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钙滴定法测定~(99m)Tc定点标记膜联蛋白V的亲和力
目的 测定一种新型~(99m)Tc定点标记膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸(PS)外翻红细胞的结合亲和力.方法 通过毕赤酵母的培养和甲醇诱导表达获得带有金属螯合位点的膜联蛋白V;用超滤的方法纯化膜联蛋白V;用葡庚糖酸钠和氯化亚锡还原将~(99m)Tc定点标记于膜联蛋白V氨基末端.采用不同浓度钙离子滴定放射性膜联蛋白V结合磷脂酰丝氨酸外翻红细胞的亲和力.结果 在不同的蛋门质分子/细胞比值下测定出的半数标记蛋白结合细胞的钙离子浓度是不同的,在低蛋白质分子/细胞比值下测定~(99m) Tc-膜联蛋白V对细胞的亲和力pK=33.4.结论 毕赤酵母系统重组表达的膜联蛋白V具有较高的结合外露PS红细胞的能力.
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陡脉冲电场对体外人肝癌细胞SMMC-7721的诱导凋亡作用
为研究陡脉冲电场的诱导凋亡作用,以体外人肝癌细胞SMMC-7721为实验对象,采用Annexin V-FITC/PI双染色并利用流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解片段化.实验发现,陡脉冲电场能有效(P<0.05)地使PS外翻,并且微秒级陡脉冲(μsSPEF)比纳秒级陡脉冲(nsSPEF)更有效(P<0.05);陡脉冲电场能使DNA降解片段化,且nsSPEF比μsSPEF更有效.实验结果表明,陡脉冲电场能有效诱导体外人肝癌细胞凋亡,其机理与陡脉冲电场非热效应及其频谱特性有关.μsSPEF主要作用于细胞膜,而可能通过外源性通路诱导细胞凋亡;nsSPEF主要作用于细胞核和线粒体等胞内细胞器,可能通过内源性通路诱导细胞凋亡.实验结果为陡脉冲电场杀伤肿瘤细胞的机制和参数选择提供了依据.
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高浓度葡萄糖诱导红细胞磷脂酰丝氨酸暴露的机制研究
本研究探讨高浓度葡萄糖诱导红细胞磷脂酰丝氨酸(PS)暴露的机制.将红细胞于葡萄糖缓冲液中孵育后用流式细胞术分析PS标记率和前向角值;检测caspase-3和caspase-8的活化情况;用流式细胞术和荧光显微镜观察亮抑酶肽对葡萄糖引起的红细胞PS暴露的抑制效果.结果表明:葡萄糖可以诱导红细胞PS暴露,而且其效率和葡萄糖浓度密切相关.随着葡萄糖浓度的增加,红细胞的Ps标记率呈逐步增加的趋势,当葡萄糖浓度为0.8moL/L时,红细胞的Ps标记率在80%以上.然而,在葡萄糖引起的红细胞PS暴露过程中,caspase-3和caspase-8没有活化,而亮抑酶肽却可以很好地抑制红细胞PS暴露和使其体积缩小.随着亮抑酶肤浓度的增加,红细胞PS标记率呈逐步下降的趋势,而细胞体积却呈逐步增加的趋势.结论:高浓度葡萄糖可以导致严重的红细胞PS暴露,而且这种PS暴露和caspase无关,推测葡萄糖诱导的红细胞PS暴露是受一条对亮抑酶肽高度敏感的、未知的通路调控的.
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流式细胞术联合测定保存血小板表达的磷脂酰丝氨酸和CD62p
人类血小板通过不同的技术进行离体保存后,其特性改变差异较大.建立适用于各种保存血小板特性分析的流式细胞术(FCM)对保存血小板的质量监测和新保存方法研究有重要意义.本研究通过对FCM分析方法主要条件的优化评估,建立了联合测定血小板膜表面包括磷脂酰丝氨酸在内的多参数FCM定量分析方法.在标本制作中,血小板不需要洗涤即可直接进行标记,减少了血小板离心洗涤过程中的激活.除了FCM常用的同型对照外,文中还将新鲜富含血小板血浆(FPRP)、凝血酶激活FPRP和液氮处理FPRP作为血小板标准阴性、阳性对照,直接应用于FCM分析,且效果良好.该方法中Gly-Pro-Arg-Pro乙酸盐(GPRP)的选择应用,既防止了血小板聚集和纤维蛋白的形成,同时可稳定血小板,减少制备过程中人为激活,克服了在血小板、Ca2+和血浆共存条件下FCM定量分析血小板的困难,尤其是为深低温处理血小板包括PS在内的多参数分析提供了良好的方法基础.研究表明该方法标本处理简单,结果分析简便、准确,重复性好.作者还通过低温、低渗或激活剂的方法制备了几种膜表面分子标记显著不同的血小板应用于FCM分析,不仅证实了所建立的FCM分析方法在各种不同膜表面分子标记的血小板分析中的实用性,又表明了文中制备的这4种不同膜表面分子标记的血小板在FCM分析保存血小板方法学中的实用价值.
