首页 > 文献资料
-
转瓶培养与生物反应器微载体培养重组腺病毒的比较
目的 分别用3L转瓶和7L生物反应器微载体系统培养人胚胎肾细胞(HEK-293细胞)并接种H3型流感重组腺病毒,比较两种方法培养细胞及重组腺病毒的效果. 方法 分别用3L转瓶和7L生物反应器培养HEK-293细胞.转瓶每24 h取样,生物反应器每12 h取样,记录细胞总数.待细胞长满表面85％～90％时接种流感重组腺病毒,完全病变后收取病毒液并测定病毒滴度. 结果 转瓶培养HEK-293细胞3d,细胞增殖增加1.85～2.45倍,为(3.71～4.90)×107个[(2.95～3.90)×104 cells/ cm2],生物反应器培养3d,细胞增长4.72～5.00倍,为(132.15～140.09)×107个[(24.88～28.72)×104 cells/cm2].转瓶培养重组腺病毒滴度为6.85 TCID50/ml,生物反应器微载体系统培养腺病毒滴度为7.200 TCID50/ml. 结论 生物反应器微载体系统培养流感重组腺病毒数量和滴度均高于转瓶培养,不但提高了疫苗的产量,还减少了细胞分泌物的残留,增强了疫苗接种的安全性.
-
NMDA受体NR1a与NR2A亚单位重组体在HEK-293细胞的功能表达
目的:建立表达大鼠NMDA(N-methyl-D-aspartate)受体NR1a与NR2A亚单位重组体的细胞模型,研究其生物学及药理学特性.方法:利用脂质体转染方法将大鼠NR1a与NR2A亚单位重组体共转染到HEK-293细胞中,在细胞培养48～72 h后,利用膜片钳全细胞记录技术,观察和分析L-谷氨酸诱发的NMDA受体电流.结果:向转染后的HEK-293细胞表面喷射NMDA受体激动剂L-谷氨酸可在38%细胞上诱发出瞬时内向电流,该电流可被NMDA受体选择性拮抗剂D-AP5(50 μmol/L)完全阻断.L-谷氨酸诱发的电流具有快速失敏的动力学特征和内向整流特性,衰减时间常数(τ值)为(53±9)ms(n=20).L-谷氨酸诱发电流的EC50值为(8.5±0.5)μmol/L.结论:成功地将NR1a与NR2A亚单位转染入HEK-293细胞并形成NMDA受体的功能性表达,为进一步深入研究NMDA受体不同亚单位组成与其功能的关系及其药理学特性奠定了基础.
-
咪达唑仑对hERG钾通道的作用
目的:观察咪达唑仑对人胚肾上皮细胞(HEK-293)中异源表达的人类相关基因(hERG)钾电流作用及其机制.方法:利用全细胞膜片钳技术,观察咪达唑仑对hERG钾通道的抑制作用,分析其对通道激活、失活动力学过程的影响以及咪达唑仑对Y652A和F656C突变型hERG钾通道的作用.结果:咪达唑仑浓度依赖性地抑制hERG钾电流,其IC50值为(1.31±0.32)μnol/L.1.0μmol/L的咪达唑仑加药前后半数激活电压V1/2由(2.32±0.38)mV变为(-1.96±0.83)mY;加药前后半数失活电压V1/2由(-49.25±0.69)mV变为(-57.53±0.53)mV(P＜0.05),失活曲线左移;与野生型(WT)比较,Y652A和F656C突变型可显著减弱咪达唑仑对hERG通道的阻断作用.结论:咪达唑仑能阻断hERG钾通道,失活速度加快,Y652和F656可能是咪达唑仑与bERG钾通道结合的关键位点.
