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  • 微载体和EGF在大鼠肝细胞体外培养中的作用

    作者:殷积彬;吕淑兰;岳蓓;李树臣;李明荣;王晓燕

    目的:寻找一种肝细胞在体外长期培养的方法.方法:在被覆poly-HEMA的培养瓶中进行肝细胞微载体悬浮培养,同时加入一定量的EGF,观察其对肝细胞的白蛋白、胆固醇合成分泌的影响,用倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态.结果:肝细胞在微载体和EGF的作用下能够存活1个月左右,同时保持白蛋白和胆固醇的合成分泌功能约12天.结论:EGF能增强肝细胞的生理功能,并延长其离体生存时间.微载体肝细胞数量大、功能强、便于移动,可用于肝病的研究与治疗,特别适用于人工肝.

  • 哺乳动物细胞灌注培养工艺研究进展

    作者:吕中华;李国军;王锐

    随着动物细胞培养技术的不断改进,灌注培养体系以其特有的优势取得了广泛的发展.本文依据不同灌注培养系统的特点划分分为微载体悬浮灌注培养、悬浮细胞截流灌注培养、流化床及固定床灌注培养等几类,并对各类型的灌注体系进行了概述.随着单克隆抗体药物产业的发展,带动了大规模动物细胞培养技术的不断提高.利用动物细胞生产单克隆抗体已成为当前生物制药的发展方向.在上世纪六十年代,灌注培养技术的出现为动物细胞大规模培养开辟了广阔的前景.

  • 新型生物人工肝反应器悬浮培养参数的优化测定

    作者:曹越;段梅梅;霍小林;吴昌哲;李明

    目的 对新型生物人工肝反应器进行参数的优化测定,以寻找更适合肝细胞生长的工作条件.方法 从实验和仿真两方面优化运行参数.通过调节生物反应器旋转速度、培养液流速,寻找能使细胞微载体均匀悬浮于反应器的合理运行参数.利用流体动力学仿真软件Fluent对新型生物反应器进行仿真,将仿真结果与实验结果进行对比得出合理工作范围.结果 生物反应器的旋转往复周期Z越大,反应器内细胞微载体达到均匀悬浮状态时所需的培养液流速就越大,即控制培养液流动的蠕动泵转速L越大.在确保细胞微载体均匀悬浮分布下,往复周期Z=0.5min时,没有合适的L值满足要求;往复周期Z=0.4min时,L的工作范围为120~160r/min;往复周期Z=0.3min时,L的工作范围为80~160r/min.结论 合理的运行参数优化了生物人工肝的工作方式,为动物实验及临床实验奠定了基础.

  • 平滑肌细胞在旋转生物反应器内的微载体培养与快速扩增

    作者:侯卫坪;郭希民;王常勇;叶本兰;赵强;段翠密;薄斌;范明;王永红

    为获取足够数量活性良好的膀胱平滑肌种子细胞, 本实验探索在旋转生物反应器内应用微载体技术快速扩增膀胱平滑肌细胞的方法.将培养的第二代新西兰兔膀胱平滑肌细胞应用Cytodex-3微载体在旋转生物反应器(RCCS)内进行动态培养,观测平滑肌细胞的生长情况和细胞代谢率,进行a-肌动蛋白免疫组化染色,并与常规方法培养平滑肌细胞进行比较.结果显示膀胱平滑肌细胞在Cytodex-3 微载体上生长迅速、细胞代谢率高、生长倍增时间缩短.在培养第九天,细胞数量可达初接种的23倍.免疫组化显示平滑肌细胞活性良好.结果表明利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增平滑肌细胞,可为构建组织工程化人造膀胱提供大量活性良好的平滑肌细胞.

  • 负载IGF-1的聚多巴胺改性PLGA多孔微载体的制备及对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响

