首页 > 文献资料
-
RNAi新研究概况
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种沉默靶基因活动的过程,它可以在转录水平、转录后水平对基因的沉默发挥作用.RNAi在基因功能研究和对肿瘤、病毒性疾病、心脑血管疾病及其他的遗传病治疗方面展现了巨大的潜力.近年的新研究成果让人们对RNAi的作用机制和疾病治疗方面的应用以及存在的缺陷有了更深认识,促使人们更好的利用RNAi.
-
利用不同方法检测RNAi抑制人pescadillo基因的表达
目的:构建人pescadillo(PES1)基因siRNA的真核表达载体,观察其对PES1表达的影响.方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对PES1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上.分别用以下3种方法检测RNAi的抑制效果:(1)将RNAi重组质粒和带FLAG标签的PES1共转染293T人胚肾细胞,用FLAG抗体进行Western blot;(2)将RNAi重组质粒和带GFP标签的PES1共转染293T细胞,用荧光显微镜观察GFP的亮度;(3)在293T细胞中仅转染小干扰RNA(siRNA)重组质粒,用PES1抗体进行Western blot分析.结果:测序证明,成功构建了PES1 siRNA真核表达载体.通过Western blot实验证明,构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性PES1基因表达;荧光显微镜检查发现siRNA能明显减弱细胞中荧光强度,抑制PES1的表达.结论:成功地构建了PES1 siRNA的真核表达载体,利用3种不同方法均证明该siRNA能有效地抑制PES1基因的表达.
关键词： pescadillo RNAi 基因表达 -
凋亡抑制基因Survivin siRNA真核表达载体的构建
目的 构建靶向survivin siRNA真核表达栽体,通过RNA干扰技术阻断survivin基因表达.方法 针对目的基因survivin序列设计双链DNA(dsDNA),采用DNA重组技术与载体连接,转化感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子.结果 重组质粒经酶切、测序鉴定,证实插入载体目的基因片段大小与插入方向正确,符合其物理图谱.结论 靶向survivin siRNA真核表达载体可用于转染肿瘤细胞,阻断survivin基因表达并诱导细胞凋亡的RNAi实验研究,为肿瘤的基因治疗提供一种新的方法.
-
RNA干扰技术及其在乳腺癌研究中的应用
RNA干扰(RNA interference,RNAi)也称转录后的基因沉默(post-transcriptional-gene silencillg,PTGS),是指将外源性或内源性双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)导人细胞后引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解,其相应的基因受到抑制.它是一种强有效的基因沉默工具.
-
应用siRNA抑制由醛固酮诱导的大鼠肥大心肌细胞中钙调神经磷酸酶AβmRNA的表达
目的:本研究通过应用RNA干扰的方法,观察了钙调神经磷酸酶(CaN)在醛固酮(Ald)诱导的大鼠心肌细胞肥大时其Aβ mRNA表达水平.方法:在Ald诱导心肌细胞肥大模型上同时转染CaN Aβ mRNA靶标siRNA及其阴性对照进行转染.通过免疫荧光染色及RT-PCR方法检测CaN Aβ蛋白及mRNA的表达,同时测定心肌细胞面积变化.结果:Ald组CaN Aβ mRNA表达较对照组显著升高,细胞表面积显著增加;CaN AβmRNA靶标siRNA组细胞浆中绿色荧光表达比siRNA阴性对照组少,即CaN蛋白表达量siRNA组较siRNA阴性对照组减少,RT-PCR检测结果显示siRNA组CaN Aβ mRNA表达较siRNA阴性对照组受到明显抑制,细胞面积siRNA阴性对照组较siR-NA组增加.结论:siRNA可抑制钙调神经磷酸酶AβmRNA的表达,对于心肌细胞中基因功能的研究,RNA干涉可以作为应用工具.
-
Sprouty2蛋白表达对肾癌细胞功能影响的实验研究
目的 研究Sprouty2蛋白的表达水平对肾癌细胞增殖、侵袭等生物学功能的影响.方法 采用RNAi技术,构建质粒转染肾癌细胞系786-O,建立Sprouty2低表达细胞株,通过MTT、Transwell等技术研究Sprouty2蛋白的表达水平对肾癌细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响.结果 成功构建Sprouty2低表达肾癌细胞系.当Sprouty2表达水平下调后,肾癌细胞的增殖、侵袭能力增强,与对照组及空质粒转染组比较差异有显著性(P<0.05).结论 Sprouty2的表达对肾癌细胞的功能有一定影响,Sprouty2表达越低,肾癌细胞的增殖及侵袭力越强.
