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基于FRET荧光蛋白探针的活体定量分子影像方法探究
目的 荧光共振能量转移(fluorescent resonance energy transfer,FRET)探针由于自身仍存在诸多局限,其在活体成像领域尚未得到广泛应用.本文旨在解决FRET探针在活体定量分子影像应用中所存在的瓶颈问题,即如何利用FRET探针精准计算目标物浓度,以及如何基于FRET探针实现三维成像.方法 基于探针和目标物结合时的化学反应平衡关系,提出一种新型分析方法,以精确定量待测物[钙调素(calmodulin,CaM)]的浓度.同时对于FRET探针的活体分子成像,结合荧光透射成像(3D-FMT)方法,建立了可进行三维时空动态FRET检测的平台系统,对FRET探针的测量结果(即待测物浓度)进行实时定量的三维重建.结果 准确地定量了待测物CaM浓度,并得到了高质量的3D-FRET分布影像.结论 提出FRET探针在活体成像应用领域两个关键问题的解决方案,为基因编码FRET探针向活体分子影像领域的推广奠定了重要的技术基础.
关键词： 荧光共振能量转移 基因编码FRET探针 荧光蛋白 荧光断层成像 钙调素 -
新型的动物模型-可示踪胰岛β细胞发育的转基因斑马鱼
目的 建立活体可视化胰岛β细胞发育的立体表达动物模型.方法 利用分子克隆、显微注射、全胚胎原位杂交和活体摄像等方法 ,建立绿色荧光蛋白标记胰岛β细胞的转基因斑马鱼.结果 建立并筛选获得胰岛β细胞发育的转基因斑马鱼,证实荧光蛋白与内源性胰岛素的共定位表达,实现活体动态监测胰岛β细胞的发育情况.结论 胰岛β细胞的转基因斑马鱼动物模型实现在整体动物水平上研究胰岛β细胞的发育.
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报告基因技术的理论基础及其应用
报告基因技术广泛地应用于监测细胞的信号转导和基因表达,通过把转录控制元件剪接到报告基因,可以直观地"报道"细胞内与基因表达有关的信号级联.这种检测具有敏感性高、方便、可靠而且适用于大规模检测等优点.随着报告基因技术及其检测方法的不断改进,荧光素酶、绿色荧光蛋白以及新近克隆出的红色荧光蛋白作为无害性的检测工具,将在检测活体组织和细胞基因表达方面得到越来越广泛的应用.此外,在研究疾病发生的分子机制,基因治疗和药物开发方面,报告基因技术也将发挥出重要作用.本文对报告基因技术的基础理论、常用报告基因的种类和特点,以及其目前的主要应用作了概括性介绍.
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荧光蛋白标记逆转录病毒整合酶及Brd2真核表达载体的构建
目的 构建绿色荧光蛋白标记的莫洛尼鼠白血病病毒 (MLV) 和人类免疫缺陷病毒 (HIV) 整合酶及红色荧光蛋白标记的Brd2的真核表达质粒, 为研究整合酶与Brd2相互作用打下基础.方法以Prr88-MLV、HIV质粒pNL4-3及含有Brd2的质粒为模板, 采用PCR技术扩增MLV-IN、HIV-IN、Brd2片段;利用酶切反应体系构建psectag2A-GFP-mIN、psectag2A-GFP-hIN、pDsred2-N1-Brd2质粒, 0.8％琼脂糖凝胶电泳后进行测序分析;用重组质粒转染293T细胞, 荧光显微镜观察目的蛋白表达情况, 并进行WB鉴定.结果 构建psectag2A-GFP-hIN、psectag2AGFP-mIN、pDsred2-N1-Brd2的真核表达质粒, 酶切以及测序结果与预期相符.将上述质粒分别转染293T细胞, WB及荧光显微镜均检测到目的蛋白的表达.结论 成功构建了绿色荧光标记的HIV、MLV整合酶真核表达质粒和红色荧光蛋白标记的Brd2真核表达质粒, 尽管Brd2真核表达质粒荧光相对较弱, 但这对整合酶与Brd2相互作用研究奠定了基础.
