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四川泡菜发酵过程中酵母菌的动态变化规律及分离鉴定
从四川泡菜中分离5株不同酵母菌，各株酵母菌有着不同的菌落特点，分离鉴定采用26SrDNAD1/D2区序列分析法，鉴定出1株膜璞毕赤酵母、4株酿酒酵母。检测结果表明，两种酵母菌都存在于四川泡菜发酵前期，随着时间的推移，不同泡菜两种酵母菌的变化各不相同。
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β人绒毛膜促性腺激素在毕赤酵母中的表达及鉴定
目的在毕赤酵母表达系统中获得β人绒毛膜促性腺激素(hCG)高效分泌表达,并鉴定其抗原活性.方法将β hCG基因亚克隆入pPIC9K表达载体,线性化后转化GS115酵母细胞,经G418抗性筛选获多拷贝重组子并诱导表达.表达产物采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot、酶链免疫吸附试验(ELISA)鉴定. 结果经甲醇诱导,酵母细胞表达出β hCG,此蛋白在SDS-PAGE电泳上显示为一条分子量为32×103阳性条带,在Western blot试验中能被β hCG多抗识别,在竞争抑制性ELISA中能抑制β hCG单抗与hCG全分子的结合.结论β hCG在毕赤酵母中得到高效表达,并形成正确的蛋白结构.
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抗菌肽D基因在毕赤酵母中的表达及鉴定
目的将抗菌肽D基因克隆至甲醇营养型酵母表达载体pPICZα-A中,并与α-factor信号肽相连接,经EcoR Ⅰ酶切分析和PCR扩增鉴定,获得阳性重组子.方法用锂盐法将重组表达载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)受体菌GS115,筛选获得阳性克隆.结果将阳性菌落发酵产物进行抑菌试验,表达产物有较强的杀菌作用,表达产物杀菌活性达到5656U/ml.结论抗菌肽D基因已经导入酵母细胞并整合在其基因组中,表达产物均具有高效的杀菌作用,有希望开发成为一种新型的抗菌消毒药物.
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Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定
目的 利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区(DENV-1～4EDⅢ),获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ.方法 PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因,构建至pPIC9K毕赤酵母表达质粒.酶切线性化后电转化毕赤酵母菌GS115,涂板后经G418梯度浓度筛选,获得多株抗G418 4.0 mg/ml的高拷贝菌株,扩大培养后,利用甲醇诱导分泌表达重组蛋白,表达上清用Ni-NTA亲和树脂纯化后以免疫印迹鉴定.结果 成功构建pPIC9K-DENV-1～4 EDⅢ重组质粒,高拷贝菌株经甲醇诱导后分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ重组蛋白,纯化后获得的可溶性重组蛋白经变性凝胶电泳,相对分子质量约为12×103,与实际相符.免疫印迹鉴定结果表明该重组蛋白能与抗His单抗和抗Ⅰ～Ⅳ型DENV小鼠血清特异结合.结论 成功通过毕赤酵母高效分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ蛋白,这些重组蛋白可进一步用于疫苗、诊断试剂和E蛋白生物学功能的研究.
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美洲商陆抗病毒蛋白在毕赤酵母中的表达及其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡的研究
目的 研究美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP)基因的克隆表达,进而研究其诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡.方法 利用RT-PCR技术克隆PAP基因,构建PAP毕赤酵母表达质粒pPIC-ZaA-PAP并导入毕赤酵母Pichia pastoris CS115.SDS-PAGE检测PAP的分泌表达.采用镍离子亲合层析纯化PAP,并通过单细胞凝胶电泳和MTT检测其抑制人神经胶质瘤细胞U251的生长.结果 分泌表达的PAP融合蛋白分子量约为35/kD,纯化的PAP在体外能诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡.PAP对U251半数抑制浓度(IC50)为81.0μg/mL,通过单细胞凝胶电泳,能看到明显的慧星尾,表明PAP引起了神经胶质瘤细胞基因组的降解.结论 PAP蛋白能抑制神经胶质瘤细胞的生长及诱发人神经胶质瘤细胞U251凋亡.
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抗H5亚型禽流感病毒单链抗体在毕赤酵母中的分泌型表达和生物活性分析
在本实验室研制出的多株针对H5N1亚型禽流感血凝素单抗中,13D4单抗对所有H5亚型病毒均有血凝抑制和中和活性,具有特异性高、反应性强和识别广的特点,且在小鼠实验中显示了对各种代表株禽流感的感染和发病均具有良好的治疗效果.在此研究基础上,本实验通过基因工程构建含有13D4单链抗体(scFv)基因的毕赤酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达和纯化.经过竞争法和血凝抑制检测其活性,表明获得的单链抗体具有与原始鼠源抗体相近的反应活性和相同的识别表位.H5N1广谱中和单抗13D4的单链抗体的成功构建,为进一步研制针对H5N1禽流感病毒的治疗性抗体奠定了基础.
