首页 > 文献资料
-
赖氨酰tRNA合成酶在HIV-1生物学功能中的作用研究进展
赖氨酰tRNA合成酶(Lysyl-tRNA synthetase,LysRS)不仅执行着蛋白合成等各种细胞生物学功能,而且在Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的赖氨酸tRNA(tRNALys)选择性包装中发挥着重要作用.在HIV-1病毒包装中,tRNALys作为起始逆转录的引物,tRNALys包装复合物包括核心蛋白Gag、多聚酶蛋白Gag-Pol、病毒基因组RNA、tRNALys和LysRS.研究表明tRNALys包装复合物形成时,Cag/Gag-Pol/病毒基因组RNA复合物和tRNALys/LysRS复合物相互作用,其中Gag和Gag-Pol、LysRS,Gag-Pol和tRNALys相互作用.LysRS包装进病毒不需要tRNALys的存在,而tRNALys包装进病毒依靠和LysRS的作用.线粒体的LysRS是病毒LysRS的主要来源.LysRS氨酰化tRNALys,并且LysRS是tRNALys特异性的包装进病毒粒的限制因子,但tRNALys的氨酰化对于病毒包装来说是不需要的.
-
HIV-1毒株gag和pol基因区抗原表位及耐药性突变分析
通过研究HIV-1 gag和pol基因序列变异特征,以了解抗原表位变异特点和耐药性突变情况.采集HIV-1阳性全血样本,使用巢式PCR扩增gag和pol基因部分区段,得到23份样本的PCR序列和相应样本的克隆序列gag基因为449份、pol基因为402份,基因分型为HIV-1 B和B'亚型.两种亚型的共享序列在选取的8个CTL抗原表位中,共有4个抗原表位发生了8个突变位点；另外位于p24区的5个抗原表位在PCR序列中没有发生变化,但在它们的克隆序列(9.80％)中发生了少数突变.在pol基因PCR序列和克隆序列中发现蛋白酶抑制剂(Protease inhibitors,PIs)和逆转录酶抑制剂(Reverse transcriptase inhibitors,RTIs)耐药性突变位点分别为18个和24个,其中只在克隆序列中发现的PIs和RTIs耐药性突变位点分别占其总数的94.44％(17/18)和62.50％(15/24).结果显示本研究样本PCR序列中表现出耐药性的比例较高(17.39％),并在克隆序列中存在少数免疫逃逸和耐药性突变,提示部分样本对现行抗病毒药物产生一定程度的耐药.
-
HIV-1 B亚型gag基因密码子优化及其免疫原性的研究
从河南HIV-1流行区感染者中克隆HIV-1 B亚型gag基因,通过序列比对获得其一致性共有序列,对该共有序列按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行优化,以Western blot方法比较优化前后gag基因体外表达量.发现对gag基因进行密码子优化可显著提高其表达水平.将优化后的mod.gag基因插入重组腺病毒载体,构建了重组病毒rAdV-mod.gag.在BALB/c小鼠体内分别以108PFIJ及108PFU rAdV-mod.gag疫苗单独免疫两次均可产生较高水平的gag特异性细胞免疫反应.由此得出结论,对gag基因的密码子优化是成功的;表达优化后gag基因的重组腺病毒疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.
-
按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1 gag基因提高表达水平的研究
为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1 gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究.结果显示:①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7.5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Western blot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17%.上述结果表明:按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素.
-
含密码子优化的SIV gag基因的DNA疫苗与rAd5疫苗构建及免疫原性评价
目的 构建含有SIVgag基因的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗,为后期在SIV感染的猴模型中进行多载体疫苗联合免疫策略的治疗效果评价奠定基础.方法 将SIV gag基因按照哺乳动物偏嗜密码子进行优化并构建至pVR载体,作为DNA疫苗.以Western Blot方法比较优化前后gag基因表达水平.将优化后的gag基因插入重组腺病毒载体,构建rAd5-SIVgag疫苗.在BALB/c小鼠中分别比较DNA疫苗及rAd5-SIV.gag疫苗单独及联合免疫的效果.结果 密码子优化的SIVgag基因的表达水平远高于野生型SIVgag基因.重组腺病毒疫苗免疫一次或两次诱导的细胞免疫反水平分别高于DNA疫苗免疫一次或两次.两种疫苗联合免疫的反应水平与腺病毒疫苗免疫两次的水平相当,高于DNA疫苗单独免疫及腺病毒疫苗单独免疫一次的结果.结论 成功优化了SIV gag基因,使其不依赖Rev高水平表达；成功构建了表达优化后SIV gag基因的DNA疫苗和rAd5疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.