    作者:付川;朱佳琦;白皓天;胡琦;王宇;白云深

    目的 探讨聚多巴胺改性聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)及负载胰岛素样生长因子1(IGF-1)后对材料性能和MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响.方法 乳化挥发法制备PLGA多孔微载体,使用聚多巴胺对微载体进行表面改性并负载IGF-1.采用扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱仪和接触角测试仪检测聚多巴胺改性前后PLGA多孔微载体的表面形貌结构、表面基团和亲水性,以溶菌酶为模型蛋白采用BCA法检测改性前后材料的蛋白吸附能力.PLGA微载体(PLGA组)、聚多巴胺改性PLGA微载体(PD-PLGA组)和负载IGF-1的聚多巴胺改性PLGA微载体(PD-PLGA/IGF-1组)分别与MC3T3-E1细胞共培养,采用MTT法、DIPI染色和碱性磷酸酶(ALP)活性测定观察PLGA多孔微载体聚多巴胺改性和负载IGF-1后对MC3T3-E1细胞增殖、黏附和成骨分化的影响.结果 扫描电子显微镜观察显示PLGA微载体表面呈多孔结构,红外光谱分析证明聚多巴胺成功附着在PLGA微载体表面.聚多巴胺改性后PLGA微载体亲水性能得到很大改善,表面蛋白吸附能力显著提高(均P<0.05).与MC3T3-E1细胞共培养7d后,PD-PLGA组和PD-PLGA/IGF-1组的细胞增殖率和ALP活性均显著高于PLGA组(均P<0.05).与MC3T3-E1细胞共培养3d后,DIPI染色显示PD-PLGA组和PD-PLGA/IGF-1组的贴壁细胞数均高于PLGA组.结论 PLGA多孔L微载体经聚多巴胺表面改性后其生物性能有很大程度的提高,负载IGF-1后能显著促进细胞增殖和成骨分化.

  • 微载体技术及其在机体损伤修复中的应用

    作者:付川;朱佳琦;白皓天;王宇;白云深

    利用微载体生物反应器获得足够数量的种子细胞一直是组织工程的研究热点。微载体技术较传统平面细胞培养方式具有许多优势,如在短期内能够提高细胞生长数量,简化了以往复杂繁琐的培养过程,大大节省了空间和人力,并且能为细胞生长提供一个更适宜的微环境。近年来,细胞微载体无论在材料种类、制备技术及生物医学应用等方面都获得了极大的进步。除了细胞扩增功能,生物降解微载体还可作为生物支架及药物载体应用于组织工程。将具有生物降解能力的微载体作为细胞和药物的运载工具将其输送至体内,为组织缺损提供了一种全新的治疗途径,因此被广泛应用于创伤修复治疗的研究中。本文就微载体材料、微载体的结构及改性、微载体技术在临床机体损伤修复中的应用等方面进行综述。

  • 转瓶培养与生物反应器微载体培养重组腺病毒的比较

    作者:郭海宁;张萍;韩继成;靖杰;曹亮;肖朋朋;解长占;李一权;马海彬

    目的 分别用3L转瓶和7L生物反应器微载体系统培养人胚胎肾细胞(HEK-293细胞)并接种H3型流感重组腺病毒,比较两种方法培养细胞及重组腺病毒的效果. 方法 分别用3L转瓶和7L生物反应器培养HEK-293细胞.转瓶每24 h取样,生物反应器每12 h取样,记录细胞总数.待细胞长满表面85%~90%时接种流感重组腺病毒,完全病变后收取病毒液并测定病毒滴度. 结果 转瓶培养HEK-293细胞3d,细胞增殖增加1.85~2.45倍,为(3.71~4.90)×107个[(2.95~3.90)×104 cells/ cm2],生物反应器培养3d,细胞增长4.72~5.00倍,为(132.15~140.09)×107个[(24.88~28.72)×104 cells/cm2].转瓶培养重组腺病毒滴度为6.85 TCID50/ml,生物反应器微载体系统培养腺病毒滴度为7.200 TCID50/ml. 结论 生物反应器微载体系统培养流感重组腺病毒数量和滴度均高于转瓶培养,不但提高了疫苗的产量,还减少了细胞分泌物的残留,增强了疫苗接种的安全性.

  • 大孔明胶微载体的制备及肝细胞附着生长的研究

    作者:徐涛;李少林;陈家童;俞耀庭

    急性肝功能衰竭是一种致死率非常高(>60%)的疾病[1,2].人们仿照人工肾的原理,研制了许多化学吸附材料.然而由于肝脏高度复杂的代谢功能,简单应用现存的血液灌流技术在临床上效果不够理想.生物人工肝支持系统是以培养的肝细胞为主要材料,它不同于以往的化学吸附材料,具有生物合成和解毒两种功能,被认为是治疗肝衰的一种有效方法,因此成为国际上的一个研究热点[3].因为肝细胞是一种贴壁依赖性细胞,在人工肝的研究工作中提高肝细胞的培养密度是一个难题.利用微载体较大的比表面积可以提高肝细胞培养密度,但是已开发的微载体价格大多昂贵,性能也不够理想.本文利用水溶性蛋白明胶制备了一种微载体,使用它进行大鼠肝细胞的培养,并对肝细胞的代谢活性进行了测定.

