首页 > 文献资料
-
RNAi技术用于丙型肝炎治疗的研究进展
1989年,美国学者Choc等用分子克隆技术获得了丙型肝炎病毒(HCV)的基因克隆并为其命名.如今,HCV感染引起的丙型肝炎由于流行性强,危害性大,已经引起了人们越来越多的重视.全球感染HCV的人数有1.7亿之多,各国感染率在0.1%～10%,感染后80%～85%的患者转为慢性感染,由于多数无明显症状,不易早期诊断和治疗,致使患者病情缓慢加重,甚至导致肝硬化、肝癌等严重疾病.目前对于丙型肝炎抗病毒治疗主要是用干扰素药物,但其效果均不甚理想.
-
RNA干扰抗人单股正链RNA病毒感染的研究进展
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一种新兴的高效基因沉默工具,用于研究基因功能与基因表达调控领域,特异性地降低或关闭目的基因表达.近年来,针对病毒感染性疾病,尚无特别有效的防治方法.目前RNAi技术被广泛应用于抗病毒感染领域的研究,几种以RNAi为基础的抗病毒疗法目前正在进行不同时期的临床试验[1],有望成为抗病毒感染基因治疗的有效工具.
-
抑制聚ADP核糖聚合酶1活性的短发夹RNA载体构建
目的构建抑制人聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)活性的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体.方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向hPARP1基因的寡核苷酸,各69对碱基,退火,然后利用BamHⅡ及EcoRⅠ与pSIREN-RetroQ载体连接.用EcoRⅠ及BglⅡ切取其中U6启动子及下游的shRNA部分,与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-shRNA载体.结果重组构建的pEGFP-C1P1、pEGFP-C1P2、pEGFP-C1N载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明330个碱基成功插入到预计位点.结论载体的成功构建,为进一步研究聚ADP-核糖聚合酶在DNA修复过程中的功能打下基础.
-
ERK信号转导通路在CdCl2诱导HEK293细胞低剂量兴奋效应中的作用
目的 探讨ERK信号转导通路在CdCl2诱导HEK293细胞低剂量兴奋效应过程中的作用.方法 以0、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50和500μmol/L浓度的氯化镉(CdCl2)分别染毒HEK293细胞12h和24h;在染毒前分别用ERK1/2抑制剂PD98059(100μmol/L)、U0126(25μmol/L)和c-raf shRNA对细胞进行预处理.采用MTT、WST-8法测定细胞增殖情况,采用western blot检测ERK、c-raf磷酸化蛋白表达水平,采用RT-PCR检测c-fos、c-myc、c-raf基因表达水平.结果 CdCl2作用于HEK293细胞后,CdCl2浓度为0.5(12h)、0.05μmol/L(24h)时可引起细胞增殖明显增加(P＜0.05),浓度为50、500μmol/L时可引起细胞增殖明显减少(P＜0.05);应用ERK通路抑制剂和c-raf shRNA对细胞进行预处理后,未观察到细胞增殖明显增加.CdCl2作用于HEK293细胞3h、6h、12h后,c-fos基因转录水平在CdCl2浓度为0.5μmol/L时明显增高(P＜0.05),c-myc基因转录水平随CdCl2浓度的升高而增高,浓度为5、50μmol/L时增高明显(P＜0.05),pERK蛋白表达无明显变化(P＞0.05).结论 0.5(12h)和0.05μmol/L(24h)CdCl2作用于HEK293细胞可以引起Horme8is效应,ERK信号转导通路中c-fos基因的表达变化在此过程中可能发挥重要作用.
