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人bFGF卵清蛋白分泌表达载体的构建及分析
目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的卵清蛋白分泌表达载体,为建立鸡输卵管生物反应器奠定基础.方法:利用PCR手段,从鸡基因组DNA克隆了4.1k(-4050bp～+42bp)卵清蛋白(ovalbumin)上游调控序列,利用重叠PCR技术,将溶菌酶信号肽(lysozyme signal peptide)基因与人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因融合在一起.结果:经DNA测序和核酸电泳检测,OV启动子基因序列、pcsbFGF和pcOV-sbFGF电泳位点与预计结果一致.结论:人bFGF的卵清蛋白分泌表达载体构建初步完成,可进行进一步转染表达.
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酶膜反应器及其应用
酶膜反应器是一种新型的具有生物反应、分离、浓缩、回收功能的生物反应器，目前应用得越来越广泛。文章从酶膜反应器的原理、特点等方面对酶膜反应器进行了详细的介绍，对其应用，尤其是在食品工业中的应用进行了阐述。并对其以后的应用及发展作了展望分析。
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家蚕制品的急性毒性及微核试验
我国的养蚕业已有5 000多年历史.家蚕一直被认为是对人类有益无害的重要经济昆虫.随现代科学技术的发展,通过基因操作,已将家蚕核型多角体病毒作为新型表达载体,用其宿主家蚕用为生物反应器生产重要的医药产品.验证这个表达环境对人体的安全性及对系统的推广应用具有重要的意义.为此,我们参照了国家药物评价指南,对家蚕幼虫和蛹的体液、蚕卵的急性毒性试验,致突变性进行评价,为该系统的环境和人体危险度评估,也为家蚕的综合利用提供参考依据.
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三种细胞培养模型的效果评价
原代大鼠肝细胞经不同体外细胞培养模型培养后,对肝细胞的酶渗出量、白蛋白分泌水平和细胞色素P450 1A(CYP 1A)活性进行了分析.结果显示:在三种培养模型中,培养液的LDH水平随培养时间的延长而逐渐降低,但在单层培养(MC)的第5天,LDH水平明显升高,而夹层培养(SC)的LDH在第8天后没有检出,AST和ALT水平在整个培养过程中无明显变化.在生物反应器中( bioreactor),肝细胞基础CYP1A活性可维持2周以上,培养液中白蛋白的含量以生物反应器高,其次是SC和MC.随着培养时间的延长,MC和SC中肝细胞CYP 1A活性逐渐降低,且MC肝细胞CYP 1A活性的下降速度比SC快.这种现象可被细胞色素P450(P450)的诱导剂如奥美拉唑和3-甲基胆蒽(3-MC)部分改变,MC肝细胞的诱导作用总是比SC肝细胞强.结果证实每一个体外细胞培养模型都有各自的优缺点,不同的体外细胞培养模型可以解决问题的不同方面.
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生物人工肝系统的生物反应器
目前,生物人工肝系统正在成为急性肝衰竭患者体外有效的肝支持治疗手段,在该系统中,生物反应器起着重要作用.迄今为止,设计和研究的生物反应器已有多种,如平板式反应器、中空纤维型反应器、灌流床式/支架型反应器、肝细胞包裹与悬浮型反应器等.本文介绍了生物反应器的基本作用、功能、条件和要求,并对4类主要生物反应器的研究进展予以综述.
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转壁生物反应器中动态分化组织工程软骨的实验研究
目的:在转壁生物反应器动态环境中分化骨髓间充质干细胞(bMSC),制备立体组织工程软骨.方法:穿刺吸取成年兔骨髓,分离扩增bMSC,复合于纤维蛋白凝胶制成圆柱状三维组织(细胞密度2.0×107/ml),置于转壁生物反应器中进行分化培养,同时设单纯静止培养组.5周后观测大体形态和组织学形态、Ⅰ和Ⅱ型胶原免疫组织化学表达,测量分化组织的细胞活力.结果:动态培养可以有效保持材料大体形态,甲苯胺兰染色阳性,无明显Ⅰ型胶原表达,大量表达Ⅱ型胶原,人工组织的细胞活力显著高于单纯静止培养方法.结论:转壁生物反应器培养明显改善组织工程软骨的活力,有利于进行三维材料体外软骨分化.
