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肿瘤-睾丸抗原MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在胃肠间质瘤中的表达
目的:探讨肿瘤-睾丸抗原(CTA)MAGE-1和NY-ESO-1作为胃肠间质瘤(GISTs)免疫治疗特异性靶点及MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA作为辅助GISTs危险度分级指标的可能性.及其与GISTs生物学行为的关系.方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测30例GISTs中MAGE-1和NY-ESO-1mRNA的表达,并取正常胃肠道组织作为阴性对照组,同时分析MAGE-1和NY-ESO-1mRNA表达与病理特征的关系.结果:正常对照组中无阳性表达,30例GISTs中,18例至少表达一种CTA,MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs中的表达率分别为30%和47%.MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达与患者年龄、性别和病理类型无关,而与肿瘤生长部位、肿瘤大小及危险度分级有关(P<0.05).MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在低危、中危、高危三个组中表达量随着危险度分级的升高而增高,三组间差异有统计学意义(P<0.05).MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs中的表达不存在相关性(r=0.018,P>0.05).结论:MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs中的高特异性表达,其抗原有望成为GISTs免疫治疗特异性的靶点:MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达与GISTs危险度分级有关,MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA有望成为辅助GISTs危险度分级的诊断指标.
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原发性肝癌中C-met、MAGE-1的表达及意义
别为10.0%、0%,两组比较均有显著性差异(P<0.05).C-met联合MAGE-1检测阳性率为85.0%.结论 ①C-met的表达与肝癌的肝内复发转移有关,是肝癌早期复发转移的风险因素.②MAGE-1在PHC患者肝癌组织中特异性高表达,可用来监测癌细胞扩散情况.③C-met、MAGE-1联合检测可提高诊断肝癌侵袭性的灵敏度.
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MAGE-1 MAGE-3及AFP基因在肝癌组织中的表达
目的:探讨MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA在肝癌组织中的表达及用于检测微小转移的可能性.方法:应用聚合酶链反应(PCR)检测86例原发性肝癌患者肝癌组织中MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA的表达.结果:86例原发性肝癌患者肝癌组织中MAGE-1、MAGE-3和AFPmRNA的阳性率分别为34.9%(30/86)、60.5%(52/86)和69.8%(60/86);所有患者肝癌组织至少表达其中一种mRNA.结论:MAGE-1、MAGE-3结合AFP mRNA在肝癌组织中表达率较高,有可能用于联合检测肝癌血行微小转移.
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MAGE-1与IL-18共表达DNA疫苗在小鼠体内诱导特异性免疫应答能力的研究
目的:观察已构建的pcIL-18一MAGE共表达质粒疫苗接种小鼠所引起的免疫应答情况.方法:质粒大量制备肌注小鼠,每隔10天加强免疫1次,共免疫3次.末次免疫后7天,收集血清及脾细胞,流式细胞术检测小鼠T细胞亚群情况及血清中抗MAGE-1多抗的产生,MTT法检测小鼠CTL杀伤活性.结果:pclL-18、pcMAGE-1、pcIL-l8+pcMAGE-1及pcIL-18-MAGE免疫组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及MAGE-1抗体的产生均高于pcDNA3免疫组(P＜0.05),且pcIL-18-MAGE共表达免交组高于pcIL-18+pcMAGE-1共同注射组(P＜0.05).pcIL-18-MAGE免疫组对SMMC-7721的杀伤活性高.结论:pcIL-18-MAGE共表达基因疫苗接种小鼠与其它实验小鼠相比,可以有效产生更好的特异性免疫应答.
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MAGE-1基因疫苗的构建及其免疫学活性的研究
目的:制备MAGE-1基因疫苗,观察该疫苗诱导小鼠脾脏的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞CTL活性及产生特异性抗体的影响.方法:应用基因重组技术,构建基因疫苗pcMAGE-1;转染HEK293细胞;RT-PCR及Western blot检测MAGE-1 mRNA及蛋白的表达;pcMAGE-1免疫3次BALB/c小鼠,末次免疫后7日收集血清及脾细胞.流式细胞术检测血清中抗MAGE-1多抗的产生,MTT法检测小鼠CTL杀伤活性.结果:构建的pcMAGE-1转染HEK293细胞,RT-PCR表明在mRNA水平有MAGE-1的表达;Western blot显示表达产物46 kD,与预期一致.基因疫苗免疫组小鼠血清MAGE-1抗体的产生增加,与SMMC-7721结合率显著高于对照组(P＜0.05).杀伤实验结果显示,免疫组小鼠脾细胞对SMMC-7721的杀伤率明显高于两个对照组(P＜0.05).结论:成功地构建了MAGE-1基因疫苗,该疫苗能够有效地诱导特异性免疫应答.