-
丹参植株原位侵染RNAi毛状根体系的建立及其干扰效果
目的:利用土培植物进行原位侵染获得RNAi型丹参毛状根,并对其干扰效果进行研究.方法:利用转化有目标基因RNAi载体的发根农杆菌对土壤中生长的丹参幼苗根茎部分进行侵染产生毛状根,经荧光显微镜鉴定阳性毛状根,并利用实时荧光定量PCR检测目标基因的表达情况.结果:在土培丹参根茎部分成功侵染产生毛状根,利用荧光显微镜进行检测显示目标基因RNAi型毛状根阳性转化率为72.72%,RNAi空载毛状根阳性转化率为66.67%.实时荧光定量PCR结果表明RNAi型毛状根中目标基因表达受到抑制,表达量下降到空载型对照组的8.61%,证明对土培植物直接进行侵染能够成功诱导RNAi毛状根.结论:采用原位侵染法诱导丹参根茎部位成功产生阳性RNAi型毛状根,侵染过程无需无菌操作,简单快捷,对植株生长无影响,能够用于功能基因的体内功能研究.
-
RNA干扰作用机制及其在中医药研究中的应用前景
RNA干扰首先由Su Guo博士于1995年在秀丽新小杆线虫体内发现,而后发现这一现象广泛存在于自然界各级生物体当中.RNAi作用机制涉及siRNAs及miRNAs的产生、RISC的装配、RISC的功能三个过程从而沉默目的基因的表达.在中医药研究中,RNAi这一复杂现象的作用机制完全可以用中医理论的阴阳学说来解释,而且它在证候-基因组研究、中药作用的靶标或阐明中药的作用机制、中药的毒性研究等方面都有重要的应用前景.
-
利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体
NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应,利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体,以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能.根据Gateway技术要求,设计含有attB接头的引物,使用NEB的Phusion超保真聚合酶,通过PCR方法,扩增SmNAC1基因的特异性片段.通过BP重组反应,将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上,再通过LR重组反应,利用入门载体上的SmNACi特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上.实验结果表明Gateway载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上,为植物基因转化提供基础.
-
丹参酮生物合成途径CYP76AH1基因RNA干扰体系的建立及干扰效果研究
丹参酮类化合物多属于二萜类化合物,是药用植物丹参的主要活性成分之一,在植物体内的生物合成需要多个基因的参与.CYP76AH1是丹参酮生物合成途径的第一个P450基因,前期的酵母表达以及体外酶促反应已经验证了其体外功能.为了对该基因的功能进行进一步研究,该文构建了该基因的丹参毛状根RNA干扰体系:通过Gateway技术构建能形成具有目标基因发卡结构的RNA干扰载体,转化发根农杆菌,转染丹参叶片,将干扰片段整合至丹参基因组中,获得了高效干扰的CYP76AH1干扰型丹参毛状根.
-
RNA干扰在柯萨奇病毒致心肌炎小鼠模型中的抗病毒研究
为了研究慢病毒介导的shRNA(Short hairpin RNA,shRNA)在柯萨奇B组3型病毒(Coxsackievirus B3,CVB3)导致的心肌炎小鼠模型中的抗病毒作用,合成针对CVB3基因组3753～3771区域的慢病毒Lenti-sh3753,感染HeLa细胞后感染CVB3病毒,通过荧光显微镜观测shRNA的表达和病毒致细胞病变效应,并测定培养上清中的病毒滴度,将慢病毒Lenti-sh3753感染BALB/c小鼠后感染CVB3病毒,观察小鼠的存活率,心脏组织中的病毒滴度和病理变化.结果发现Lenti-sh3753能在HeLa细胞中表达shRNA,并能有效抑制细胞中病毒RNA的复制.在小鼠模型上,Lenti-sh3753能提高小鼠的存活率,降低心脏中的病毒含量,从而减轻病理反应.这些结果提示,Lenti-sh3753在细胞和动物模型中能针对性地降解CVB3病毒RNA,明显降低病毒滴度,有效控制病毒感染.