关键词： 莫洛尼鼠白血病病毒 人类免疫缺陷病毒 整合酶 溴结合蛋白 (Brd2) 荧光蛋白 -
现代免疫细胞化学和荧光图像技术
近20年来,生命科学、计算机科学、物理学、化学、生物信息学取得了巨大进步.人们已经可以表达、合成和突变体内的各种蛋白及其片段;已经可以随心所欲的制备出数以万计的抗各种天然蛋白、突变蛋白、翻译后经各种修饰(磷酸化、甲基化、乙酰化等)的蛋白、各种蛋白亚区、不同基序的抗体以及标记不同的细胞器的特异性抗体;已经可以合成许多稳定性好,不易淬灭,不受pH环境影响,水溶性好,发射光谱特异,适于多重标记的有机荧光色素,如分子探针Alexa Fluor系列[1]、Amersh的Cy系列[2]以及其他活体荧光标记分子;如FIAsH,ReAsH等二砷荧光色素[3]和O6-苯基鸟嘌呤荧光素(BGFL)[4],纳米量子颗粒(quantum dot)[5, 6]和荧光蛋白(GFP)[7]等;共聚焦扫描显微镜、全内反射荧光显微镜[8,9]及其他三维、四维荧光显微镜[10,11]和荧光图像数字图像系统的出现,又大大提高了对荧光信号的感知水平,即可感知细胞内低丰度(甚至单个分子)的标记荧光,其时间分辨率已可达微秒水平,其空间分辨率亦可与电镜匹敌[12].
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量子点:新的荧光标记物质
随着人类基因组计划的完成,细胞蛋白组学、细胞图谱蛋白组学要求对细胞亚区、亚结构的蛋白组成及其相互作用网络进行动力学分析,而荧光图像技术是进行这一研究的重要手段.有机荧光染料易于淬灭,瞬时即逝,无法对标记细胞进行长期的追踪及观察标记分子的动力学过程.荧光蛋白标记可以克服上述困难,但需使用基因工程技术制备可表达融合蛋白的质粒,进行细胞培养、基因转染等一系列操作,非一般实验室所能完成,而且,如要同时标记细胞中的不同蛋白则需构建多种含不同特性荧光蛋白的融合质粒,更增加了实验难度.近出现的纳米晶体(nanocrystals)即半导体微粒--量子点(quantum dots)标记技术,以其独特的优点引起人们极大注意.
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新生隐球菌荚膜基因CAP60与荧光蛋白融合表达系统的构建
荚膜是新生隐球菌的主要毒性因子,目前Chang等已克隆了4种荚膜基因:CAP59、CAP64、CAP60及CAP10.已知这4种基因对新生隐球菌的荚膜形成都是必须的,缺失任何一个基因都会使新生隐球菌变成无荚膜表型.搞清荚膜形成的任何一个生理、生化机制都将在新生隐球菌的临床诊断和治疗上带来突破性的进展.我们建立荧光蛋白作为标记与荚膜基因CAP60融合表达,为进一步的研究创造条件.
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基于Keima荧光蛋白的线粒体自噬评价体系的建立
目的:探讨建立一种基于Keima荧光蛋白评价线粒体自噬的体系.方法:由于Keima蛋白具有在酸性和中性pH中荧光信号不同的特性,因此定位于线粒体的Keima (mt-Keima)可显示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体,以此可以直观反映线粒体自噬的程度.构建定位于线粒体的Keima (mt-Keima)稳定表达载体,利用慢病毒感染的方式获得稳定表达细胞系.以CCCP刺激诱导线粒体自噬,观察刺激0～8 h 440 nm通道(指示中性pH下的Keima)和586 nm通道(指示酸性pH下的Keima)激发荧光信号的变化.结果:电泳结果显示mt-Keima基因片段扩增成功,酶切质粒鉴定结果显示重组质粒构建成功.不同pH条件下440 nm和586 nm激发光激发出的荧光信号不同,表明Keima蛋白表达正常并能够指示酸碱变化.在线粒体自噬诱导剂CCCP刺激下,细胞的酸性荧光信号随刺激时间逐步增加,表明线粒体自噬程度逐渐增强.结论:构建的体系能够准确评价线粒体自噬,为进一步探讨线粒体自噬机制提供了实验基础.