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人脐静脉内皮细胞内化膜微粒通路的初步探索
目的:探讨人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)内化骨髓间充质干细胞(MSC)来源膜微粒(microparticles,MP)的可能途径.方法:将人骨髓MSC经低氧低营养诱导后收集上清,超速离心机分离提取MP,电子显微镜鉴定其形态及大小;流式细胞术检测MP表面标记物及磷脂酰丝氨酸(PS)的表达;细胞免疫荧光技术观察HUVEC是否表达PS受体(PSR).将DiI标记的MP与HUVEC共孵育,体系中加入PSR封闭性抗体,在共聚焦显微镜下观察MP的内化过程.结果:MSC在低氧低营养条件下诱导产生的膜微粒高表达PS,内皮细胞表面表达PSR.MP可快速进入内皮细胞,并主要分布于细胞核周围胞浆.抗体封闭内皮细胞PSR后,HUVEC内化MP的过程明显受抑,抑制率达80％以上.结论:MSC-MP表面的PS与HUVEC表面PSR的特异性结合,是MP内化的关键环节.
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黄芪多糖降低红斑狼疮小鼠抗磷脂抗体和尿蛋白的作用
为了研究黄芪多糖对抗磷脂抗体和尿蛋白的影响,本研究选用病理及组织学改变类似人类红斑狼疮的自发SLE模型NZB×NZW F1小鼠观察不同剂量黄芪多糖对其抗心磷脂(anticardiolipin, aCL)、抗磷脂酰胆碱(antiphosphatidyl choline, aPC)、抗磷脂酰丝氨酸(antiphosphatidyl serine, aPS)、抗磷脂酰肌醇(antiphos-phatidyl inositol,aPI)、抗磷脂酸(antiphosphatidic acid, aPA)抗体和抗磷脂酰乙醇胺(anti-phosphatidyl ethanolamine, aPE)抗体的水平、尿蛋白含量的影响.
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TF+MP和PS在急性早幼粒细胞白血病血栓形成中的作用
目的 探讨急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者乏血小板血浆中表达组织因子微粒(tissue factor microparticles,TF+MP)的数量、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)及D-二聚体(D-dimer,D-D)的水平变化,并研究TF+MP与D-D的相关性.方法 选择APL患者30例,其中APL合并弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)患者22例(APL-DIC组),APL未合并DIC患者8例(APL-非DIC组).另外选取30例健康体检者作为正常对照组.采用流式细胞术检测APL患者外周血TF+MP的数量；采用酶联免疫吸附法检测血浆中PS的水平；采用全自动凝血分析仪检测D-D的水平,并对所有数据进行统计分析.结果 三组间TF+MP、PS及D-D水平差异均有统计学意义(P均＜ 0.05).APL-DIC组TF+MP数量、PS及D-D水平均明显高于APL-非DIC组和正常对照组,差异均有统计学意义(P均＜ 0.05).APL-DIC组治疗前TF+MP数量和PS水平均高于治疗后,差异均有统计学意义(P均＜ 0.05)；APL-非DIC组治疗前后各指标差异均无统计学意义(P均＞0.05).APL-DIC组TF+MP数量与D-D水平呈正相关(r=0.63,P＜ 0.05).结论 APL合并DIC患者外周血中TF+MP数量和PS水平明显升高,其在血栓形成过程中发挥重要作用,可作为判断血栓形成倾向的实验室指标.