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鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达
鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA.参照IBV Beaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT-PCR,成功地扩增出IBV H株S1基因.扩增产物经Bst YⅠ、HaeⅢ和PstⅠ酶切分析,结果表明,IBV H株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBV H株为Mass血清型.将IBV H株S1基因克隆于pGEM-T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1 611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97.39%和97.27%.将IBV H株S1基因亚克隆到pPICZ-A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS-PAGE实验证实了IBV H株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测,证实了表达产物的抗原特异性.
关键词： 鸡传染性支气管炎病毒 纤突蛋白S1基因 克隆 毕赤酵母 表达 -
重组表达人载脂蛋白(a)羧基末端kringle结构域抑制新生血管
目的 利用毕赤酵母重组表达人载脂蛋白(a)[Apo(a)]羧基末端kringle结构域,明确其抑制新生血管和肿瘤细胞增殖的能力.方法 分别构建重组表达Apo(a)羧基末端kringle Ⅴ结构域(RHAKA)与kringleⅣ10型-krin-gle Ⅴ结构域(RHAKB)的pPICZαA质粒；转染毕赤酵母X-33分泌表达RHAKA与RHAKB,RHAKs利用His· Tag亲和层析纯化,以及反相高效液相色谱与氨基酸残基测序鉴定；明确RHAKs的糖基化及二硫键形成情况后,利用细胞增殖实验与鸡胚绒毛尿囊膜(C AM)实验检测RHAKs对新生血管和肿瘤细胞增殖的影响.结果 毕赤酵母可以大量表达RHAKs,并对RHAKs进行翻译后修饰；RHAKA与RHAKB可以抑制血管内皮细胞的增殖和CAM的新生血管,但对肿瘤细胞增殖无直接的抑制作用.结论 利用毕赤酵母高效重组表达人Apo(a)羧基末端kringle结构域可以显著抑制新生血管.
关键词： 载脂蛋白 kringle结构域 毕赤酵母 新生血管 -
钙滴定法测定~(99m)Tc定点标记膜联蛋白V的亲和力
目的 测定一种新型~(99m)Tc定点标记膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸(PS)外翻红细胞的结合亲和力.方法 通过毕赤酵母的培养和甲醇诱导表达获得带有金属螯合位点的膜联蛋白V;用超滤的方法纯化膜联蛋白V;用葡庚糖酸钠和氯化亚锡还原将~(99m)Tc定点标记于膜联蛋白V氨基末端.采用不同浓度钙离子滴定放射性膜联蛋白V结合磷脂酰丝氨酸外翻红细胞的亲和力.结果 在不同的蛋门质分子/细胞比值下测定出的半数标记蛋白结合细胞的钙离子浓度是不同的,在低蛋白质分子/细胞比值下测定~(99m) Tc-膜联蛋白V对细胞的亲和力pK=33.4.结论 毕赤酵母系统重组表达的膜联蛋白V具有较高的结合外露PS红细胞的能力.
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登革2型病毒E蛋白基因的酵母表达
为研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制,本研究对DENV-2的E蛋白基因进行了毕赤酵母分泌表达.首先,经RT-PCR方法克隆DENV-2的E蛋白基因,将克隆的基因与表达载体pPICZaB连接以构建表达重组子;并经酶切、PCR、测序筛选实验鉴定正确重组子.然后,重组子经氯化锂法转化毕赤酵母菌KM71H获得转化子;经抗生素、表型鉴定、PCR筛选得到Muts型的多拷贝转化子.后,经甲醇诱导基因表达,Western-blotting方法鉴定蛋白表达情况及佳表达时间.本研究对DENV-2的E蛋白成功进行了分泌表达,并且确定其表达佳发酵时间为96 h;为进一步研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制奠定了基础.