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纤维蛋白凝胶种植技术在组织工程软骨体外构建中的应用
目的 探讨纤维蛋白凝胶种植技术应用于体外构建组织工程软骨,从而改善目前常规构建技术的缺陷.方法 首先采用逆转录病毒pLEGFP-N1对人间充质干细胞进行荧光蛋白标记,然后分别应用纤维蛋白凝胶种植技术(A组)和沉淀种植技术(B组),体外构建细胞-材料复合体,通过倒置荧光显微镜和扫描电镜等观测种子细胞在支架材料内的分布与数量.结果 逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记间充质干细胞,并应用于工程化组织体外构建的示踪;A组细胞在材料内分布更均匀、数量更多,构建第2天细胞数量为(3.53±0.18)×106/个复合体,而B组细胞为(0.88±0.13)×106/个复合体,两组数据差异非常显著(P＜0.01).结论 纤维蛋白凝胶种植技术简单易行,可以改善种子细胞在软骨支架材料内的分布,并提高细胞密度,为体外高效构建组织工程软骨创造了条件.
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表达双色荧光蛋白的RAW264.7单克隆细胞株的构建及鉴定
目的 利用慢病毒载体(pVSVG)构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株及其功能鉴定,以期实时检测它们在破骨细胞形成过程中的表达及动态变化.方法 利用pVSVG构建表达双色荧光蛋白的单克隆RAW264.7细胞株,采用激光扫描共聚焦显微镜活细胞成像技术连续动态观察RAW264.7细胞在NF-κB受体激活蛋白配体诱导下向破骨细胞形成的过程.采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate-resistant acid phosphatase staining,TRAP)及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色对表达磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)与超正电荷的RAW264.7细胞株及破骨细胞进行功能鉴定.结果 联合转染的RAW264.7细胞株形态为圆形或椭圆形,为正常生长形态,且保留了良好的破骨细胞分化能力.超正电荷绿色荧光蛋白(+ 8-greenfluorescent protein,+8-GFP)主要表达在RAW细胞的质膜上,分布均匀;当破骨细胞形成后,+8-GFP在质膜上的荧光强度明显减弱;PS表达在RAW细胞的质膜上,但在破骨细胞形成后,PS不仅表达在质膜上,同时也分布在细胞质和细胞器上.活细胞成像观察发现破骨细胞融合可发生在贴壁状态下及单核与单核、单核与多核及多核与多核细胞之间,终形成巨大的多核破骨细胞,因此破骨细胞的融合具有反复性.结论 成功构建可同时表达双色荧光蛋白的单克隆细胞株,为在三维空间进一步研究膜融合过程中的各种蛋白质和其他分子的构象改变,以及它们之间的相互作用方式提供了平台.
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骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达
目的构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础.方法从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过Bgl Ⅱ和Pst Ⅰ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP.利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-231BO中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆.结果成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记.结论真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础.
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关键词：
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构建以荧光共振能量转移技术为基础的生物学活性前列腺特异抗原检测器
目的构建可在体外应用荧光共振能量转移(FRET)技术检测具有酶活性的前列腺特异抗原(PSA)的生物检测器.方法构建原核细胞表达质粒,从而在大肠杆菌中表达在供体和受体荧光蛋白之间以PSA特异性识别氨基酸序列SSYYSG连接的融合蛋白.将纯化的融合蛋白依次用糜蛋白酶、胰蛋白酶、商品化的纯品PSA及精液切割,检测其荧光共振能量转移现象的变化.结果糜蛋白酶、商品化的纯品PSA及精液切割均可有效抑制融合蛋白的FRET现象,并表现出对时间和剂量的依赖关系.而胰蛋白酶在90 min内未见FRET抑制现象.结论本研究构建的FRET检测器可成功检测具有酶活性的PSA,为活性PSA的检测提供一种可选择的途径.
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小动物活体成像技术的应用
小动物活体成像技术在国内外得到越来越多的普及应用,极大地促进了生命科学特别是肿瘤研究的发展.本文就小动物活体成像技术的原理、标记方法和实际应用做简单介绍.
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双荧光蛋白报告基因分析系统在微小RNA研究中的应用
目的:建立双荧光蛋白报告基因分析系统,并用来验证微小RNA的靶基因.方法:选取表达绿色荧光蛋白的质粒peDNA3/EGFP,将待验证微小RNA靶基因的一段特异性序列插入该质粒中,并与表达红色荧光蛋白质粒pDsRed2-N1共同转染细胞,转染后的细胞和提取的蛋白样品,分别用荧光显微镜和荧光分光光度计进行定性和定量检测.结果:通过对一特定小RNA(miR-27a)的可能靶基因prohibitin进行验证.终确定prohibitin是miR-27a的靶基因.结论:双荧光蛋白报告基因分析系统是一种验证微小RNA靶基因的可靠方法.