关键词： 急性早幼粒细胞白血病 组织因子微粒 磷脂酰丝氨酸 血栓形成 D-二聚体 -
红细胞磷脂酰丝氨酸外露在腹膜透析患者贫血中的意义初探
目的探讨腹膜透析患者红细胞磷脂酰丝氨酸(PS)外露在贫血发生中的作用.方法选择北京大学第一医院67例临床稳定的腹膜透析患者.采用荧光标记的Annexin V方法结合流式细胞仪测定红细胞PS外露水平,并分析其与贫血的关系.结果多元Logistic回归分析提示红细胞PS外露水平是贫血发生的危险因素之一(Hazards ratio=-0.421,P＜0.05).偏相关分析提示红细胞PS外露水平与血红蛋白水平呈负相关(r=-0.2601,P＜0.05)(控制促红细胞生成素因素).结论红细胞磷脂酰丝氨酸外露增加是腹膜透析患者贫血发生的危险因素,红细胞磷脂酰丝氨酸外露水平越高,患者越容易出现贫血.
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磷脂酰丝氨酸及其结合配体与尿毒症血液高凝状态的相关性
众所周知,尿毒症患者存在着凝血功能异常,表现为出血倾向和血液高凝两个方面.现尿毒症患者血液高凝即血栓形成的发病率逐渐升高,这主要与凝血系统功能异常、纤溶活性异常、血小板活性异常等多方面因素相关.近年来许多研究证实凝血过程发生时血小板、红细胞膜表面所表达的磷脂酰丝氨酸(PS)参与凝血过程并与尿毒症血液高凝状态、血栓形成有重要关系.现将国内外研究状况综述如下.
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梅毒病人抗磷脂抗体检测
20世纪初发现的梅毒非特异性抗体可与多种磷脂成分反应.人体内的磷脂主要是含甘油醇的甘油磷脂[1].应用ELISA法对82名正常人、76例梅毒病人和另外11例病人治疗前后抗心磷脂抗体(aCL)、抗磷脂酸抗体(aPA)、抗磷脂酰丝氨酸抗体(aPS)、抗磷脂酰乙醇胺抗体(aPE)、抗磷脂酰胆碱抗体(aPC)、抗磷脂酰肌醇(aPI)抗体进行检测.
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抗心磷脂抗体检测和抗磷脂抗体综合征诊断
磷脂是指分子中含有醇,脂肪酸和磷酸基因团的一类化合物.人体内的磷脂主要是含有甘油醇的甘油磷脂,包括心磷脂,磷脂酰丝氨酸,磷脂酰胆固醇,磷脂酰乙醇胺等.
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超极化停搏对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响
目的 观察超极化停搏对体外循环(extracorporeal circulation,ECC)中缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响,评价其对心肌的保护作用.方法 将75只健康家猫随机均分为3组.应用猫ECC模型.并行循环组:ECC建立后不阻断上、下腔静脉和主动脉,仅并行循环150 min;去极化停搏组:主动脉阻断(ACC)60 min,再灌注60min,心脏停搏液使用去极化高钾St.Thomas液;超极化停搏组:心脏停搏液使用含吡那地尔的低钾St.Thomas液,余处理与去极化停搏组相同.应用Annexin-V/PI联合染色、流式细胞仪检测心肌细胞膜磷脂酰丝氨酸的外翻,比较超极化停搏处理组及去极化停搏组ECC过程中心肌细胞坏死和凋亡的数量.结果 去极化停搏组于ACC 60min及再灌注60 min时坏死心肌细胞率分别为(2.727±0.436)%及(5.622±1.389)%;而超极化停搏组分别为(1.514±0.333)%和(3.052±0.403)%.两组ACC 60 min时,均未检出凋亡心肌细胞,但在再灌注60 min时,去极化停搏组和超极化停搏组凋亡细胞率分别达(2.253±0.581)%和(0.875±0.232)%.超极化停搏处理组缺血再灌注期间坏死及凋亡的心肌细胞明显减少.结论 超极化停搏不仅能减少ECC缺血再灌注导致的细胞坏死,而且能够抑制再灌注期间发生的细胞凋亡.