  • 成骨细胞在旋转壁式生物反应器内的大规模扩增

    作者:宋克东;刘天庆;崔占峰;李香琴;葛丹;孙相玉;马学虎

    目的进行SD大鼠成骨细胞在旋转壁式生物反应器内大规模扩增培养的研究.方法利用微载体悬浮培养法在旋转壁式生物反应器内大规模扩增成骨细胞,检测其组织形态和生物功能后.作为接种到支架材料上并于反应器内三维环境中培养组织工程骨的种子细胞.结果成骨细胞在生物反应器中每代可以扩增十倍以上,同时经过倒置相差显微镜、SEM(扫描电镜)以及ALP(碱性磷酸酶)和MTT等生物学性能检测后,发现在旋转壁式生物反应器中三维培养的成骨细胞各种生物指标性能良好.结论新型旋转壁式生物反应器可以提供低剪切力的培养环境,而且细胞之间有三维联系的机会,成骨细胞表现出良好的体外扩增能力,适于建立一种理想的成骨细胞体外扩增的三维培养体系.

  • 微载体悬浮培养成人骨髓间充质干细胞

    作者:吴清法;吴祖泽;董波;王立生

    本研究采用微载体旋转培养系统和常规静止培养系统对成人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养进行比较.MSC是贴壁依赖性细胞,旋转培养系统采用CultiSpher G大孔微载体,浓度为1g/L,常规静止培养在12孔培养板中进行.两系统细胞接种密度均为5×104cells/ml.结果:旋转培养7天后达到大活细胞密度5.150×105 cells/ml,常规静止培养第5天就达到大活细胞密度1.675×105cells/ml.在微载体旋转培养中生成乳酸12.06 mmol/L,而常规静止培养中生成乳酸13.10 mmol/L,葡萄糖消耗分别为7.38 mmol/L和5.37 mmol/L.在微载体旋转培养中平均乳酸产率为1.63,远低于常规静止培养的平均乳酸产率2.44.这些表明,在微载体悬浮培养条件下,MSC生长更为旺盛,细胞产量更高,葡萄糖消耗和能量利用率优于常规静止培养.微载体悬浮培养12天后,MSC依然保持其干细胞特性.结论:微载体培养系统是扩增组织工程种子细胞的有效方法.

  • Vero细胞微载体放大培养技术研究

    作者:毕军;王强;孙文

    目前,国内大部分疫苗企业仍采用传统的转瓶细胞培养工艺来生产病毒性疫苗,该方法存在细胞密度低、病毒滴度低、劳动强度大等缺点。20世纪70年代,建立了微载体/生物反应器培养动物细胞的工艺[1],把悬浮培养和贴壁培养两种培养工艺融合在一起,兼有两者的优点,使得动物细胞工业化的大规模、高密度培养,以满足生物技术发展的需要,而细胞微载体放大培养就是其中的关键技术之一[2]。

  • 原代小型猪肝细胞微载体培养及其功能特性

    作者:李保森;邹正升;王敏;游绍莉;辛绍杰;王福生;刘敬超;赵军

    目的研究原代小型猪肝细胞微载体培养方法的建立及肝细胞功能特性.方法将3.20×107个的肝细胞及2g/L cytodexTM 3微载体连同40ml含100ml/L Hyclone小牛血清及其他辅助因子的RPMI 1640培养基加入250ml已硅化的方瓶中培养.对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察.同时测定不同培养时期肝细胞生物合成及生物转化功能.结果肝细胞产量为6.8×109~8.1×109(7.58±0.57)×109/肝细胞;肝细胞活率为92.0%~99.0%(96.25%±3.10%);肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;接种培养后肝细胞呈明显的朝CytodexTM 3聚集,二者易相粘贴,粘附在微载体上的肝细胞增殖生长旺盛;当肝细胞数为3.20×107个时,接种后24h肝细胞尿素及白蛋白合成量分别为1.22mmol/L及0.075g/L;随着时间的延长,利多卡因的转化率逐渐增加,在24h时即达到100%.结论使用微载体培养的小型猪肝细胞具有较旺盛的增殖生长能力、良好的生物转化及生物合成功能,可作为体外生物人工肝较为理想的细胞来源.

  • 生物反应器培养间充质干细胞的研究现状

    作者:余慧;黄红云;陈琳;王洪美

    间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在一定条件下进行体外培养和诱导分化,能向神经、成骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和心肌等细胞方向分化,是修复再生医学重要的种子细胞.虽然MSCs 取材方便,易于培养[1-3] ,但因基础研究和临床应用MSCs 需求量逐渐增大,传统培养方法已不能满足治疗所需用量,生物反应器培养系统则显现出巨大的优势.在生物反应器的悬浮液中培养MSCs,可以模拟体内微环境,微载体又给细胞提供更大贴壁面积,促进细胞大量增殖.