-
黏多糖病的诊断及防治策略
黏多糖病,又称黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis,MPS),是一类因溶酶体内相关的酸性水解酶缺乏或活性降低使黏多糖(也称糖胺聚糖,glycosaminoglycan,GAG)无法降解或降解不完全,导致GAG的中间代谢产物硫酸皮肤素(dermatan sulfate,DS)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)等在体内堆积而引起的严重致残、致死性的单基因遗传性代谢病.
-
1例早期HIV感染者体内病毒准种的各基因片段分析
目的 比较1例早期艾滋病病毒(HIV)感染者体内病毒不同基因片段准种复杂度.方法 使用套式聚合酶链反应(Nested-PCR),扩增HIV感染者外周血淋巴细胞中病毒的gag、pol、vif-vpr和env区的部分基因,通过克隆、测序方法观察该感染者体内病毒准种分布情况,比较不同基因片段检测病毒准种的可靠性.结果 不同基因片段检测病毒准种结果显示,该早期感染者体内的病毒不同基因片段显示的准种基因离散率不同,其中gag区显示出的病毒准种复杂度高,反映为该区段病毒准种的基因离散率高,为0.008;其他各区基因(pol、vif-vpr、env)的离散率依次为0.006、0.001、0.000.结论 该HIV感染者体内病毒准种的基因中,gag区基因的突变率较高,提示Gag在机体感染HIV早期承受的免疫压力较高,因此在病毒准种研究中,gag区应该作为重要的基因区域.
-
TSG101蛋白在HIV-1出芽过程中的作用及其抑制剂
tsg101 基因是一个抑制肿瘤基因,其翻译产物 TSG101 蛋白具有多重生物学功能.近年来的研究发现,TSG101 蛋白通过与 HIV-1 Gag蛋白结合,辅助 HIV-1 病毒颗粒从被感染细胞中释放出来,这说明 TSG101 可作为一个新的抗 HIV-1 靶点.基于 TSG101 蛋白与 HIV Gag 的相互作用和结构,研究人员设计合成了几类 TSG101 蛋白抑制剂,并通过测定这些抑制剂对 TSG101 蛋白的亲和力,发现其中某些化合物具有比野生型 Gag 更强的 TSG101 蛋白亲和力,值得进一步研究.
-
我国B'亚型HIV-1 gag基因变异与宿主HLA限制性CTL应答的关系
目的 了解我国B'亚型HIV gag基因随时间进化的特征及阳性选择位点与宿主HLA限制性CTL应答的关系.方法 从HIV序列数据库下载我国B’亚型HIV-1 gag序列,计算不同年代病毒多样性及基因离散率,应用Hyphy软件分析Gag蛋白阳性选择位点及其与HLA限制性CTL应答的关系.结果 本研究共获得来自河南、湖北、辽宁及云南地区的122条B '亚型gag序列,按采样时间分为4组:＜2001、2001-2003、2004-2006及2007-2010年,病毒多样性及离散率均随时间逐渐增加(r1=0.497,P1＜0.001；r2 =0.593,P2＜0.001)；Gag蛋白34个阳性选择位点中97.1％位于已明确的47个HLA限制性CTL表位内,HLA-A、B、C限制表位分别占43.1％、49.0％及7.9％.结论 我国B’亚型gag基因多样性及离散率随着流行时间延长逐渐增加,B '亚型毒株正逐渐适应我国人群常见的HLA限制性CTL应答,提示该毒株疫苗研发时需要注意避免选用相关CTL表位为免疫原.