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急性期高血压脑出血促凝微粒分析
目的 研究高血压脑出血患者急性期释放增加的促凝微粒(MPs)的细胞起源,试探讨乳黏素对高血压脑出血患者的治疗意义.方法 采集并离心高血压脑出血急性期(6～72 h)患者45例和健康人30例外周血,利用流式细胞仪对MPs进行定性、定量分析.结果 急性期高血压脑出血患者MPs在6 h(P=0.021)开始升高,24h(P=0.024)达到高峰,急性期总体高于对照组.MPs主要来源于红细胞(P=0.028)、血小板(P=0.012)、内皮细胞(P=0.002)及胶质细胞(P=0.031),P＜0.05为差异有统计学意义.结论 急性期高血压脑出血患者外周血MPs释放明显增强,来源细胞明显处于激活状态,反映出患者外周血整体促凝活性明显增强,有明显形成血栓倾向.
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表达双色荧光蛋白的RAW264.7单克隆细胞株的构建及鉴定
目的 利用慢病毒载体(pVSVG)构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株及其功能鉴定,以期实时检测它们在破骨细胞形成过程中的表达及动态变化.方法 利用pVSVG构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株,采用激光扫描共聚焦显微镜活细胞成像技术连续动态观察RAW264.7细胞在NF-κB受体激活蛋白配体诱导下向破骨细胞形成的过程.采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate-resistant acid phosphatase staining,TRAP)及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色对表达磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)与超正电荷的RAW264.7细胞株及破骨细胞进行功能鉴定.结果 联合转染的RAW264.7细胞株形态为圆形或椭圆形,为正常生长形态,且保留了良好的破骨细胞分化能力.超正电荷绿色荧光蛋白(+ 8-greenfluorescent protein,+8-GFP)主要表达在RAW细胞的质膜上,分布均匀;当破骨细胞形成后,+8-GFP在质膜上的荧光强度明显减弱;PS表达在RAW细胞的质膜上,但在破骨细胞形成后,PS不仅表达在质膜上,同时也分布在细胞质和细胞器上.活细胞成像观察发现破骨细胞融合可发生在贴壁状态下及单核与单核、单核与多核及多核与多核细胞之间,终形成巨大的多核破骨细胞,因此破骨细胞的融合具有反复性.结论 成功构建可同时表达双色荧光蛋白的单克隆细胞株,为在三维空间进一步研究膜融合过程中的各种蛋白质和其他分子的构象改变,以及它们之间的相互作用方式提供了平台.
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磷脂化合物促进盐酸丁卡因经皮渗透的研究
目的比较磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、鞘磷脂等4种磷脂化合物对盐酸丁卡因促透作用的影响.方法以小鼠普通皮肤,去角质层皮肤和经磷脂化合物预处理皮肤为渗透屏障,分别以1%和3%的磷脂化合物作为渗透促进剂,采用改进Franz扩散池进行离体皮肤渗透实验,用高效液相色谱法测定接收液中盐酸丁卡因的含量.结果4种磷脂化合物对盐酸丁卡因的促透作用顺序为:磷脂酰甘油＞磷脂酰丝氨酸＞磷脂酰胆碱＞空白组＞鞘磷脂;对于不同渗透屏障,盐酸丁卡因的经皮吸收顺序为:去角质层皮肤＞经磷脂化合物预处理皮肤＞普通皮肤.结论磷脂化合物作为一种低毒、无刺激性的渗透促进剂,能够提高药物的经皮渗透效果,具有开发应用前景.
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基于小鼠模型的子痫前期“血瘀证”研究
目的 结合磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱(PS/PC)微团诱导的子痫前期样小鼠模型,探讨子痫前期的“血瘀证”病机.方法 将27只妊娠ICR鼠随机分为2组,造模组于妊娠5.5～16.5 d,连续尾静脉注射PS/PC 1 mg/d,对照组则同期注射生理盐水0.1 mL/d,观察两组的收缩压、尿蛋白、胎仔重、胎盘重、吸收胚及死胎数、血小板计数、血浆抗凝血酶-Ⅲ含量、D-二聚体含量及凝血酶时间的变化,并分析胎盘纤维蛋白沉积和胎盘血管TM表达情况.结果 与对照组相比,造模组表现出高血压(129.467 mmHg vs 101.560 mmHg,P＜0.001)、蛋白尿(732.700 mg/L vs 186.200 mg/L,P ＜0.001)、胎仔匀称型宫内生长受限(0.983 g vs 1.119 g,P＜0.05)、吸收胚和死胎发生率增高；胎盘广泛纤维蛋白沉积形成(2.333 vs 1.267,P＜0.001),胎盘TM表达增加(0.193 vs 0.088,P＜0.01).造模组还表现为血浆抗凝血酶-Ⅲ含量降低(89.384 mg/L vs 135.373 mg/L,P＜0.001)、D-二聚体含量升高(6.992 mg/L vs 0.317 mg/L,P＜0.005)、血小板数量下降(83.650×1010 L-1 vs 117.000×1010 L-1,P ＜0.001)和凝血酶时间缩短(15.942 s vs 18.207 s,P＜0.001).结论 PS/PC微团静脉注射能诱导ICR孕小鼠止血功能发生异常,伴胎盘广泛纤维蛋白沉积形成,引起ICR 孕小鼠子痫前期样表现,故“血瘀证”,特别是胎盘“血瘀”状态可能是子痫前期发病的重要机制之一.