-
细胞水平狂犬病病毒感染的RNA干扰
以质粒pSilencer2.1-U6 Hygro为基础,设计并构建了针对狂犬病病毒(RV)糖蛋白和核蛋白mRNA的共9个siRNA表达载体,转染BHK-21细胞系后,在潮霉素-B的筛选压力下,获得9个稳定转录相关siRNA的BHK-21细胞株.1000TCID50的RV分别感染24孔板内的上述9株细胞,48h后以直接免疫荧光法检测各株细胞上RV的增殖,结果显示,在经不同siRNA表达载体转染的BHK-21细胞中,RV增殖水平有不同程度下降,RV增殖水平低者为对照细胞的1%,即RNA干扰效应高可阻断99%RV的感染.针对其中阻断水平超过90%的靶序列G69和N19,人工合成其双链siRNA,瞬时转染BHK-21细胞后,仍可达到80%以上的感染阻断率.本试验为有效阻断RV早期感染提供了新选择,为通过RNAi研究RV的基因组功能提供了新的依据.
-
针对2B区域的短双链RNA抑制柯萨奇B3病毒感染HeLa细胞的特性研究
为了研究短双链RNA(Small interfering RNA,siRNA)对柯萨奇B组3型病毒(CVB3)复制的影响及其作用特性,合成针对CVB3基因组2B区的siRNA-2B,脂质体法转染HeLa细胞后感染CVB3病毒,观测转染效率及存留时间、毒性作用、病毒致细胞病变效应、病毒滴度、病毒RNA含量、siRNA-2B对重组基因的特异性降解及培养上清有限稀释后再感染情况.结果发现siRNA-2B能高效转染入HeLa细胞并存留长达48h,高剂量的siRNA-2B对培养细胞无明显毒性,siRNA-2B能特异性针对2B区有效地降解病毒RNA,能明显抑制病毒RNA的复制.随着转染浓度的增加,siRNA-2B的抗病毒作用逐渐增强.siRNA-2B还能明显降低CVB3的再感染能力.这些结果提示,针对基因组2B区的siRNA-2B可以明显抑制CVB3基因复制,有效控制病毒再感染,并具有高效性、特异性和量效关系等特点.为siRNA可能成为预防和治疗CVB3感染的新途径奠定基础.
-
基于PPARα基因为靶序列的RNA干涉作用
目的利用RNAi技术研究PPARα基因表达对骨骼肌脂代谢相关基因的表达的影响.方法设计合成针对过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体α(PPARα)的dsRNA并将其转染到鼠骨骼肌C2C12细胞中,用RT-PCR测定PPARα及其应激基因mRNA水平的变化.结果dsRNA浓度的升高和PPARα mRNA水平的降低之间存在剂量线性关系.PPARα应激基因(包括乙酰辅酶A氧化酶:AGO;长链脂酞辅酶A合成酶:LCAS;脂蛋白脂肪酶:LPL;LDL受体)mRNA水平也随之降低,进一步证明PPARα RNAi可以特异性的降低PPARα mRNA水平.然而PPARγ和PPARδmRNA水平不受影响,而且PPARα RNAi不能降低GAPDH mRNA和18s rRNA水平,说明PPARα RNAi并不诱导一般mRNA的降解.结论PPARα RNAi能够特异性的降低骨骼肌细胞中PPARα及其应激基因的mRNA水平.
-
干扰REV3L基因表达逆转结肠癌的耐药性
目的 探讨跨损伤DNA合成途径(TLS)关键基因REV3L的靶向下调对人耐药结肠癌细胞系耐药性的逆转作用.方法 用RNA干扰技术(RNAi)沉默REV3L基因在人耐奥沙利铂结肠癌细胞系(THC8307/L-OHP)中的表达,以实时荧光定量PCR和免疫细胞化学检测REV3L基因mRNA及蛋白均低表达的细胞作为实验组.运用四甲基噻唑蓝(MTT)、流式细胞术和细胞形态学的方法检测肿瘤细胞耐药系数变化、耐药性相对逆转率及细胞凋亡的情况.结果 转染mU6pro-siREV3质粒的实验组细胞REV3L基因的表达被成功抑制.基因低表达的细胞耐药系数明显低于空白对照组和阴性对照组,相对耐药逆转率显著高于阴性对照组(P＜0.05).细胞凋亡指标显示实验组细胞凋亡率显著高于两对照组(P＜0.05).结论 下调REV3L基因的表达,可逆转入结肠癌细胞的耐药性并促进细胞凋亡,REV3L可以作为肿瘤基因治疗的潜在靶点.