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不同生物反应器对丹参不定根培养过程中有效成分的影响
目的:研究不同生物反应器对丹参不定根培养的影响.方法:利用组织培养技术结合高效液相色谱法,考察小同生物反应器对丹参不定根生长以及丹参不定根有效成分丹参酮Ⅱ_A(TA)及原儿茶醛(PA)含量积累的影响.结果:不同反应器培养丹参不定根中,60°圆锥型反应器有利于丹参不定根有效成分的积累.测定60°圆锥型反应器中的丹参不定根生长曲线以及有效成分产物积累曲线形如"S"型.丹参不定根培养在第35天达到大生物量为16.24 g·L~(-1)(鲜重),有效成分丹参酮Ⅱ_A(TA)和原儿茶醛(PA)在第40天达到高,分别为0.23,0.51 mg·g~(-1)干重.结论:60°圆锥型反应器有利于丹参不定根有效成分的积累,本实验对于丹参不定根大规模培养具有潜在意义.
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白色紫锥菊不定根诱导及咖啡酸衍生物积累研究
以白色紫锥菊试管苗子叶为外植体,研究了植物生长素2,4-D,IAA,IBA,NAA对不定根诱导以及IBA浓度对液体悬浮培养中不定根的生长及咖啡酸衍生物积累的影响,并进行了生物反应器培养.结果表明,对白色紫锥不定根诱导适合植物生长素是IBA1.0mg· L-1,不定根诱导数目达到22.5根/培养皿.液体悬浮培养中IBA 1.0 mg·L-1适合不定根生长及咖啡酸衍生物的积累.白色紫锥菊不定根在5L气升式生物反应器中培养30 d后可获得8.98 g· L-1干重,是三角瓶悬浮培养干重4.38 g·L-1的2.05倍；生物反应器培养的不定根中紫锥菊苷质量分数为14.08 mg·g-1(干重),是栽培根的2.4倍；氯原酸,菊苣酸,总咖啡酸衍生物含量是栽培根的4.0 ～25.6倍.该研究为大量生产紫锥菊药品可提供富含紫锥菊苷等咖啡酸衍生物的高品质生物医学药材.
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波浪式WAVE生物反应器悬浮培养枇杷细胞生产熊果酸的研究
采用波浪式WAVE生物反应器放大培养枇杷悬浮细胞,研究细胞生长及熊果酸(UA)的累积情况.摇瓶和反应器中,以细胞的干重和UA的含量为指标进行对比试验;反应器中1L和5L工作体积下,以培养液中元素代谢、细胞的干重、UA的含量为指标进行对比试验;生物反应器中,1L的工作体积下,以接种量、转速、转动角度为因素开展正交试验筛选佳的组合.反应器中细胞的干重增长及UA含量比摇瓶中高出了105.5％,27.65％;生物反应器中不同的工作体积下,培养液中元素的代谢、细胞的干重及UA的累积情况相似;生物反应器中,接种量为80 g,转速为26 r·min-1,角度为6°是佳组合,接种后100 h收获,细胞的干重为19.01 g· L-1,UA质量分数为27.750 mg·g-1.结果表明WAVE生物反应器比摇瓶更适合枇杷细胞悬浮培养,并且可实现1L到5L的培养放大.
