1 000余人集结于这个日内瓦湖畔美丽的小城,总结了当前艾滋病疫苗研究的相关领域的经验与教训,共同探讨所面临的机遇与挑战.本次大会的学术报告共分以下几个方面:

艾滋病疫苗临床试验及其研发策略

全球艾滋病流行的严峻趋势迫切需要研制安全、有效、价廉的艾滋病疫苗.尽管国际上艾滋病疫苗研究已有20年的历史,但仍然未获成功.该文将就国际艾滋病疫苗的研究历史、发展阶段、研发特点进行综述,并重点回顾国内外艾滋病疫苗临床试验的进展情况,并对艾滋病疫苗的研发策略进行探讨.

艾滋病疫苗的研制与试验进展

DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗Balb/c小鼠重复给药毒性研究

目的:对DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗进行重复给药毒性研究,以支持其Ⅰ期临床研究方案的制定.方法:Balb/c小鼠肌肉注射DNA疫苗3次后,皮内接种痘苗1次加强免疫.检测疫苗对一般毒理学指标的影响、监测疫苗的免疫原性、免疫毒性.结果:DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗具有较强的免疫原性,可以诱导较强的T细胞免疫反应且可以维持较长时间.未见疫苗相关的一般毒性和免疫毒性.结论:DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗可以诱导较强的体液免疫和细胞免疫反应,对一般毒理学指标未见显著影响,未见明显免疫毒性.目前该疫苗正处在临床研究阶段.

著名病毒学、生物制品学家李河民研究员

李河民研究员，中共党员，是我国著名病毒学家和生物制品学家，1922年6月生于台湾省高雄县，1944年毕业于日本医科专门学校。回国后，先后在北平的华北防疫处和协和医院卫生事务所等处进修和工作，抗战胜利后，于1946年6月参加中国人民解放军到解放区后方医院工作。1951～1955年在前苏联莫斯科中央生物制品科学检定所学习并获副博士学位。1955年学成回国后一直在中国药品生物制品检定所工作至今。他曾于1981年至1999年任所长、名誉所长，现任顾问。兼任卫生部病毒性肝炎专家咨询委员会主任委员、卫生部艾滋病疫苗指导委员会主任、卫生部生物制品标准化委员会顾问、《中华微生物学》和《免疫学杂志》主编等职。还担任北京市台联会名誉会长等。

DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗小鼠体内生物分布研究

目的 考察DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗在小鼠体内生物分布情况.方法 采用定量PCR方法分别对复合疫苗免疫后DNA疫苗的分布情况以及复合疫苗组分HIV-痘病毒载体疫苗单独免疫后的生物分布情况进行测定.结果 复合疫苗免疫后5d和30d,主要是在注射部位检测到质粒DNA残留,在免疫后第56d,各脏器均未检测到质粒DNA残留.HIV-痘病毒载体疫苗单独免疫后第5d,仅在给药部位检测到DNA残留,免疫后第36d,各脏器均未检测到DNA残留.结论 复合疫苗免疫机体后短期只在注射部位分布,且随时间延长减少至消失,不会长期在机体内存留.