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乳黏素及膜连蛋白Ⅴ检测心血管疾病的细胞凋亡
许多心血管疾病与细胞凋亡密切相关,预凋亡细胞上磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内侧翻转到外侧.乳黏素比膜连蛋白Ⅴ可更早地识别预凋亡细胞上暴露的PS,因其特异性强,敏感度高等优点,已发展成一项新的PS检测技术,逐渐成为各个领域的研究热点,其可能对某些心血管疾病的早期预防和治疗有重要意义.该文主要从乳黏素和膜联蛋白Ⅴ的生物学特性及心血管疾病检测方面进行介绍,并对乳黏素的发展前景进行展望.
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65例抗心脂抗体阳性病例的临床分析
抗心脂抗体( anticardiolilpin antibody, ACL)是体内针对磷脂的一种自身抗体,除此之外,在临床应用的抗磷脂抗体还包括狼疮抗凝物、梅毒血清学假阳性相关抗体及抗磷脂酰丝氨酸、抗磷脂酰肌醇、抗磷脂酸等.近年来由于抗心脂抗体与患者的临床表现有密切相关性而受到极大关注.本文对我院三年间化验检查发现ACL抗体阳性的病例进行了回顾性分析,旨在探讨ACL抗体的临床意义,现报道如下.
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荷瘤小鼠单次化疗后活体探测肿瘤细胞凋亡的实验研究
细胞凋亡(cell apoptosis)见于诸多生理现象和病理情况[1].近年来,细胞凋亡检测技术已有陆续报道[2-4],其中放射性核素标记膜联蛋白Ⅴ体内凋亡显像技术以其无创性、早期性和定量性的优势独树一帜[5,6],其原理是化疗药物诱导肿瘤细胞产生凋亡,而在细胞凋亡早期,由于磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)暴露在细胞膜表面,导致与其有高特异性结合的放射性核素标记的膜联蛋白Ⅴ的摄取增加,通过体外射线探测仪器如单光子发射型计算机断层扫描仪(single photon emission computed tomography,SPECT)、正电子发射型断层扫描仪(positron emission tomography,PET)等,可以观察到肿瘤部位的摄取状况,从而判断肿瘤对化疗疗效的反应.细胞凋亡体内显像可以对肿瘤患者进行治疗疗效的监测、预后的评价以及治疗方案的指导,同时在抗肿瘤新药研发领域也具有重要意义[7,8].
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抗磷脂抗体和狼疮性肾炎
1抗磷脂抗体及抗磷脂综合征1.1抗磷脂抗体(Antiphospholipidantibody,aPL)aPL是一族针对带负电荷磷脂或带负电荷磷脂与蛋白的复合物的异质性自身抗体的总称,是诊断抗磷脂综合征(Antiphospholipid Syndrome,APS)的条件之一.目前已知的aPL的靶抗原有三大类:①磷脂:心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇;②磷脂-蛋白复合物:β2糖蛋白Ⅰ(β2-GP Ⅰ)、凝血酶原、纤溶酶、组织型纤溶酶原激活物、蛋白C、蛋白S、血栓调节素、膜联蛋白V、抗凝血酶原Ⅲ、PT复合物(Xa、V a、Ca、及磷脂)、Tenase复合体(因子Ⅸa、Ⅷa、Ca及磷脂)、高/低小分子激肽原等;③脂蛋白:氧化低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、载脂蛋白A-I.