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新型生物人工肝反应器悬浮培养参数的优化测定
目的 对新型生物人工肝反应器进行参数的优化测定,以寻找更适合肝细胞生长的工作条件.方法 从实验和仿真两方面优化运行参数.通过调节生物反应器旋转速度、培养液流速,寻找能使细胞微载体均匀悬浮于反应器的合理运行参数.利用流体动力学仿真软件Fluent对新型生物反应器进行仿真,将仿真结果与实验结果进行对比得出合理工作范围.结果 生物反应器的旋转往复周期Z越大,反应器内细胞微载体达到均匀悬浮状态时所需的培养液流速就越大,即控制培养液流动的蠕动泵转速L越大.在确保细胞微载体均匀悬浮分布下,往复周期Z=0.5min时,没有合适的L值满足要求;往复周期Z=0.4min时,L的工作范围为120～160r/min;往复周期Z=0.3min时,L的工作范围为80～160r/min.结论 合理的运行参数优化了生物人工肝的工作方式,为动物实验及临床实验奠定了基础.
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小口径组织工程血管生物反应器的制造
生物反应器在构建小口径组织工程血管中起着重要的作用.本文设计并造了能够模拟人体小口径动脉脉动流的生物反应器.该反应器的波形发生器输出成年人左心室容积变化信号驱动直线电机作为动力源,通过调节后负荷,从而产生近生理的脉动流.特殊设计的旋转培养室可以对三维的管壁支架进行二次的细胞接种.并且使得旋转接种和脉动培养能够连续进行.与现有的组织工程血管生物反应器相比,在理论和实践上有较大的创新性.
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生物反应器在组织工程中的应用
组织工程学是利用生命科学与工程科学原理,体外制备用于修复受损组织的移植物,以满足器官移植需求.目前制备的工程化组织存在生物活性差和经济成本高的缺陷,限制了其临床应用.生物反应器是制备工程化组织的重要设备,它可以促进营养物质交换和增加机械应力刺激等.通过对培养微环境的精细调控,生物反应器可以促进工程化组织的熟化,降低成本,从而推动工程化组织的实际应用.
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一体化灌注法体外构建活化人工骨的优化研究
目的 探讨人胚成骨细胞在多孔β-磷酸三钙(β-TCP)支架内灌注性接种及培养的影响因素及其作用机制,对一体化灌注法体外构建活化人工骨进行优化研究.方法 应用自行设计的灌注式生物反应器进行多孔β-TCP支架内人胚成骨细胞的一体化灌注性接种和培养,以静态接种为对照.通过细胞活力(MTT法)测定、活细胞接种率、组织形态学观察和计量学分析等分别检测细胞接种时间、接种密度、灌注速率等因素对支架内细胞黏附和生长的作用.结果 细胞灌注接种效果优于静态接种;灌注接种-灌注培养法细胞生长及分布优于静态接种-灌注培养法.接种时间、接种密度、灌注速率等因素均显著影响细胞接种及培养效果.灌注法构建活化人工骨的优条件:接种时间12h～24h,接种密度2×105/ml～5×105/ml,灌注接种速率1 ml/min,灌注培养速率0.5 ml/min～2ml/min(灌注初期24 h)及2 ml/min(灌注24 h后).结论 一体化灌注法利于多孔β-TCP支架内人胚成骨细胞的黏附和生长.接种时间、接种密度、灌注速率等因素均影响活化人工骨体外构建效果,对其进行优化有助于人工骨移植物的临床转化和推广应用.