-
适用于中国HIV-1分型的gag基因引物及其应用
目的 对中国流行的主要HIV-1毒株进行遗传特征分析,确定适用于中国HIV分子流行病学调查的gag基因扩增引物.方法 从HIV序列数据库下载CRF07_BC、CRF08_BC、C亚型及M组参考毒株的gag全长序列,经序列比对后设计gag基因扩增引物;获得的基因片段采用邻接法构建系统进化树,评价不同片段用于分析和确定HIV-1亚型的可靠性,并检测部分样本以评定效果.结果 目前我国常用的gag基因306/c-gag引物扩增片段(HXB2 836～1507)构建的系统进化树中,CRF07_BC、C亚型进化簇的Bootstrap值分别为70%和59%,其可靠性较低,难以形成较为稳定的进化簇用于病毒亚型判断.而利用设计的gag基因GUX/GDX引物扩增片段(HXB2 781～1861)构建的系统进化树中,CRF07_Bc、CRF08_BC和C亚型序列能够独立成簇,其Bootstrap值分别为99%、99%和77%,具有较高的可靠性.在实际应用中,新设计的引物具有较高的扩增阳性率和测序成功率,获得序列形成B、C亚型和CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC等5个大的进化簇,其Bootstrap值均超过80%.即使仅用下游引物GDX测序获得的较短片段亦能获得较为可靠的系统进化树.结论 GUX/GDX引物扩增获得的gag基因片段可以构建较为可靠的系统进化树,用于区分和判断我国流行的主要HIV-1毒株亚型,尤其是BC重组毒株和C亚型毒株.该方法在我国HIV分子流行病学调查和研究中有广泛的应用价值.
-
B′亚型HIV-1Gag蛋白氨基酸突变与汉族人HLA-Ⅰ类等位基因相关性分析
目的 探索我国B′亚型HIV感染者Gag蛋白突变与HLA-Ⅰ类等位基因型的关系及其对疾病进展的影响.方法 收集B′亚型HIV-1慢性感染者95例,测序获得病毒gag基因,PCR-SSP法测定HLA-Ⅰ等位基因型,分析氨基酸突变与HLA相关性及对CD4+T细胞、病毒载量的影响.结果 Gag蛋白的28个位点与HLA-Ⅰ类等位基因存在47种相关性(P＜0.05),其中9个位点(26、30、81、84、125、146、147、357、437)位于13个已知HLA限制性表位内或侧区；HLA相关氨基酸突变位点数与CD4+T细胞及病毒载量显著相关(r=-0.318,P =0.002；r =0.360,P=0.003).结论 我国B′亚型HIV-1感染者HLA相关Gag蛋白氨基酸突变可能与HIV感染疾病进展有关.
-
Gag/IFNα-2b融合基因在痘苗病毒中共表达研究
目的本实验将编码AIDS病毒(HIV-1)核心蛋白gag与编码干扰素(IFNα-2b)基因插入以痘苗病毒复制非必需区血凝素(HA)基因为侧翼,牛痘病毒包涵体(ATI)启动子和串联的p7.5突变型早期启动子为基本构件的痘苗病毒表达载体(pJ38),经与野生型痘苗病毒在细胞内同源重组,获得具有生物活性的重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα-2b.方法经免疫荧光、Dot-ELISA、SDS-PAGE、Western-blot等方法检测表达产物,分析免疫小鼠后血清抗体IgG OD490值与T淋巴细胞的变化.结果 vJ38gag/IFNα-2b能表达Gag/IFNα-2b融合蛋白,分子量约60kDa.免疫小鼠实验表明血清抗体IgG OD490值、CD+4、CD+8T淋巴细胞计数的组间比较(P＜0.001),含IFNα-2b与单纯vJ38gag组相比(P＞0.05),但呈渐进性增高的趋势.结论重组痘苗病毒表达的gag/IFNα-2b融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性.
-
CAG方案治疗急性髓系白血病临床分析
目的 探讨CAG方案对急性髓系白血病治疗的疗效.方法 对12例急性髓系白血病住院患者,采用阿糖胞苷和阿克拉霉素联合粒细胞集落刺激因子(CAG)方案治疗,随访其疗效.结果 CAG方案对急性髓系白血病的总有效率为75%,完全缓解(CR)率50%,部分缓解(PR)率25%.达CR者中中位生存期和无病生存期为13个月和8个月,PR和未缓解(NR)者中中位生存期分别为6个月和4个月.主要毒副作用是骨髓抑制,其他非血液学毒性表现轻微.结论 CAG方案对急性髓系白血病患者有积极的治疗作用,副作用少,值得推广.
-
人免疫缺陷病毒Ⅱ型(HIV-2)gag蛋白基因在毕赤酵母中的克隆表达
目的:实现HIV-2ROD gag重组蛋白的分泌表达,为研究HIV-2ROD gag蛋白结构与功能及亚单位蛋白疫苗研究打下基础.方法:将HIV-2ROD gag蛋白基因片段,与分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9重组,构建了相应的重组表达质粒pPIC9-gag,转化GS115酵母菌,经MD/MM表型筛选、PCR扩增筛选阳性克隆,以甲醇诱导表达后进行SDS-PAGE分析及Western blot证实.结果:获得了HIV-2ROD gag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中的分泌表达,表达产物可被HIV-2抗血清识别,分子量约为57 kD.结论:pPIC9-gag重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HIV-2ROD gag蛋白,该蛋白具有强免疫学活性.