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鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原基因sag10在毕赤酵母中的表达及鉴定
sag基因家族是制备基因工程疫苗重要的候选基因.本研究通过在毕赤酵母Pichia pastoris中表达柔嫩艾美耳球虫Eimeria tenella表面抗原基因sag10,来探讨sag10表达后的生物学活性.本文首先提取柔嫩艾美耳球虫北京株第2代裂殖子总RNA,根据GenBank报道序列(AJ586552)设计引物,应用RT-PCR技术扩增得到鸡球虫表面抗原sag10基因.然后将sag10与真核表达载体pPIC9K连接,构建了pDQ052分泌型真核表达质粒,并转化毕赤酵母GS115,利用G418抗性筛选多拷贝重组菌株,进行优化表达.SDS-PAGE和Western blot检测表达结果,在43 kDa处有明显的免疫印迹条带,表明目的蛋白得到表达,而且能被特异性抗体所识别,说明表达的SAG10蛋白具有生物学活性.
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乙型肝炎病毒S基因密码子佳化及在毕赤酵母中的高效表达
目的 制备适合酵母表达的乙型肝炎病毒S基因,在毕赤酵母中高效表达重组乙型肝炎病毒S蛋白.方法 选用酵母偏爱的同义密码子替换野生型S基因的酵母稀有密码子,采取基因搭桥法及递归式聚合酶链反应,制备合成基因,捕入酵母表达载体pPICZB.携带有合成S基因的重组质粒转化毕赤酵母菌株KM71 H,经甲醇诱导表达乙型肝炎病毒S蛋白.结果 酶切电泳及DNA测序证实合成的S基因正确克隆到表达载体中;聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹显示优化后的乙型肝炎病毒S基因在毕赤酵母中的重组蛋白表达量远高于野生型基因.结论 密码子优化的S基因能明显提高重组S蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达量.
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弓形虫GRA1基因在毕赤酵母菌中的表达、纯化与鉴定
目的 研究弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)在毕赤酵母菌中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的目的蛋白. 方法 将已构建重组的pPIC9K-GRA1质粒转化入酵母菌GS115,筛选His+Muts 表型转化子,摇瓶培养,1%甲醇诱导表达.表达产物经高效液相色谱法纯化后,测定其生物学活性. 结果 诱导4 d的蛋白表达量达到2.5 g/L.SDS-PAGE 显示表达蛋白的分子质量单位为24 ku,Western blot鉴定表达产物具有抗原性.表达蛋白经高效液相色谱纯化产物后纯度达到90%以上. 结论 弓形虫GRA1基因在毕赤酵母中成功分泌表达目的蛋白,表达产物具有抗原性.
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蛔虫抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定
目的 在毕赤酵母表达系统巾表达蛔虫抗菌肽cecropin P1并检测其生物活性.方法 根据毕赤酵母的密码子偏好性,人工设计并合成3条cecropin P1基因寡核苷酸片段.通过PCR扩增得到cecropin P1基因,构建重组载体pMD18-T-CecP1.双酶切pMD18-T-CecP1,将cecropin P1基因克隆到载体pPICZα-A信号序列α-因子之后,构建酵母分泌表达载体pPICZβ-A-CecP1,用Sac T将其线性化后转化毕赤酵母X-33,采用Zeocin抗性筛选阳性菌株并进行诱导表达,发酵上清进行SDS-PAGE分析,抑菌试验鉴定其抑菌活性.结果 获得酵母分泌表达载体pPICZa-A-CecP1.SDS-PAGE证实pPICZa-A-CecP1/X-33甲醇诱导产物的分子质量单位为6.3 ku.表达产物对大肠埃希菌DH5α的生长有抑制作用.结论 应用毕赤酵母表达系统能表达cecropin P1.该抗菌肽具有抑菌作用.
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重组犬α干扰素的制备及生物学活性分析
目的 用毕赤酵母表达犬α干扰素并与诱生的犬天然白细胞干扰素作生物学活性比较. 方法 优化合成犬α干扰素基因,构建质粒pPIC9K-CaIFN-α,转入酵母SMD1168,筛选阳性克隆后诱导表达干扰素并纯化；并用犬白细胞诱生犬天然白细胞干扰素.用WISH-VSV方法检测两种干扰素的效价. 结果 表达的重组犬α干扰素效价约为0.65×105 IU/ml,与犬白细胞干扰素效价(0.81×105 IU/ml)相近. 结论 成功利用毕赤酵母表达了与犬天然白细胞干扰素活性相近的重组犬α干扰素,为干扰素的工业化制备提供了种质资源.