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脉动式张应力环境下培养组织工程血管的初步实验
目的 探讨脉动式张应力环境下,在生物反应器内进行组织工程血管(TEBV)培养的可行性.方法 从人脐动脉获取血管平滑肌细胞(VSMC),经体外培养扩增后接种到聚乙醇酸(PGA)支架并置于生物反应器内进行三维培养.实验组利用气动式左心循环辅助泵对VSMC施加模拟人体内血管环境(压力120 mm Hg,1 mm Hg=0.133 kPa,频率60次/min)的脉动式张应力作用.对照组无张力环境下进行三维培养.2周后收获TEBV分别行扫描电镜(SEM)检测、组织切片HE染色和Masson染色.结果 实验组TEBV外观色泽鲜亮,具有一定厚度和弹性,能自我维持管腔形状.SEM显示实验组TEBV管壁表面光滑平整,横切面有丰富的细胞外基质(ECM),ECM分布均匀,把PGA完全包裹.HE染色管壁均匀致密,ECM及细胞的排列具有一定方向性,其中含有未降解的PGA碎片.Masson染色管壁胶原纤维丰富.对照组TEBV外观色泽暗淡,管壁薄,弹性差,从支架取下后管腔塌陷.SEM显示管壁表面欠光滑,横切面上ECM含量少,大部分PGA没有被包裹.组织切片染色管壁结构疏松,ECM和胶原纤维含量较少,层次感差.结论 在生物反应器内的脉动式张应力环境下,可培养出具有良好形态结构的组织工程血管样组织.
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微载体技术及其在机体损伤修复中的应用
利用微载体生物反应器获得足够数量的种子细胞一直是组织工程的研究热点。微载体技术较传统平面细胞培养方式具有许多优势，如在短期内能够提高细胞生长数量，简化了以往复杂繁琐的培养过程，大大节省了空间和人力，并且能为细胞生长提供一个更适宜的微环境。近年来，细胞微载体无论在材料种类、制备技术及生物医学应用等方面都获得了极大的进步。除了细胞扩增功能，生物降解微载体还可作为生物支架及药物载体应用于组织工程。将具有生物降解能力的微载体作为细胞和药物的运载工具将其输送至体内，为组织缺损提供了一种全新的治疗途径，因此被广泛应用于创伤修复治疗的研究中。本文就微载体材料、微载体的结构及改性、微载体技术在临床机体损伤修复中的应用等方面进行综述。
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骨髓间充质干细胞构建组织工程化小口径血管
目的采用在动物体外构建初级组织工程化血管、体内强化的方法,探讨构建小口径组织工程化血管的可能性.方法体外培养骨髓间充质干细胞(BMSC),用含全反式维甲酸(AT-RA)、双丁酰环磷酸腺苷(db-cAMP)的DMEM-LG培养液和含血管内皮细胞生长因子(VEGF)的培养液诱导BMSC分别向血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞分化.免疫荧光观察平滑肌样细胞β肌动蛋白的表达和内皮样细胞vWF的表达.电镜观察超微结构的改变.诱导的血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞,分层种植于胶原包埋聚乙醇酸(PGA)的复合支架表面,将细胞和支架复合体种植于动物皮下,于植入后第4、8周再次麻醉动物,取出植入皮下的组织工程化血管,行组织学检查、压力实验及免疫荧光检查.结果诱导14 d后,BMSC能够分化为血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞:β肌动蛋白和vWF呈阳性表达,电镜证实细胞出现了相应的形态学改变.人工血管组织学观察见管壁结构清晰.单纯支架组可承受100～150 mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)的血管腔内压力,实验组则均可承受200mm Hg的血管腔内压力不破裂.实验组皮下培养8周Brdu标记细胞的免疫荧光结果显示部分细胞核呈现明亮的黄绿色荧光.结论以动物皮下为生物反应器可构建出组织工程化血管,其大体结构和天然血管相似.
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应用硫酸鱼精蛋白处理蔗糖密度梯度超速离心高度纯化流行性乙型脑炎灭活疫苗(非洲绿猴肾细胞)
目的 通过离心试验,制备出一种高纯度的流行性乙型脑炎(乙脑)灭活纯化疫苗(非洲绿猴肾细胞)[Purified Inactivated Japanese Encephalitis Vaccine (Vero Cell),JEV].方法 生物反应器培养的Vero细胞乙脑病毒液,超滤浓缩、甲醛灭活后,应用硫酸鱼精蛋白处理,再经过高速离心,蔗糖密度梯度超速离心纯化,超滤除糖,配制成JEV(Vero细胞).结果 经检测,疫苗中Vero细胞脱氧核糖核酸残留量≤10pg(皮克,Picogram)/剂,蛋白含量≤1μg(微克)/剂,宿主蛋白残留量≤30ng(纳克,Nanogram)/ml,并获得较高的抗原回收率.结论 经过优化硫酸鱼精蛋白处理和蔗糖密度梯度超速离心纯化,制得了高纯度的JEV(Vero细胞).