-
Endo G基因过表达对镉诱导HEK-293细胞凋亡影响
目的 观察细胞凋亡因子核酸内切酶G( endonuclease G,Endo G)基因过表达在镉诱导人胚胎肾细胞HEK-293凋亡中的影响.方法 从人肝癌细胞系(human hepatocarcinoma cells,HepG 2)中提取RNA,经逆转录获取互补DNA cDNA),通过聚合酶链反应(PCR)扩增Endo G基因,与pcDNA 3.0相连,构建pcDNA 3.0-Endo G真核表达载体,转染HEK-293细胞,并结合不同浓度氯化镉处理细胞;通过蛋白印迹实验(Western blot)验证基因过表达,吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)双染法及流式细胞术(FCM)检测Endo G基因过表达对镉诱导HEK-293细胞凋亡的影响,噻唑蓝法(MTT)检测细胞存活率.结果 成功构建pcDNA 3.0-EndoG真核表达载体,Endo G基因扩增片段大小约1 100 bp;该载体转染细胞后,Endo G成功过表达,使HEK-293细胞凋亡率＞37％,且随氯化镉浓度增加,Endo G表达量先上升后下降.结论 Endo G以诱导细胞早期凋亡和晚期凋亡为主要形式.
-
DNA聚合酶iota在HEK-293细胞中高表达体系的建立
目的:将带有DNA聚合酶iota(DNA Polymerase iota,Polι)目的基因的真核表达质粒PCDNA3.1转入HEK-293细胞,建立DNA聚合酶iota在HEK-293细胞中的高表达体系,为进一步研究DNA聚合酶在DNA损伤修复中的生物学功能奠定了基础.方法:用脂质体2000(Lipofectamine2000)将带有目的基因的真核表达质粒PCDNA3.1转入HEK-293细胞,通过G418筛选抗性克隆,用一步法提取细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测出高表达克隆.结果:通过G418筛选筛选出了具有G418抗性的克隆,通过RT-PCR技术检测出高表达DNA聚合酶iota的HEK-293细胞系.结论:建立了高表达DNA聚合酶iota的HEK-293细胞系.为进一步研究DNA聚合酶在DNA损伤修复中的生物学功能奠定了基础.
关键词： DNA聚合酶iota HEK-293细胞 DNA损伤 DNA修复. -
凋亡相关蛋白在汉坦病毒诱导HEK-293细胞凋亡过程中的表达及意义
目的 探讨Bcl-2、Bax及Caspase-3在汉坦病毒诱导人胚肾细胞(HEK-293)凋亡过程中的变化,为研究汉坦病毒诱导人胚肾细胞损伤的机制提供参考.方法 体外培养HEK-293细胞,分为正常对照组和汉坦病毒处理的感染组,采用间接免疫荧光法检测HEK-293内汉坦病毒抗原；用Westen blot方法检测Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达水平.结果 汉坦病毒感染HEK-293细胞1d后即开始出现荧光阳性细胞,随着时间延长,荧光强度逐渐增强,细胞胞浆内出现大量片状或颗粒性的黄绿色荧光；Western blot结果显示,与对照组比较,汉坦病毒感染1d后Bcl-2、Bax蛋白及Caspase-3酶原活化片段表达量未见明显变化(P＞0.05),感染3d和5d后Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达上调,Caspase-3酶原活化片段表达升高(P＜0.05).结论 汉坦病毒可感染HEK-293细胞并在其体内增殖,其损伤机制可能与Bcl-2表达减少和Bax蛋白表达上调,通过线粒体途径诱导HEK-293细胞发生凋亡有关.
-
针对人β-catenin基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建针对人β-catenin基因mRNA的shRNA真核表达载体,并转染HEK-293细胞,观察其对β-catenin的抑制效应.方法:化学合成用于产生针对β-catenin shRNA的对应DNA片段,将合成的寡核苷酸链退火形成双链,克隆入pSUPER真核表达载体,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定,筛选阳性克隆.通过脂质体介导,把重组质粒转染HEK-293细胞,RT-PCR、蛋白质印迹法检测其对β-catenin mRNA和蛋白的干涉效果,MTT比色法检测β-catenin基因表达抑制的细胞和对照组细胞的增殖.结果:RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示转染组β-catenin基因的表达水平下调,MTT检测显示β-catenin表达抑制的细胞光密度值下降,细胞增殖受到了抑制(P<0.01).结论:成功构建了针对人β-catenin基因的shRNA载体,转染HEK-293细胞后可抑制β-catenin基因的表达.