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MAGE-1与IL-18基因重组质粒转染的树突状细胞诱导体内抗肿瘤作用研究
目的:研究MAGE-1与IL-18基因重组质粒转染树突状细胞在体内诱导的抗肿瘤作用.方法:将重组质粒转入DC中构建DC疫苗,免疫肝癌荷瘤小鼠,观察被免疫小鼠的成瘤情况和生存时间.结果:DC疫苗免疫的荷瘤小鼠比对照组肿瘤生长受抑制,生存时间延长,其中共表达疫苗(pcmIL-18-MAGE)-DC组效果佳(P＜0.05),对MAGE(+)肝癌杀伤作用明显.结论:MAGE-1与IL-18基因重组质粒转染的树突状细胞疫苗在体内可产生抗肿瘤效果.
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pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1融合蛋白诱导特应性抗肿瘤免疫应答的研究
目的:构建重组表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1,研究人B7.2/MAGE-1基因修饰的食管癌细胞作为瘤苗的抗肿瘤作用.方法:通过RT-PCR扩增B7.2和MAGE-1的cDNA,以pEGFP-C3为载体,构建pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1重组载体,通过脂质体转染技术转染人食管癌细胞株EC9706,外周血来源的树突状细胞(DC)负载肿瘤抗原后,与自体T淋巴细胞共培养3天,获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL),用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对转染和未转染pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的食管癌细胞EC9706的杀伤活性.结果:CTL对转染pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的肿瘤细胞的杀伤活性大于转染pEGFP-C3和未转染细胞的杀伤活性(P＜0.05).结论:成功构建了真核共表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1,人B7.2/MAGE-1基因修饰的EC9706肿瘤细胞瘤苗,可诱导出明显的抗EC9706细胞的免疫效应.
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MAGE-1与IL-18共表达DNA疫苗的构建与体外表达
目的 构建MAGE-1与IL-18共表达质粒pcIL-18-MAGE并进行体外验证表达.方法 设计合成MAGE-1与IL-18引物,PCR扩增其基因片段,分别构建以pcDNA3为载体的小鼠IL-18重组质粒和人MAGE-1重组质粒,pcCMV-IL-18与MAGE-1的PCR产物酶切连接构建共表达质粒pcIL-18-MAGE.脂质体法将构建的重组质粒转染293细胞,RT-PCR和 Western 印迹法验证MAGE-1和IL-18在转化细胞中的表达.结果 成功获得共表达质粒pcIL-18-MAGE,RT-PCR可见目的条带,Western 印迹显示转染MAGE-1与IL-18的细胞在蛋白质水平上均有表达.结论 成功地构建出既表达mIL-18又表达MAGE-1的共表达质粒pcIL-18-MAGE.
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pcIL-18-MAGE-1基因疫苗免疫荷瘤小鼠抑瘤作用
目的：观察pcIL-18-MAGE-1基因疫苗对MAGE-1（＋）及MAGE-1（-）荷瘤小鼠的成瘤情况和生存时间的影响。方法将稳定表达MAGE-1基因的Hepal-6-MAGE-1细胞，接种于C57BL/6J小鼠，制备MAGE-1（＋）荷瘤鼠，利用 Hepal-6细胞制备 MAGE-1（-）荷瘤鼠，实验设为 pcIL-18-MAGE-1基因疫苗免疫组、阴性对照组及空白对照组，观察各组小鼠成瘤时间，肿瘤形成率、生长速率，抑瘤效果及生存期；应用 HE观察瘤体病理改变。结果 MAGE-1（＋）及MAGE-1（-）荷瘤小鼠的成瘤效果较一致，致瘤性检验差异无显著性（P＞0.05）；HE 结果显示瘤体肿瘤细胞排列不规则，可见核分裂；疫苗免疫组成瘤率，生长速率均小于对照组，差异显著（P＜0.05）。成瘤时间、生存时间长于对照组（P＜0.05），MAGE-1（＋）荷瘤鼠免疫组与MAGE-1（-）荷瘤鼠免疫组比较，抑瘤效果显著（P＜0.05）。结论 pcIL-18-MAGE共表达基因疫苗对荷瘤鼠具有一定抗肿瘤作用。
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共表达pcIL－18／MAGE－1 DNA疫苗对JEG－3细胞HLA－G基因表达的影响