-
经RNM诱导的前脂肪细胞构建组织工程化脂肪组织
目的:应用基因工程和组织工程的原理和方法,通过改造人前体脂肪细胞,提高其活性后,于裸鼠背部皮下构建组织工程化脂肪组织.方法:采用原代消化细胞培养法培养出前脂肪细胞,利用RNAi技术,诱导前脂肪细胞内的一个重要凋亡调控基因Bax基因表达沉默,然后接种到聚乳酸一乙醇酸共聚物(PLGA)支架上,种植在20只雌性裸鼠皮下,对获得的脂肪组织进行组织学评价.结果:经过改造后的前脂肪细胞活性良好,术后裸鼠全部成活,前脂肪细胞能够在支架上良好的存活,生长和增殖.结论:经过改造后的前脂肪细胞具有良好的活性,并且PLGA-前脂肪细胞复合体在裸鼠体内可形成脂肪细胞,值得进一步研究,以探索治疗软组织缺损的新途径.
-
RNA干扰的研究进展
RNA干扰(RNAi)是指内源产生或人为转染进入细胞的小干扰双股RNA在细胞内特异性地诱导同源互补的mRNA降解,从而阻断相应基因表达的现象.RNAj在生物界中广泛存在,其发生过程主要分为3个阶段:起始阶段、效应阶段和扩增阶段.它在抵御病毒感染、维持基因组稳定、基因表达调控等方面发挥重要生物学作用.随着人们对RNAi研究的不断深入,RNAi技术作为基因沉默的一个工具,已被广泛用于基因功能研究、疾病的靶点治疗等方面的研究.
-
USP22与肿瘤关系的研究进展
USP22作为泛素特异性加工酶家族中的一员,位于人类17号染色体,编码蛋白产物约66kDa,是hSAGA复合物的一个亚单位,主要通过去泛素化修饰调节细胞内的一系列生化反应,包括细胞的生长分化、肿瘤形成、调控细胞周期、转录激活和信号转导等.目前研究发现USP22 主要通过调控Bmi-1 及MYC、FBP1、TRF1 等因子参与肿瘤发生发展,这一特点使其可能成为肿瘤干细胞标志物之一.基于 USP22的上述作用,针对 USP22设计的特异性抑制因子有可能在将来成为肿瘤治疗新的切入点.
-
RNA干扰Her-2基因对乳腺癌治疗的研究进展
乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一,近年来发病率呈现逐年上升的趋势,大量的分子遗传学资料表明约25％-30％乳腺浸润性导管癌患者存在Her-2原癌基因扩增及其蛋白的过度表达[1].作为乳腺癌预后不良的一项独立危险因素,Her-2与肿瘤发生、转移、放化疗抵抗具有密切关系.因此针对Her-2基因治疗、基因疫苗等技术的探索为乳腺癌的治疗提供了新的思路,目前比较前沿的为RNA干扰技术.
-
miRNA在肿瘤研究中的应用
miRNA是一种小RNA分子,通过抑制蛋白质翻译来控制基因的表达.miRNA的表达及其甲基化与肿瘤的形成有密切关系.人类RNA干扰途径起源于细胞核,通过miRNA介导的RNAi基因治疗能够抑制癌基因和与肿瘤进展相关的基因.应用miRNA介导的RNA干扰技术治疗癌症,有可能克服目前癌症治疗中的诸多难题.
-
CIK细胞对RNAi沉默PD-L1基因的肺腺癌A549细胞的体外抑制作用
目的:观察沉默肺癌A549细胞的程序性死亡受体1(programmed death ligand 1,PD-L1)基因表达后,CIK细胞对其体外抑癌的作用.方法:分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),加入细胞因子(cytokine,CK),体外细胞因子诱导为杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK cells).将已构建的PD-L1 shRNA重组质粒pGPU6/PD-L1,应用脂质体转染法转染入A549细胞.RT-PCR法检测PD-L1基因的表达;Western blotting法检测PD-L1蛋白的表达;CCK8法检测CIK细胞对各组A549细胞的杀伤率.结果:成功将pGPU6/PD-L1转染入A549细胞;RT-PCR结果显示pGPU6/PD-L1使A549细胞PD-L1基因表达水平降低;Western blotting结果显示pGPU6/PD-L1转染A549细胞使PD-L1蛋白表达减少;CCK8结果显示pGPU6/PD-L1能够增强CIK细胞对A549细胞的体外抑瘤能力.结论:下调肺癌细胞A549的PD-L1 mRNA表达,MTT证明能够增强CIK细胞对其体外杀伤作用.