-
基于miRNA-30的RNAi表达框架的构建及其有效性验证
目的 构建基于人源性miRNA-30,针对EGFP基因的RNAi表达框架并验证其有效性.方法 融合PCR构建RNAi表达框架,经凝胶电泳、测序比对及二级结构预测后,将该表达框架与pEGFP-N2质粒共转染A549、HCT116及HEK-293细胞,48 h后倒置荧光显微镜观察EGFP的表达情况并用流式细胞仪检测平均荧光强度.结果 凝胶电泳和测序比对均显示RNAi表达框架与设计的相符,二级结构预测显示,新型RNAi表达框架与人源性miRNA-30的二级结构高度相似;共转染该表达框架与pEGFP-N2质粒48 h后,倒置荧光显微镜观察结果显示,3种细胞的荧光强度均明显减弱,流式细胞仪检测结果显示,3种细胞中共转染组与单独转染组相比平均荧光强度的差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 新型RNAi表达框架构建成功,且能有效干扰EGFP在A549,HCT116和HEK-293细胞中的表达.
-
全反式维甲酸通过Sp1/Sp3位点调节HEK-293细胞中CD2AP基因的表达
目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对人胚胎肾HEK-293细胞中CD2相关蛋白(CD2AP)基因表达的影响.方法 ATRA作用HEK-293细胞后,采用RT-PCR和Western blot分别检测CD2AP mRNA及其蛋白的表达.将构建的不同Sp1/Sp3位点的定点突变、巢式缺失突变的CD2AP启动子质粒转染HEK-293细胞,检测报告质粒的荧光素酶活性.结果 ATRA明显上调HEK-293细胞中CD2AP mRNA和蛋白水平(P＜0.05).缺失突变及点突变研究显示,Sp1/Sp3-A、C位点在介导ATRA上调CD2AP过程中发挥重要作用.结论 ATRA通过Sp1/Sp3结合位点诱导HEK-293细胞中CD2AP的表达；ATRA对CD2AP基因缺陷肾病患者可能有治疗作用.
-
促红细胞生成素对顺铂诱导HEK-293细胞毒性的保护作用
目的 研究促红细胞生成素(EPO)对顺铂(CDDP)诱导的人胚肾细胞(HEK-293)毒性的影响及其可能机理.方法 体外培养HEK-293细胞,采用MTT法检测不同浓度CDDP、EPO对HEK-293细胞的作用,倒置显微镜观察细胞形态变化,硫代巴比妥酸法检测细胞丙二醛(MDA)含量,比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性变化.结果 CDDP能明显抑制HEK 293细胞存活率,诱导细胞贴壁能力下降,增加MDA含量,降低SOD活性；而加入EPO后能明显改善这些状况.结论 EPO对CDDP诱导的HEK-293细胞损伤具有保护作用.其保护机制可能与其抗氧化活性、猝灭自由基的功能有关.
-
埃他卡林新衍生物激活ATP敏感性钾通道的亚型选择性
目的 研究埃他卡林新衍生物对不同亚型KATP通道的选择性作用.方法 在特异性表达Kir6.2/SUR1、Kir6.2/SUR2A、Kir6.1/SUR2B 3种不同亚型KATP通道的HEK-293细胞模型上,分别给予0.1、1.0、10、100 ×10-6 mol·L-1的埃他卡林新衍生物,研究其作用前后DiBAC4(3)细胞荧光强度的变化,评价其对克隆表达的不同亚型KATP通道的选择性作用.结果 7个埃他卡林新衍生物可激活KATP通道,其中衍生物(3)、(7)、(8)、(9)、(12)和(14)对3个亚型的KATP通道均具有激活作用,衍生物 (7)对Kir 6.2/ SUR2A亚型的激活作用强;衍生物(6)纳他卡林(natakalim)仅激活Kir 6.1/ SUR2B亚型,对Kir 6.2/ SUR2A和Kir 6.2/ SUR1亚型均无激活作用.结论 纳他卡林为Kir 6.1/ SUR2B亚型高选择性开放剂.