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杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定
目的 在毕赤酵母中分泌表达具有抗菌活性的杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4(CP1-DS4). 方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性优化Cecropin P1和Dermaseptin S4两抗菌肽基因序列,通过SOE-PCR拼接,构建克隆载体pMD18T-cp1-ds4并测序;pMD18T-cp1-ds4经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后构建重组表达载体pPICZαA-cp1-ds4,测序验证开放阅读框(ORF)正确后经SacⅠ线性化处理,然后电转化毕赤酵母X-33(800V,1mm电转化杯,15s电击1次)并利用Zeocin筛选阳性重组子.重组子接种BMGY、BMMY培养基,采用5％的甲醇诱导表达,采用Tricine-SDS-PAGE分析表达上清,表达上清浓缩后进行抑菌试验. 结果 在本研究中拼接引物经SOE PCR拼接后得到优化的长度为120bp的Dermaseptin S4基因基因片段,该片段与Cecropin P1基因连接形成约197bp杂合抗菌肽片段,成功构建pPICZdA-cp1-ds4表达载体,电转化获得重组酵母菌pPICZαA-cp1-ds4/X-33,经诱导后可产生分子质量单位约为9.7 ku的目的多肽,该多肽对大肠埃希菌和金黄葡萄球菌均有抑制作用. 结论 杂合肽CP1-DS4可以在毕赤酵母X-33中融合分泌表达,且具有抗菌活性.
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细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及生物学功能鉴定
目的 在毕赤酵母中分泌表达细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Echinococcus granulosus thioredoxin per-oxidase,EgTPx),并检测其抗氧化活性. 方法 从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR获取EgTPx的cD-NA片段并克隆至分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K-EgTPx,电穿孔法转化毕赤酵母菌株GSll5,在MD平板上筛选His+克隆,采用梯度浓度G418抗性筛选高拷贝转化子,提取酵母基因组DNA,采用PCR鉴定Mut表型,阳性克隆经甲醇诱导表达EgTPx蛋白,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并检测其抗氧化活性. 结果 酶切和测序证实重组表达质粒pPIC9K-EgTPx构建正确,表达的目的蛋白分子质量单位约为22 ku,该蛋白可被鼠抗EgTPx多抗识别,且具有较强的抗氧化活性. 结论 在毕赤酵母表达系统中成功表达了EgTPx,该蛋白具有免疫反应性和抗氧化活性.
关键词： 细粒棘球绦虫 硫氧还蛋白过氧化物酶 毕赤酵母 分泌表达 抗氧化 -
生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展
抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽,广泛存在生物界.抗菌肽具有广谱抗菌活性,有良好的应用前景,使其走向临床的大的挑战是如何用基因工程技术低成本大量生产抗菌肽产品.抗菌肽天然提取资源有限且提取难度大,难以实现规模化生产;人工合成成本太高,难以实现产业化,目前多局限于研究用途.毕赤酵母表达系统适用于多种生物抗菌肽的表达,多种表达策略的采用可以提高表达量,毕赤酵母表达抗菌肽具有良好的应用前景.本文综述了抗菌肽毕赤酵母表达的研究进展.
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融合蛋白hJagged1ext-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达
本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1ext-Fc,并在毕赤酵母GS115中表达.用RT-PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段.在测序正确后,将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC-Fc载体,得到PIC-hJagged1ext-Fc.用MD平板筛选重组子,G418法筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,采用SDSPAGE分析表达蛋白.结果表明:hJagged1基因的胞外段被有效地扩增.序列分析显示所构建的舍phJagged1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1ext-Fc得到正确表达.结论:成功地构建了hJagged1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究Jagged1在造血干/祖细胞的体外扩增奠定了基础.
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汉逊酵母表达乙肝表面抗原的结构研究
目的 解析汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原(HBsAg)的空间结构,给出其颗粒大小、结构对称性方面的信息.方法 整合adr 亚型 HBsAg的基因到汉逊酵母染色体上,建立重组汉逊酵母菌.经过发酵扩菌、诱导表达、精制纯化等步骤得到纯化的HBsAg.滴加5μl浓度为80 μg/mlHBsAg溶液到亲水处理的纯碳膜铜网上,用2%醋酸铀染色,放置24 h后,通过透射电镜得到汉逊酵母表达HBsAg颗粒的二维电镜图像.运用EMAN软件包完成图像选择、颗粒框取、颗粒全同性处理、初始模型构建和结构精修等HBsAg重构步骤,获得HBsAg颗粒的三维结构.结果 汉逊酵母表达HBsAg颗粒大小服从高斯分布(P=0.45),均值为(28.4.±2.6)nm;汉逊酵母表达HBsAg是-中空的"鱼笼"状结构,蛋白亚基分布在球状结构的表面;蛋白的表面分布大小为1～2 nm的孔状结构和围绕孔状结构的突起;不具备八面体对称性.结论 汉逊酵母表达的 HBsAg与血源性的 HBsAg 在大小和结构对称性方面都有显著差异.