  • 转壁反应器三维立体培养多样本骨髓间充质干细胞实验研究

    作者:吕昌伟;胡蕴玉;白建萍;吕荣

    目的 探讨微载体三维立体培养自体骨髓间充质干细胞(MSC)方法.方法 制备明胶多孔微载体,反应器内培养多样本自体MSC,比较其与普通培养的差异,研究生长曲线、粘附曲线、活力变化、糖消耗情况、蛋白合成以及碱性成纤维细胞生长因子影响.结果 相转化法制备直径180~300um/孔径40~70um微载体.在合适的培养参数下,三维培养显著优于普通培养,细胞增殖迅速,糖消耗较快,蛋白产量无显著差异,碱性成纤维细胞生长因子可抑制三维培养的细胞传代老化.结论 相转化法可有效制备多孔微载体,微载体三维立体培养自体MSC是获取组织工程种子细胞的有效方案.

  • 骨组织支架的新进展

    作者:朱威;王英杰;马琦;吴国梁;翁习生

    由于人口老龄化的加剧和社会人口年龄中位数的增加,骨科疾病引起了广泛的关注.移植骨是用于修复骨缺损的良好材料,但是有二次手术及骨量来源等诸多限制.而广泛应用于临床的骨植入物虽然在一定程度上提供了植入部位所需的机械强度、耐摩擦等性能,但由于其生物惰性,骨组织的生成不足,无法与骨组织形成紧密的骨性结合,导致不可避免的骨植入物松动.为了克服这些困难,现在的支架通常是多孔的、复合的.本文从多孔支架、微载体、植入物表面理化性质,植入物复合无机离子、细胞因子、干细胞等方面阐述新型支架内的组织生成.

  • 退变腰椎间盘髓核细胞立体培养与单层培养的生物活性比较

    作者:刘勇;胡有谷;宁斌

    目的:比较体外单层培养和旋转微载体立体培养人退变腰椎间盘髓核细胞的生物学活性指标,探讨更加有效的椎间盘髓核细胞体外培养方法.方法:对获取的腰椎间盘突出症患者的24个椎间盘按年龄分为A组(20~25 岁)、B组(26~30 岁)、C组(36~45 岁)及D组(>45岁),分别利用酶消化法进行单层细胞培养和旋转微载体立体培养系统进行立体培养,观察细胞生长形态,检测细胞生长曲线及速度、细胞生长活性、细胞分裂指数及胶原含量.结果:单层培养的髓核细胞贴壁后为多角形或梭形,伸出伪足;立体培养的细胞在微载体上呈梭形或不规则形,呈立体状生长.立体培养的细胞生长速度较快,1周内两种培养方法各时间点及各组间比较均具有统计学意义(P<0.05).立体培养的髓核细胞活性提高,随年龄增加细胞活性下降;指数生长期细胞分裂指数与单层培养相比有统计学意义(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ型胶原含量与单层培养相比有统计学意义(P<0.05),A组分别与B组、C组及D组比较均有统计学意义(P<0.05).结论:旋转立体培养人退变椎间盘髓核细胞的活性保持良好,较单层培养能够大量、优质收集种子细胞,可用于椎间盘组织工程中种子细胞的研究.

  • 微载体培养人肝细胞系作为人工肝生物材料的研究

    作者:高毅;徐小平;杨继震

    目的为提高人肝细胞系的培养效率和细胞获取数量.方法本研究采用微载体细胞培养技术进行了人肝细胞系CL-1的高密度培养,动态观察细胞生长,检测肝细胞特异性功能变化.结果 CL-1在微载体Cytodex-3上生长良好,于培养的第7天达到高峰,细胞数量为2.13×108/100 ml,白蛋白合成量71.23 μg/100 ml,尿素合成量23.32mg/100 ml,安定转化量619.7 μg/100 ml.与CL-1普通培养结果比较,细胞产量是普通培养的49.3倍,而白蛋白合成量、尿素合成量及安定转化量则分别是普通培养的39.8倍、41.6倍和33.3倍.结论微载体培养CL-1可提高培养效率和细胞数量,且具有较好的功能,微载体高密度培养CL-1可作为组合型人工肝的生物材料.