-
埃他卡林对KATP通道亚型选择性作用的研究
目的建立特异性表达以Kir6.x和SUR亚单位组成的不同KATP通道亚型的细胞模型,研究KATP通道开放剂埃他卡林对KATP通道亚型的选择性作用特点.方法利用脂质体转染的方法将编码KATP通道亚单位Kir6.x-pcDNA3、SUR-pcDNA3基因和编码绿色荧光蛋白pEGFP-N1基因共同转染到HEK-293细胞中,免疫组化法鉴定细胞上Kir6.x和SUR蛋白的表达,并采用膜片钳全细胞记录技术,以KATP通道特异性激动剂吡那地尔和二氮嗪为对照,分析埃他卡林对特定刺激条件下对Kir6.x和SUR共同转染的细胞上诱发的钾电流的影响,并观察KATP通道特异性拮抗剂格列苯脲的阻断作用.结果在共同转入KATP通道两亚单位基因的HEK-293细胞上,有Kir6.x和SUR蛋白的表达.在共同表达Kir6.1/SUR2B的细胞上,埃他卡林(100 μmol·L-1)、吡那地尔(100 μmol·L-1)及二氮嗪(200 μmol·L-1)均具有增强诱发电流的效应,给药前后-100 mV时电流值由(-88.0±30.8) pA 分别增至(-2042.6±127.3) pA,(-1431.9±142.4) pA 及(-1104.7±228.9) pA,三者的作用均能被格列苯脲所阻断.相同条件下,在共同表达Kir6.2/SUR2A的细胞上,埃他卡林和吡那地尔能增强诱发电流,此作用对格列苯脲敏感;而二氮嗪对该电流无影响.相反,在共同表达Kir6.2/SUR1的细胞上,二氮嗪能增强诱发电流,此作用对格列苯脲敏感;而埃他卡林和吡那地尔对该电流无影响.结论不同结构钾通道开放剂对不同亚型KATP通道作用不同,埃他卡林与吡那地尔作用相似,能选择性作用于Kir6.1/SUR2B和Kir6.2/SUR2A型KATP通道,对Kir6.2/SUR1型无影响.
-
依托咪酯对 HEK-293细胞中异源表达的 hERG 钾通道电流的抑制作用
目的：观察依托咪酯对HEK-293细胞中异源表达的hERG钾通道电流的抑制作用及其机制。方法：采用脂质体瞬时转染的方法将野生型hERG（WT-hERG）、突变型Y652A-hERG和F656C-hERG分别转染人胚胎肾细胞HEK-293，应用全细胞膜片钳技术记录依托咪酯对转染后HEK-293细胞表达的hERG钾通道电流的抑制作用以及对激活曲线和失活曲线的影响。结果：依托咪酯可浓度依赖性地抑制WT-hERG转染的HEK-293细胞钾通道电流，其半数大抑制浓度为（6．41±2．43）μmol／L，对激活曲线和失活曲线无明显影响。与WT-hERG转染的HEK-293细胞相比，依托咪酯对突变体Y652 A-hERG及F656 C-hERG转染的HEK-293细胞内钾通道电流的抑制作用减弱。结论：F656 C可能是依托咪酯抑制hERG钾通道的重要靶点。
-
含hITF启动子的荧光素酶报告质粒的构建及活性检测
目的 构建含有人肠三叶因子 (intestinal trefoil factor,hITF)启动子的荧光素酶表达载体,并检测启动子活性.方法 采用PCR 技术从LS-174T细胞基因组DNA中扩增出长约2.5 kb的含hITF基因启动子片段(-233 1/+53),而后在此基础上构建了10个不同长度的启动子序列至pGL-3 basic荧光素酶表达载体,然后将这些重组质粒转染HEK-293 细胞并在48 h后检测其荧光素酶活性.结果 插入的hITF启动子片段测序结果 显示正确,-500/+53,-400/+53和-300/+53片段活性介于0.023～0.026之间,-200/+53,-100/+53和-50/+53活性介于0.003 2～0.004 2之间,明确了小活性功能域位于-300/+53区域,-300/-200区域对hITF转录起始起关键性作用.结论 成功构建了含hITF启动子的萤火虫荧光素酶报告基因质粒, 鉴定出人肠三叶因子(hITF)启动子活性位于-300/-200区域.
关键词： 肠三叶因子 启动子 pGL-3 basic HEK-293细胞