目的：观察共表达基因疫苗 pcIL－18／MAGE－1对绒癌 JEG－3细胞株 HLA－G 基因表达的影响，探究 pcIL－18／MAGE－1抗肿瘤作用机制。方法应用构建的共表达pc IL－18／MAGE－1 DNA疫苗免疫小鼠，同时设阴性对照组和空白对照组，免疫后分别收集脾细胞，作用于靶细胞 JEG－3，应用FCM检测小鼠T细胞亚群情况及NK细胞活性，MTT法检测肿瘤特异性 CTL 对靶细胞的杀伤率，RT－PCR法检测 HLA－G基因表达情况。结果免疫组HLA－G基因表达降低，且对JEG－3细胞杀伤活性增加，与对照组比较，差异显著（ P＜0．05）。免疫组 NK 细胞活性及 CD4＋／CD8＋、CD8＋、CD4＋值均高于对照组（P＜0．05）。结论共表达基因疫苗pcIL－18／MAGE－1通过降低HLA－G基因的表达，进而增加NK细胞活性以及诱导肿瘤特异性 CTL直接杀伤肿瘤细胞，发挥抗肿瘤作用。
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pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达
目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepal-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力.方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepal-6细胞.G418筛选阳性克隆(Hepal-6-MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT法检测Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞接种于CA7BL/6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepal-6-MAGE-1细胞的致瘤能力.结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepal-6细胞,PT-PCR与Western bohting检测分别在Hepal-6-MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异.结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepal-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力.
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肝细胞癌患者组织中MAGE-1基因的原核表达及鉴定
目的:克隆MAGE-1基因并对其进行原核表达及鉴定.方法:通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从原发性肝癌的细胞中扩增MAGE-1基因片段,将该片段克隆在原核表达载体PET-32a中,重组克隆转化大肠杆菌BL21(DE3),表达的蛋白以His亲和柱层析纯化,并用Dot-blot和Westem-blot对其进行鉴定.结果:经RT-PCR扩增出930 bp基因片段,经测序分析后的DNA序列与Genbank中的报道序列同源程度达98%,构建含重组表达载体PET32-M1的工程菌,经IPTG诱导表达、纯化,MAGE-1蛋白浓度为0.48 mg/ml,经Dot-blot和Western-blot检测,纯化蛋白可以与商业化的驴抗MAGE-1的多抗结合.结论:成功扩增了肝细胞肝癌中的MAGE-1基因全长cDNA并对其进行了原核表达与鉴定,为进一步研究MAGE-1基因的功能和研制有临床价值的全人抗MAGE-1抗体奠定了基础.
关键词： 人肝细胞癌(HCC) MAGE-1 原核表达 -
RNA干扰基因敲除MAGE-1在恶性胶质瘤U87细胞中的初步研究
目的:通过构建抑制MAGE-1的短片段双链核糖核酸(siRNA)表达载体,鉴定其在人恶性胶质瘤细胞系U87细胞中对MAGE-1基因表达的干涉作用.方法:化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE-1基因寡核苷酸链,克隆至经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建核糖核酸干扰(RNAi)质粒载体.利用RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜,检测经稳定转染后胶质瘤U87细胞中MAGE-1的表达,以了解siRNA的干涉效果.结果:重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切、电泳及插入基因片段序列分析,表明寡核苷酸链成功地插入至预计位点,且序列与预期完全一致.稳定转染后G418筛选出的U87多克隆细胞MAGE-1的表达经RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜检测,2对siRNA均有较明显的干扰作用.结论:载体的成功构建并能对U87细胞中的MAGE-1分子进行RNAi,为进一步研究MAGE-1在肿瘤中的作用,分析基因功能,展开肿瘤基因治疗奠定了基础.