关键词： HIV-2 Gag Pichia pastoris 基因表达 -
人免疫缺陷病毒Ⅱ型gag基因在毕赤酵母中表达条件的研究
目的:提高人免疫缺陷病毒Ⅱ型(HIV-2ROD)gag基因在毕赤酵母中的表达量.方法:研究了转化子生长的培养条件,包括不同的甲醇诱导浓度、诱导时间、溶解氧、摇瓶转速及不同pH值对人HIV-2 gag表达的影响.表达产物进一步通过盐析和Sephadex G-100分子筛层析柱层析分离纯化.结果:佳表达条件是1.0%甲醇诱导,诱导时间3 d, 大于85%的溶解氧,摇瓶转速250 rmin-1,pH6.0～6.5,目的蛋白表达量达到21 mg*L-1.同时,经纯化后得到了纯度大于95%的目的蛋白.结论:获得了HIV-2ROD gag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中分泌表达的佳表达条件.
-
融合表达小鼠 IgG2b-Fc 可增强人类免疫缺陷病毒1型 Gag DNA疫苗的免疫原性
为阐明小鼠 IgG2b‐Fc对 DNA疫苗免疫原性的增强作用，首先构建表达人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV‐1）CN54Gag基因的DNA疫苗及表达Gag与小鼠IgG2b‐Fc融合基因的DNA疫苗，限制性酶切和DNA测序结果表明这两个疫苗均构建成功，蛋白免疫印迹结果也显示其正确表达。然后，利用上述DNA疫苗接种C57BL／6小鼠，比较两个DNA疫苗所诱导的特异性体液免疫反应和特异性细胞免疫反应。结果显示，融合表达小鼠IgG2b‐Fc对特异性细胞免疫和体液免疫反应均有增强作用，但只有对特异性体液免疫反应的增强作用有统计学意义。
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 人类免疫缺陷病毒疫苗 Gag IgG-Fc -
HIV核衣壳蛋白p24在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化
目的 用基因工程方法获得HIVp24蛋白编码区基因片段,构建重组质粒,并在大肠杆菌中高效表达目的 蛋白.方法 设计带有酶切位点的引物,扩增p24基因,分别连接到pET-11c和pET-16b载体上,将两种表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达.选择离子交换层析和分子筛层析纯化p24.结果 p24在大肠杆菌中高效表达,p24在非还原性电泳中呈单一条带,提示有较好的立体结构,p24-pET-16b的表达量占到总蛋白表达量的30%.经纯化后蛋白纯度达到90%以上.结论 p24能在大肠杆菌中高效表达.
关键词： HIV-1 HIV核心蛋白质p24 基因产物 Gag 大肠杆菌 -
新疆地区人类免疫缺陷病毒-1感染者CRF07_BC流行毒株gag基因遗传特性
目的 分析新疆地区HIV-1感染者中流行的单一亚型CRF07_BC毒株的gag基因遗传特性.方法 对35例CRF07_BC亚型的HIV-1感染者分别于2011年9月(T1时间点)、2012年5月(T2时间点)、2013年2月(T3时间点)和2013年10月(T4时间点)4个时间点采集全血标本.为排除不同程度免疫功能对HIV-1基因变异的影响,使用流式细胞仪进行CD4+T淋巴细胞计数,并按照CD4+T淋巴细胞＜200/μL(重度免疫抑制)、200～500/μL(中度免疫抑制)和＞500/μL(无免疫抑制)分为不同免疫功能的3组.抽提标本RNA,套式PCR扩增gag基因片段,终将3组研究对象得到的4次序列进行基因离散率和进化树分析,并使用BEAST软件估算该地区CRF07_BC流行毒株的近共.同祖先株形成时间和平均进化速率.为排除HARRT对HIV-1基因变异影响,对HARRT组和非HARRT组进行基因离散率分析.结果 3组不同免疫功能的研究对象均呈现出在T1、T2、T3、T4时间点的组内和组间基因离散率依次升高的趋势.HARRT组和非HARRT组也均呈现出在T1、T2、T3、T4时间点的组内和组间基因离散率依次升高的趋势.进化树分析显示,同一样本的几次序列在进化树上聚集成一簇,大部分毒株均在T4时间点上独立分出一支;其近共同祖先株形成时间为10.9年[95％高后验密度(HPD):2.0～22.2年],平均进化速率为1.34×101替换·位点1·年-1(95％HPD:5.16×10-4～2.23×10-3替换·位点-1·年1).结论 新疆地区HIV-1感染者CRF07_BC亚型毒株会随着在一个地区流行时间的延长,加大该地区同一亚型内的基因离散率;CRF07_BC单一亚型内病毒株的gag基因进化速率相对文献报道的略慢.