关键词： 微小RNA 荧光蛋白 靶基因 miR-27a prohibitin基因 -
极具医学价值的转基因克隆猪
近,由中国科学院广州生物医药与健康研究院成功培育出的8头特殊转基因克隆猪开始“生儿育女”.这种克隆猪在特定波长的激发光下可分别发出红、黄、绿、青4种荧光,这是国际上首次获得能同时表达4种荧光蛋白的转基因克隆猪.专家表示,这使其在疾病模型、器官移植、生物反应器等领域的应用前景更为广阔.然而,这种技术会改写未来的生物进化史吗？它会存在什么样的风险？
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钱永健——是这样获得诺贝尔化学奖的
钱永健:诺贝尔化学奖得主美国科学院院士、国家医学院院士,现任美国加州大学圣迭戈分校化学及药理学系教授.2004年沃尔夫奖医学奖得主.这位祖籍浙江,1952年出生在纽约的华裔,是中国导弹之父钱学森的堂侄.他发明的多色荧光蛋白标记技术被评价为"为细胞生物学和神经生物学发展带来一场革命".他是2008年诺贝尔化学奖三位得主之一.
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假狂犬病毒标记研究神经传导通路的新进展
假狂犬病毒能在感染后寄生于周围神经系统,并跨突触感染相连的神经元或器官.由于能自我繁殖使信号放大,因此很早就被用作标记物研究神经传导通路.假狂犬病毒的结构决定了它的功能,特别是膜蛋白与病毒的侵袭,跨神经元传播密切相关.近年来,研究人员通过反复传代筛选或基因重组技术剔除了某些膜蛋白或加入了新的荧光蛋白,创造出一批新的病毒,使假狂犬病毒能够研究更多级神经元,直接通过荧光显微镜观察,通过多重标记来观察各神经通路间的相互作用.此外,特定的转基因动物和新型假狂犬病毒合用也显示出了广阔的应用前景.繁多的病毒种类和使用方法给研究带来极大便利的同时也对实验设计提出了更高的要求.合理选择,使用假狂犬病毒必然能够对神经传导通路研究起极大的推动作用.
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pDsRed-C1-CDNF真核表达载体在大鼠骨髓间质干细胞中的表达
背景:骨髓间质干细胞是一类具有多向分化能力的成体干细胞,目前,已有将其作为细胞载体对帕金森病进行治疗的相关报道.目的;构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并诱导其在大鼠骨髓间质干细胞中表达.方法:通过RT-PCR的方法从小鼠组织中扩增出CDNF基因片段,并在其两端引入Xho I、BamH I限制性内切酶酶切位点,然后将其克隆至pDsRed-C1真核载体,构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并通过Lipofectin2000将其转染至大鼠骨髓间质干细胞中.结果与结论:pDsRed-C1-CDNF真核表达载体经双酶切、单酶切、PCR及测序验证正确,提示已成功构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体并已转染至大鼠骨髓间质干细胞中.
关键词： 保守性多巴胺能神经营养因子 帕金森病 真核表达载体 荧光蛋白 骨髓间质干细胞 -
肌动蛋白和Tau蛋白荧光蛋白融合载体的构建、表达及其细胞内定位
背景:肌动蛋白和Tau蛋白分别是微丝和微管的重要组成成分,肌动蛋白和Tau蛋白的分布能否作为微丝和微管的观察指标.目的:构建肌动蛋白和Tau蛋白的红色和绿色荧光蛋白融合表达载体并转染真核细胞,观察其在细胞内的表达和定位情况.设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2008-03/08在南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室共同完成.材料:克隆在pcDNA3载体上的肌动蛋白和Tau蛋白真核表达载体pcDNA3-actin和pcDNA3-Tau,以及红色荧光蛋白表达载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2、大肠杆菌株DH5α和小鼠NIH3T3细胞系由南方医科大学病理生理学教研室保存.方法:将克隆在pcDNA3上的肌动蛋白和Tau蛋白亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,然后转染NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察重组载体的表达和细胞内定他.主要观察指标:NIH3T3细胞转染24h后.利用Leica荧光显微镜观察上述重组载体在细胞中的表达和定位情况.结果:重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在NIH3T3细胞中可获得高量表达.融合蛋白发出的红色和绿色荧光均表明,肌动蛋白在细胞质中呈短丝状弥散分布,Tau蛋白以细胞核为中心呈放射状排列.结论:成功构建了肌动蛋白和Tau蛋白的不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,这为研究细胞骨架在信号分子移位中的作用提供了一个重要的工具.