-
siRNA干扰LEF-1的表达对骨肉瘤细胞株F5M2侵袭和迁移的影响
目的:检测LEF-1在骨肉瘤细胞株F4和F5M2中的表达；探讨siRNA干扰前后对骨肉瘤细胞中LEF-1的表达及对细胞侵袭和迁移的影响.方法:采用Western-blot及qRT-PCR检测具有不同转移能力的骨肉瘤细胞株(F4,F5M2)中LEF-1的表达水平；利用RNAi干扰技术将LEF-1 siRNA转染到F5M2细胞中,使用Western-blot检测转染LEF-1 siRNA后细胞中LEF-1蛋白的表达变化；Tanswell实验检测干扰LEF-1的表达对F5M2细胞侵袭和迁移的影响.结果:LEF-1在骨肉瘤细胞株F4,F5M2中差异表达,其中在F5M2细胞中的表达较高.在转染LEF-1 siRNA的F5M2细胞中,LEF-1蛋白表达水平显著降低.Tanswell实验结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组F5M2细胞的侵袭和迁移能力显著降低.结论:LEF-1 siRNA可以下调骨肉瘤细胞中LEF-1的表达,抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移.LEF-1有可能成为骨肉瘤诊治的新靶点.
-
人钙调神经磷酸酶Aα RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建人CaNAα(钙调神经磷酸酶催化亚基α异构体,calcineurin catalytic subunit alpha isoform)RNAi慢病毒载体PPP3CA-RNAi-LV并鉴定.方法:根据CaNAα mRNA选择靶区、设计合成shRNAs及无关对照序列,酶切连接pGCSIL-PUR载体,经测序鉴定阳性克隆,提取质粒、转染SBC-5细胞,经real-time PCR及Western blot检测CaNAα沉默水平;选择高沉默效率的pGCSIL-PUR-shRNA3进行慢病毒颗粒包装,浓缩纯化并滴定浓度后,-80℃保存备用.结果:与对照组相比,pGCSIL-PUR-shRNA3沉默效率高,成功包装慢病毒颗粒,滴定浓度为1×109TU/ml.结论:成功构建人CaNAα RNAi慢病毒载体PPP3CA-RNAi-LV,为后续功能研究奠定基础.
-
特异性siRNA抑制宫颈癌细胞中HPV16 E7基因的表达
目的:用真核表达siRNA干扰技术特异性抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E7癌基因的表达.方法:运用DNA重组技术构建表达特异性siRNA的 pGenesil-1/E7(PS7)重组质粒,用脂质体分别将重组质粒转染宫颈癌细胞系CaSKi细胞内,通过半定量RT-PCR 实验检测CaSKi/PS7细胞中E7 mRNA水平的变化;再用western blotting检测 CaSKi/PS7细胞中E7蛋白、磷酸化pRb 和去磷酸化Rb的表达;用免疫细胞化学法检测细胞中ki-67、NF-κB 、bcl-2和p16的表达.结果:成功构建了真核细胞表达的、特异性siRNA的PSN 和PS7重组质粒.在RNA干扰24、48和72小时后 CaSKi/PS7细胞中E7 mRNA分别下降了21.05%、 51.80%和49.10%;RNA干扰后的CaSKi/PS7细胞中E7蛋白的表达逐渐减低,而且磷酸化pRb表达降低和去磷酸化Rb 的表达升高;与CaSKi/PSN细胞相比,CaSKi/PS7细胞中的ki-67、NF-κB 和bcl-2表达降低,而p16的表达增加.结论:本研究成功构建了真核细胞体内表达特异性siRNA重组体,有效地抑制了宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E7基因的表达,为RNA干扰应用于研究宫颈癌发病分子机制提供了新的资料和方法.
-
shRNA对肺癌相关基因抑制作用的实验研究
目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,研究突变型蛋白磷酸酶2A(PP2A)α催化亚基编码基因的小发夹RNA(shRNA)对人肺癌GLC-82细胞的影响.方法:根据靶基因的不同区域设计4组shRNA,采用体外转录法合成,利用阳离子脂质体转染入GLC-82细胞,孵育48小时后,观察细胞形态学改变,MTT法检测细胞的存活率,免疫印迹法检测蛋白质的表达.结果:与空白对照相比,4组shRNA作用不尽相同,其中一组shRNA可以明显抑制细胞的增殖,出现部分细胞脱落死亡,并且抑制GLC-82细胞目的蛋白的表达.结论:成功筛选出一段能特异而高效地抑制突变型PP2A α催化亚基基因表达的shRNA,为进一步研究该基因的功能和作用机制提供了新的手段.另外,应用RNA干扰技术可抑制突变型PP2A α催化亚基编码基因在人肺癌GLC-82细胞中的表达,有望成为肺癌基因治疗新的研究线索.