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舌鳞癌和涎腺腺样囊性癌细胞株中MAGE-1和MAGE-3基因的表达
目的 观察肿瘤特异性抗原基因MAGE-1、MAGE-3在人舌鳞癌细胞株Tca-8113、人涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-2和ACC-M中的表达状况，以评价这些基因作为舌鳞癌和涎腺腺样囊性癌的免疫学检测和免疫治疗、基因治疗分子标志物的可行性。方法 采取Tca-8113、ACC-2和ACC-M细胞株培养后，用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，而后应用聚合酶链反应扩增目的片段，经琼脂糖凝胶电泳确认目的片段。以GAPDH基因作为检测内对照，并与正常组织比较。结果 在人舌鳞癌细胞株Tca-8113、人涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-2和ACC-M中，MAGE-1、MAGE-3基因均有表达。在正常组织中未见上述基因的表达。结论 MAGE-1、MAGE-3基因有可能作为舌癌和涎腺腺样囊性癌免疫学检测的分子标志物，并且具有作为免疫治疗、基因治疗特异性靶位的潜在价值。
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肿瘤相关抗原MAGE-1体外诱导抗肿瘤免疫应答
目的：研究肿瘤相关抗原MAGE-1的抗肿瘤生物活性。方法：取健康人外周血,分离树突状细胞和T淋巴细胞。用脂质体介导法分别将质粒pcDNA3.1-MAGE-1和pcDNA3.1转染人肝癌SMMC-7721细胞株,设未转染的SMMC-7721细胞株为空白对照组,应用Real-timePCR检测3组细胞中MAGE-1 mRNA的表达;再分别用以上3种细胞的冻融抗原致敏树突状细胞,使其激活T淋巴细胞成为细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。应用乳酸脱氢酶释放法检测CTL对野生型SMMC-7721细胞的杀伤活性。结果：pcDNA3.1-MAGE-1转染组MAGE-1 mRNA的表达量为（1.211±0.586）,空质粒转染组及未转染组分别为（0.412±0.021）和（0.452±0.317）,3组比较,差异有统计学意义（F=538.652,P〈0.001）。转染pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒、pcDNA3.1空质粒的SMMC-7721细胞和未转染的野生型SMMC-7721细胞的冻融抗原所激活的CTL对野生型SMMC-7721细胞的杀伤活性分别为（48.26±2.47）%、（25.84±2.72）%和（26.27±0.81）%,3组比较,差异有统计学意义（F=139.607,P〈0.001）。结论：肿瘤相关抗原MAGE-1能够在体外诱导细胞抗肿瘤免疫反应。
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真核荧光蛋白表达载体 pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的构建与表达
目的:构建表达B7.2和MAGE-1的绿色荧光共表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1,并在真核细胞中表达.方法:根据GenBank中的序列,对B7.2、MAGE-1各设计一对两端带有特定限制性酶切位点的引物,分别从乳腺组织、乳癌组织提取总RNA,进行RT-PCR后,将两扩增产物分别克隆在pGEM-T载体,经测序证实碱基序列无误后,双酶切pGEM-T载体,回收目的片段,将两目的片段亚克隆至真核绿色荧光蛋白共表达载体(pEGFP-C3)上,并转染真核细胞,观察其在真核细胞中表达.结果及结论:pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核表达载体经酶切及基因序列分析验证,PCR扩增片段与选择的目的片段序列相符,pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核表达载体构建成功.该表达载体转染EC9706细胞后,用免疫荧光显微镜观察和RT-PCR分析,该重组载体能够在真核细胞中广泛表达.
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黑色素瘤抗原-1基因并进行序列分析
目的:克隆黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)基因并进行序列分析.方法:从人肝细胞性肝癌(HCC)组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出MAGE-1基因,酶切鉴定后将其插入pGEM-T easy载体,对其进行序列测定并与GenBank中已知序列进行同源性分析.结果:所克隆的MAGE-1基因与GenBank 中的MAGE-1基因序列相比较,仅有4个碱基存在差异,同源性为99.7%,而且仅有1处碱基差异引起了氨基酸改变.结论:从人HCC组织中成功克隆了MAGE-1基因.
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重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达
目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.
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真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建
目的:构建含MAGE-1基因的重组真核表达质粒.方法:用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至pGEM-T载体,测序证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒.结果与结论:RT-PCR获得长度为927 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-MAGE-1构建成功.
关键词： MAGE-1 pcDNA3.1(+) 真核表达载体 -
MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达
目的构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达.方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌(HCC)组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒.重组质粒用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达.结果RT-PCR获得长度为927 bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确.并在转化细胞中检测到了MAGE-1的表达.结论真核表达质粒pcDNA3.1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株.
关键词： MAGE-1 基因 pcDNA3.1(+) 真核表达