-
低水平病毒载量长期不进展人类免疫缺陷病毒-1感染者的人类免疫缺陷病毒-1的遗传分析
目的 分析低水平病毒载量长期不进展(LTNP)HIV-1感染者HIV-1的遗传特征.方法 采用有限稀释套式PCR、终点PCR和序列确证分析等技术对5例低病毒载量LTNP HIV-1感染者不同随访时间点HIV-1前病毒enw基因c2-v3-c3区域和gag基因p17区域进行扩增和序列分析.分别计算不同时间点内以及不同时间点与用于分析的早时间点之间上述两个基因区域的基因多样性和基因离散率,依据基因离散率计算基因的进化率,统计学分析用GraphPad Prism 5软件.结果 5例患者在21个随访时间点共获得115条c2-v3-c3序列和173条p17序列.进化树分析表明,不同患者的序列分开,同一患者的序列特异地聚集,序列质量可靠.5例患者env基因c2-v3-c3区域不同时间点基因多样性为0～6.38%,平均为2.1%,病例1、3和5基因多样性随感染时间的增加逐渐升高(r=0.7257、0.4954、0.3288),病例2和4基因多样性随感染时间的增加逐渐下降(r=-0.3759、-0.5028);基因离散率为0.1%～6.5%,平均为2.9%,除病例1外,基因离散率均随感染时间间隔的增加逐渐升高,进化率分别为每年每位点-0.13%、0.81%、0.09%、0.14%和0.16%,平均为0.21%.gag基因p17区域基因多样性为0～2.5%,平均为1.2%,基因离散率为0.2%～2.7%,平均为1.4%,除病例3基因多样性和基因离散率随感染时间或时间间隔的增加下降外,其余病例均随感染时间或时间间隔的增加而逐渐升高,进化率分别为每年每位点0.087%、0.064%、-0.014%、0.081%和0.087%,平均为0.061%.结论 低水平病毒载量LTNP HIV-1感染者HIV-1有复制能力,病毒基因维持较低水平的进化;HIV-1 env基因变化的程度大于gag基因.
-
广西地区人类免疫缺陷病毒-1流行毒株g ag 基因系统进化和基因变异特征分析
目的：了解广西壮族自治区 HIV‐1流行毒株 gag基因分子进化及遗传变异特征。方法收集2011年10月至2012年3月广西地区 HIV‐1感染者血液样本158份，采用反转录／套式PCR对HIV‐1 gag基因片段进行扩增并测序。运用M EGA 5．03构建系统进化树，并计算 gag区及各编码区段的基因离散率和选择压力（globle ω）。两样本基因离散率的比较采用两独立样本 t检验，多个样本的基因离散率比较采用单因素方差分析。结果158份样本中获得140条 gag基因序列，存在4种亚型：CRF＿01AE 80份（57．1％），CRF08＿BC 46份（32．9％），CRF07＿BC 10份（7．1％），B （B′）4份（2．9％）。gag基因离散率在 CRF＿01AE 亚型为0．036±0．001，CRF08＿BC 亚型为0．031±0．002， CRF07＿BC亚型为0．043±0．003，B （B′）亚型为0．102±0．006，差异有统计学意义（ F＝220．62，P＜0．01）。p17和 p24编码区均受到负向选择压力作用，globle ω＜1。各亚型 p17编码区的globle ω值相近，差异无统计学意义（ F＝0．761，P＝0．469），p24编码区的 g lo ble ω值差异也无统计学意义（ F＝0．037，P＝0．964）。结论广西地区 HIV‐1亚型以CRF＿01AE为主，gag基因各编码区段在进化上相对保守，但HIV‐1流行特征的变化可能会影响 gag基因的遗传变异，应继续追踪检测。
关键词： 人类免疫缺陷病毒-1 基因 Gag 变异(遗传学)