-
RNA干扰组蛋白去乙酰化酶4诱导骨肉瘤细胞凋亡
目的 探讨沉默组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)对骨肉瘤细胞HOS,U20S生物学行为的影响.方法 用脂质体瞬时转染法将化学合成HDAC4-siRNA转染至骨肉瘤HOS及U20S细胞中,实时荧光定量PCR(q-PCR)法检测细胞中HDAC4mRNA的表达;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞HDAC4及其下游基因HIF-1α的蛋白表达;CCK-8法检测细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡;Transwell小室法检测细胞的侵袭能力.结果 转染后HOS及U20S细胞中HDAC4 mRNA表达明显降低(P＜0.01).沉默HDAC4后HOS细胞早期凋亡率为(16.8±2.1)％,较si-control组(10.2±2.5)％明显增加(P ＜0.05);U2OS细胞早期凋亡率为(21.4±3.1)％,较si-control组(12.5±2.3)％明显增加(P＜0.05);HOS细胞si-con组及si-HDAC4组细胞的穿膜细胞数分别为(146 ±34)个、(45±20)个,U2OS细胞为(207±35)个、(121±23)个,分别显著低于si-con组(P＜0.05).si-HDAC4能够明显降低HDAC4以及下游基因HIF-1 α的表达.结论 针对HDAC4基因的特异性RNA小干扰片段能够下调HDAC4mRNA及蛋白的表达,并抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭,诱导细胞凋亡.
-
Dicer蛋白在RNA干涉中的作用研究进展
近年来,对功能基因组的研究使人们对基因功能的认识不断深入.后基因时代的来临,又使基因功能研究备受瞩目.RNA干涉对基因表达的抑制为我们提供了新的研究工具.RNA干涉(RNAi)是将双链RNA(dsRNA)导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程.它是转录后基因沉寂(PTGS)的一种.本文简要介绍RNAi的发生机制及该过程中重要分子Dicer的研究进展.
-
Myosin Va RNAi慢病毒载体的构建及对肺癌PG细胞运动和迁移能力的影响
目的 构建人非常规肌球蛋白myosin Va基因RNAi慢病毒载体,并探讨其对人肺巨细胞癌PG细胞运动和迁移能力的影响. 方法 针对已经筛选确定的myosin Va基因RNAi有效靶序列,合成靶序列及其阴性对照的寡聚DNA,并连接到pSuper载体获得中间实验质粒pSuper-shM5A及阴性对照pSuper-shCON;然后将H1 promoter-shM5A/shCON表达框重组到慢病毒载体plenti4上,分别得到plenti4-H1-shM5A和shCON 载体,并进行慢病毒包装.随后用病毒上清感染PG细胞,并筛选出zeocin抗性的稳定细胞系PG-shM5A和shCON.通过RT-PCR方法检测PG-shM5A和shCON细胞的myosin Va mRNA表达水平;用创伤愈合和Boyden小室实验测定PG-shM5A和shCON细胞的运动和迁移能力. 结果 限制性内切酶酶切和测序证实,成功构建myosin Va RNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A.慢病毒包装成功后,感染PG细胞并获得zeocin抗性的细胞;用RT-PCR方法证明,myosin Va mRNA被抑制70%以上.创伤愈合和Boyden小室实验表明,感染携带myosin Va RNAi慢病毒的PG细胞运动和迁移能力显著下调. 结论 成功构建myosin Va RNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A,它能有效抑制人肺巨细胞癌PG细胞的myosin Va表达并降低其运动和迁移能力,初步揭示了myosin Va与肿瘤细胞恶性行为的相关性.