关键词： shRNA RNAi 突变型 磷酸酶2Aα催化亚基 -
腺病毒介导的RNAi技术抑制Peroxiredoxin Ⅰ的表达
目的:为深入研究Peroxiredoxin Ⅰ(Prx-Ⅰ)基因与肿瘤细胞放射敏感性的关系,构建基于腺病毒的抑制Prx-Ⅰ基因表达的RNAi载体.方法:从质粒载体pAVU6-Prx切下包含U6启动子在内的表达盒,连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack,然后在大肠杆菌中重组为完整腺病毒DNA,并将其转染293包装细胞制备腺病毒颗粒,再利用腺病毒感染目的肿瘤细胞,干扰其Prx-Ⅰ基因的表达.结果:成功地将U6表达盒连接到穿梭载体,获得重组的腺病毒DNA,并制备出高滴度病毒.将病毒感染肿瘤细胞SW480以后可以明显抑制Prx-Ⅰ基因的表达,并使细胞受辐射后的细胞凋亡比例增大.结论:基于腺病毒的RNAi干扰是有效的,这为进一步在体内探讨肿瘤放疗增敏机制奠定了基础.
关键词： Peroxiredoxin Ⅰ 电离辐射 重组腺病毒 RNAi -
针对MAGE-1的pSUPER RNAi系统的构建
目的构建抑制MAGE-1的siRNA表达载体.方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向MAGE-1基因的寡核苷酸链,各64个碱基,退火,克隆到经BglⅠ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建RNAi质粒.通过双酶切鉴定及基因片段序列分析验证构建效果.结果重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.结论载体的成功构建,为进一步研究MAGE-1在肿瘤中的功能打下基础,可用于分析基因功能、肿瘤治疗等.
-
RNAi技术对APMCF1基因表达的抑制作用及其对HepG2细胞的影响
目的:采用RNAi抑制APMCF1基因表达,并观察其对HepG2细胞生长和细胞周期的影响.方法:根据APMCF1基因序列及其二级结构特征,设计并合成针对APMCF1基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUNeo载体,并采用脂质体介导法将其稳定转染至人肝癌细胞系HepG2,RT-PCR检测siRNA对靶基因mRNA的抑制效果,然后采用MTT实验、流式细胞仪等对细胞的生长及细胞周期进行观察.结果:HepG2细胞的APMCF1基因表达被成功的抑制.APMCF1基因表达受抑制的HepG2细胞的生长速度加快;细胞周期发生改变,G1期细胞比例减少,S期细胞比例增多,差异具有显著性.结论:HepG2细胞的APMCF1基因表达被成功的抑制.APMCF1基因对HepG2细胞的生长和细胞周期有明显的调节作用,可能是一个侯选的细胞周期调节基因.
-
针对B7-H1的siRNA对脑胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响
目的:利用针对B7-H1的siRNA在脑胶质瘤U87细胞中下调B7-H1的表达,研究B7-H1的表达下调对U87细胞增殖和凋亡的影响.方法:根据人B7-H1的mRNA序列设计并合成两对针对B7-H1的siRNA,于转染前一天将U87细胞接种于10 cm细胞培养皿中,以转染时细胞融合度为50％-80％为宜,分别用250 μ10PTI-MEM稀释15μl siRNA与15μl转染试剂Lipofectamine 2000,将两者混匀室温静置20 rin后,滴入细胞培养皿中.转染60或72 h后利用流式细胞术检测B7-H1在细胞表面的表达情况,利用荧光定量PCR和Western Blot分别检测B7-H1的mRNA和蛋白质水平,并用MTT和流式细胞术检测B7-H1表达下调后,U87细胞增殖和凋亡的改变.结果:与阴性对照组相比,两对针对B7-H1的siRNA均可有效下调U87细胞中B7-H1的表达,流式细胞术结果显示与阴性对照组相比,B7-H1阳性表达率由53.2％分别下调至26.7％和20.6％；MTT结果显示B7-H1表达下调后U87细胞的增殖被显著抑制,培养第5天吸光度值由0.58±0.02分别下降至0.451 ±0.02及0.342±0.016；流式细胞术结果显示B7-H1表达下调后U87细胞凋亡明显,早期凋亡率由0.1％分别增加至12.8％及13.2％.结论:B7-H1的表达下调可有效抑制脑胶质瘤U87细胞的增殖,并促进细胞凋亡,提示B7-H1可能作为脑胶质瘤基因治疗的一个潜在靶点.