  • 混合型生物人工肝的构建与体外功能评估

    作者:高森;张云峰;周焕城;郭颖;高毅

    目的 设计一种新型混合型生物人工肝(HBAL),通过对模拟肝衰竭血清的净化作用评价其疗效,探讨其临床应用的可行性.方法 选用中国人肝细胞系-1(CL-1)作为肝细胞供体.在微重力环境下,肝细胞微载体共培养5d,细胞总量约4.0×109个,细胞密度约为4.0×107/ml.然后将其在无菌环境下灌入自制生物反应器中,制成生物部分.非生物部分采用血液灌流+胆红素吸附.生物部分和非生物部分通过两套聚乙烯胶管构成一个封闭的环路.监测模拟肝衰竭血清中未结合胆红素(UBD)、鹅去氧胆酸(CDCD)、胆酸(CA)、血氨(AA)经过混合型生物人工肝循环后浓度的变化以及生物反应器中肝细胞功能、形态及肝细胞活性的变化.结果 在整个治疗过程中,循环后24 h,模拟肝衰竭血清中UBD、CDCD、CA和AA的浓度分别从(335.3±6.0)μmol/L、(395.0±5.6) μmol/L、(155.7±4.5)μmol/L、(39.0±2.6)μmol/L降至(106.0±10.9)μmol/L、(131.8±28.7) μmol/L、(42.2±7.3)μmoL/L、(3.5±1.0).μmol/L,与0h比较差异有统计学意义(P<0.05);24 h后浓度下降趋于平稳;循环48 h后,CL-1细胞功能发生变化,生物反应器中模拟肝衰竭血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)分别从(25.9±4.2)IU/L、(22.0±3.6) IU/L、(0.28±0.09) μmol/L升高至(31.0±2.6) IU/L、(31.6±8.0) IU/L、(0.41±0.12)μmoL/L,与0h比较差异有统计学意义(P<0.05).反应器中肝细胞的数量和活力在循环48 h后亦显著下降(P<0.05).结论 (1)我们构建了一种新型灌流型生物反应器.在这种生物反应器中CL-1细胞能保持较高的活性和良好的功能.(2)新型混合生物型人肝可以显著降低模拟肝衰竭血清中的UBD、CDCD、CA、AA浓度,具有清除这些毒性物质的功能,提示其具有明显的肝功能支持作用.

  • 微载体培养人肝细胞在混合型生物人工肝系统上的应用

    作者:陈燕凌;唐南洪;王晓茜;李秀金;杨焕星;殷凤峙

    目的探讨微载体培养L-02人肝细胞株应用于混合型生物人工肝系统(HBLS)及其治疗实验效果.方法采用微载体Cytodex 3培养人肝细胞,经简易体外灌流实验后装配成HBLS,用于治疗急性肝衰犬;观察模型犬的临床体征、生存时间、生化指标以及死亡后各脏器的病理检查.结果 HBLS治疗组和对照组的平均生存时间分别为(7.9±2.3) h和(3.4±1.4) h,差异具有显著性(P<0.05);空舱对照组生化指标呈现进行性恶化趋势,而HBLS组治疗过程中,FBI上升,TBIL、ALT、AST、LDH、PT指标呈下降趋势;肝组织的病理显示治疗组较对照组肝细胞变性坏死程度减轻.结论微载体培养L-02人肝细胞株成功应用于HBLS,能改善急性肝衰犬的状态,延长生命,具有一定的安全性和有效性.

  • 生物人工肝支持系统生物反应器的建立及体外转流试验

    作者:陈燕凌;殷凤峙;唐南洪;王小茜;杨焕星;李秀金

    目的探讨由微载体培养的L-02人肝细胞和中空纤维舱构成的生物反应器的生物效能.方法采用微载体培养高浓度L-02人肝细胞,同时使用中空纤维型生物反应器和血泵等共同构成生物人工肝系统.在体外转流试验中观察循环液中游离胆红素、葡萄糖、白蛋白、谷草转氨酶浓度的变化以及实验对肝细胞的影响等.结果 L-02肝细胞能很好地粘附于cytodex 3微载体上形成微载体诱导的肝细胞聚集体;移入生物反应器内进行体外循环,4 h后可见循环液中游离胆红素和葡萄糖浓度显著降低,分别为27.1μmol/L和1.75 ninol/L;白蛋白含量明显增加,为15.21 mg/L;肝细胞仍有较高活力达75%.结论本实验所建立的生物反应器作为生物人工肝系统的核心组件具备一定的生物合成和解毒代谢功能,为进一步建立混合型生物人工肝支持系统奠定了基础.

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