-
siRNA抑制SK-BR-3细胞株Her2/neu的表达及细胞增殖
目的研究siRNA(small interfering RNA)对乳腺癌SK-BR-3细胞株Her2/neu基因表达的抑制作用,为RNAi技术在肿瘤生物治疗中的应用提供实验基础.方法体外合成两条针对Her2/neu基因的siRNA,转染SKBR-3细胞株;分别应用逆转录聚合酶连反应(RT-PCR)法和流式细胞仪测定Her2/neu基因和蛋白的表达,并用MTT比色法测定细胞的增殖活性,Annexin V检测细胞凋亡. 结果两条siRNA分别使Her2/neu基因表达降低了42.88%、49.27%,蛋白表达降低了25.03%、56.59%.同时转染siRNA后细胞生长受到抑制,并发生细胞凋亡,凋亡率分别为28.51%、42.81%.结论siRNA可以有效抑制SK-BR-3细胞株中Her2/neu的表达,从而抑制细胞生长,并导致细胞凋亡.
-
RNA干扰号慢性疼痛的基因治疗
RNA干扰(RNA interference,BNAi)是1998年Fire等[1]首次发现并命名的,是由双链RNA(dsRNA)分子在细胞内特异性诱导与之同源mRNA降解或翻译抑制,导致基因沉默的现象,是一种典型的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS).RNAi主要的功能特点是其可以调节和关闭基因的表达,进而调控细胞的各种高级生命活动.RNAi技术已经成为模式生物、基因功能、基因治疗等研究领域中有力的工具,本文仅就RNAi在慢性疼痛研究中的进展作-介绍.
-
弓形虫表面抗原SAG3基因表达干扰体系的建立
目的 建立弓形虫SAG3基因RNAi体系,为近一步研究SAG3的功能奠定基础. 方法 以弓形虫SAG3基因3′-UTR区及CDS区为靶目标体外转录合成dsRNAs,通过电转法化将其分别导入弓形虫速殖子体内,用转染后的弓形虫感染 SMMC7721细胞,半定量RT-PCR分析鉴定RNAi效果. 结果 分别于转染12、24和48 h后,RT-PCR检测SAG3基因 mRNA,显示dsRNA转染组SAG3 mRNA水平明显低于未转染dsRNA的空白对照组和阴性对照组.其中以电压0.4 kV,时间延迟为9 ms的3′UTR dsRNA转染组效果好.转染12 h后,即有较明显的干扰效果.转染24 h后,干扰效果为显著. 结论 筛选出了可以有效抑制弓形虫SAG3基因的dsRNA序列,初步确定了RNAi发生及持续时间,为进一步研究SAG3基因功能奠定了基础.
-
RNAi阻断pax5基因的表达对B系恶性淋巴瘤细胞生物学特性的影响
本研究目的在于了解pax5基因对B系血液肿瘤细胞的免疫表型、细胞增殖及凋亡等生物学特性的影响.应用体外转录RNAi方法合成pax5特异的shRNA,用实时荧光定量PCR和Western blot技术评价基因沉默效果、筛选有效的shRNA,利用流式细胞术、MTT实验以及real-time PCR等技术检测沉默前后细胞免疫表型、增殖、凋亡等变化.结果表明:应用体外转录RNAi方法合成的shRNA抑制了B系恶性淋巴瘤细胞株中pax5在mRNA和蛋白水平的表达;pax5阻断表达后的淋巴瘤细胞免疫表型发生了变化,信号分子CD19的mRNA和蛋白表达水平均相应降低,而细胞膜表面分子IgM未发生明显改变;pax5的沉默表达对淋巴瘤细胞增殖效率和凋亡的影响无显著性差异(p＞0.05).结论:pax5基因对B细胞的晚期分化起着重要作用,pax5基因可能参与淋巴瘤细胞的信号转导,未检测到pax5瞬时缺失表达对淋巴瘤细胞生长增殖及凋亡的影响,对其机制有必要进一步深入研究.