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转瓶培养与生物反应器微载体培养重组腺病毒的比较
目的 分别用3L转瓶和7L生物反应器微载体系统培养人胚胎肾细胞(HEK-293细胞)并接种H3型流感重组腺病毒,比较两种方法培养细胞及重组腺病毒的效果. 方法 分别用3L转瓶和7L生物反应器培养HEK-293细胞.转瓶每24 h取样,生物反应器每12 h取样,记录细胞总数.待细胞长满表面85％～90％时接种流感重组腺病毒,完全病变后收取病毒液并测定病毒滴度. 结果 转瓶培养HEK-293细胞3d,细胞增殖增加1.85～2.45倍,为(3.71～4.90)×107个[(2.95～3.90)×104 cells/ cm2],生物反应器培养3d,细胞增长4.72～5.00倍,为(132.15～140.09)×107个[(24.88～28.72)×104 cells/cm2].转瓶培养重组腺病毒滴度为6.85 TCID50/ml,生物反应器微载体系统培养腺病毒滴度为7.200 TCID50/ml. 结论 生物反应器微载体系统培养流感重组腺病毒数量和滴度均高于转瓶培养,不但提高了疫苗的产量,还减少了细胞分泌物的残留,增强了疫苗接种的安全性.
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欧洲型PRRSV、PCV2重组痘病毒疫苗灌注式生物反应器培养工艺的建立
目的 利用微载体-生物反应器技术培养乳仓鼠肾细胞,接种重组痘病毒rVTT-ORF2-EUO3O5,建立规模化制备欧洲型PRRSV、PCV2重组痘病毒疫苗的灌注式生产工艺. 方法 利用2L体积灌注式生物反应器培养BHK细胞,设定培养参数为温度37℃、溶氧度(DO)为60％,转速为80 r/min,pH值为7.3.当90％微载体表面贴满BHK细胞时以0.1 MOI的感染剂量接种重组痘病毒rVTT-ORF2-EUO3O5,设定感染参数为温度35℃、DO为50％、转速为50 r/min,pH值为7.1,继续培养观察. 结果 在采用灌注式生物反应器技术制备重组痘病毒过程中的细胞培养阶段,细胞培养96 h可获得1.587×1010个细胞数,细胞增殖39.67倍;在病毒增殖阶段,微载体上细胞完全脱落时的病毒滴度为2.12×109 PFU/ml. 结论 成功建立了欧洲型PRRSV、PCV2重组痘苗病毒灌注式生产工艺,为规模化制备重组痘病毒疫苗提供了技术参数.
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应用搅拌式生物反应器大量扩增人胎盘间充质干细胞的实验研究
探讨应用搅拌式生物反应器培养技术体外扩增人胎盘间充质干细胞(hPDMCs)的方法.以 hPDMCs为种子细胞,利用微载体悬浮法在搅拌式生物反应器内进行体外培养,同时设置静态培养的培养瓶为对照组,观察细胞的扩增速率、细胞代谢(乳酸、葡萄糖、培养液的pH值)的变化,检测生物反应器培养前、后干细胞的表面标记物.hPDMCs 在搅拌式生物反应器内每代可以扩增 (10.55±1.62) 倍,明显高于对照组 (6.10±0.11) 倍的扩增值(P＜0.05),且细胞生长代谢指标优于对照组;流式细胞仪检测应用搅拌式生物反应器,培养后细胞表面标记物的表达率无明显改变(P>0.05). 搅拌式生物反应器能够提供良好的细胞生长环境,建立用于 hPDMCs 的大量扩增的体外三维培养体系.
