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pcDNA3.1(+)-NPM1真核表达质粒构建
目的 构建pcDNA3.1(+)-NPM1真核表达质粒,体外转染人膀胱移行细胞癌pumc-91细胞并观察其表达情况.方法 设计引物,采用PCR扩增核仁磷蛋白1(Nucleophosmin,npm1)基因编码序列;运用基因重组方法对其进行双酶切,插入pcDNA3.1(+)载体,经菌液PCR、测序对重组质粒进行鉴定.将成功构建的质粒经脂质体介导转染至pumc-91细胞,Western blot验证蛋白表达情况.结果 经菌液PCR、测序鉴定表明成功构建pcDNA3.1(+)-NPM1质粒,将成功构建的质粒转染至pumc-91细胞,Western blot证实转染pcDNA3.1(+)-NPM1表达质粒的pumc-91细胞npm1蛋白过表达.结论 成功构建pcDNA3.1(+)-NPM1重组质粒,为进一步研究NPM1蛋白的功能奠定基础.
关键词： 核仁磷蛋白1 质粒构建 pcDNA3.1(+) -
Hint2基因过表达质粒的构建及其对肝癌细胞BEL-7402迁移的影响
目的 探讨Hint2基因过表达质粒的构建及其对肝癌细胞BEL-7402迁移的影响.方法 根据Hint2基因设计引物,扩增Hint2基因全长并以pcDNA3.1(+)为载体构建Hint2过表达质粒.转染BEL-7402细胞提取mRNA和总蛋白,分别使用Real-time PCR和Western blot检测转染细胞Hint2 mRNA和蛋白质表达的变化,应用免疫荧光染色法对细胞中Hint2蛋白与细胞线粒体进行共定位.使用划痕愈合实验检测Hint2过表达后对肝癌细胞BEL-7402迁移能力的影响.结果 转染Hint2过表达质粒细胞的Hint2 mRNA和蛋白表达显著上调,免疫荧光染色表明过表达的Hint2蛋白定位于线粒体.划痕愈合实验表明Hint2过表达质粒使肝癌细胞BEL-7402迁移速率显著降低.结论 Hint2过表达质粒能够上调BEL-7402细胞中Hint2 mRNA和蛋白质的表达水平,表达的蛋白定位于细胞线粒体并抑制肝癌细胞的迁移.
关键词： Hint2 pcDNA3.1(+) Bel-7402细胞 -
长型LRP16基因真核表达载体的构建及在HL60细胞中的表达
目的:构建长型LRP16基因开放阅读框架序列的真核表达载体,并观察其在髓系白血病细胞系HL60细胞中的表达情况.方法:采用RT-PCR方法自1例健康献血员外周血单个核细胞中克隆长型LRP16 cDNA;将长型LRP16 cDNA克隆入 pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定;将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA-LLRP16;脂质体介导法将其转染HL60细胞,培养72 h后用RT-PCR方法检测转染细胞中长型LRP16基因的表达情况.结果与结论:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人长型LRP16基因序列;转染实验表明 LRP16基因能在HL60细胞中过表达,为进一步研究长型LRP16基因功能奠定了基础.
关键词： LRP16基因 pcDNA3.1(+) HL60细胞 基因表达 -
脂质体转染促甲状腺激素受体基因构建Graves病模型
目的 比较以不同表达载体、目的基因及免疫程序,通过脂质体转染促甲状腺激素受体(TSHR)基因诱导小鼠Graves病的效率.方法 通过脂质体注射转染人TSHR和TSHR A亚基基因免疫小鼠,表达载体分别为pCDNA3.1(+)(pCDNA组)和pUBC,两组定期免疫并监测小鼠体重及血TSHR抗体(TRAb)水平,实验结束后处死小鼠测定血甲状腺激素水平.结果 pUBC组体重及血清TRAb水平变化均不明显.pCDNA组体重增长明显慢于对照组(P＜0.05),血TRAb水平亦呈明显上升趋势.TSHRA组体重增长明显慢于TSHR组(P＜0.001),血TRAb相对浓度升高较快.pCDNA两实验处理组FT4明显升高(P=0.023),且与体重增长呈负相关,但FT3与对照组差异无统计学意义(P＞0.05).pCDNA组体重和TRAb变化均在免疫后期较为突出.结论 采用pCDNA3.1(+)载体和TSHRA亚 基基因免疫并缩短免疫间隔有助于提高模型诱导率,FT4是监测模型甲状腺功能的合适指标.
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ING4基因的克隆和真核表达载体的构建
目的分离小鼠ING4(inhibitor of growth family,member 4)基因并构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-ING4.方法从小鼠肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出ING4cDNA,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定.结果RT-PCR产物为约750bp的条带,构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-ING4经双酶切、PCR鉴定均出现750bp大小的条带,基因测序正确.结论分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-ING4.
关键词： ING4基因 真核表达载体 pcDNA3.1(+) 小鼠 -
人载脂蛋白M野生型和突变型表达载体的构建及鉴定
目的:构建人载脂蛋白M(ApoM)野生型和突变型原核表达载体pGEX-KG-ApoM及真核表达载体pcDNA3.1(+)-ApoM.方法:Trizol法抽提HepG2细胞总RNA,RT-PCR扩增 ApoM全长基因,将基因片断重组到PMD18-T 质粒中构建PMD18-T-ApoM重组质粒载体,转化到大肠埃希菌JM109后筛选阳性克隆,提取质粒酶切和测序鉴定.采用Sited-directed Mutagenesis定点诱变试剂盒对ApoM基因进行体外定点诱变,DNA测序鉴定定点诱变成功与否.用双酶切方法分别将ApoM野生型和突变型基因定向连接到原核表达载体pGEX-KG和真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建野生型和突变型pGEX-KG-ApoM重组体和pcDNA3.1(+)-ApoM重组体,分别转化到大肠埃希菌DH5α内,提取质粒酶切鉴定和测序鉴定.结果:成功克隆了ApoM并构建了野生型和突变型原核表达载体和真核表达载体.结论:通过 RT- PCR,定点诱变及基因重组技术成功构建野生型和突变型重组表达质粒pGEX-KG-ApoM和pcDNA3.1(+)-ApoM,为进一步研究ApoM的功能奠定了基础.
关键词： 载脂蛋白M pGEX-KG pcDNA3.1(+) 定点诱变 -
甲型流感病毒NP基因真核载体的构建及初步表达
目的 构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况.方法 采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其目的蛋白的瞬时表达.结果 RT-PCR扩增到NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染HEK293后经免疫荧光技术检测到目的蛋白的表达.结论 本实验构建的甲型流感病毒NP部分基因序列的真核表达载体,为深入研究流感病毒核衣壳蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础.
关键词： 甲型流感病毒 NP基因 pcDNA3.1(+) 免疫荧光技术 -
HIV-1 B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达
目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础.方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因.TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag.在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT-PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达.结果重组质粒经BamHⅠ、 XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确.RT-PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达.结论成功构建了HIV-1 B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达.
关键词： 人类免疫缺陷病毒 pcDNA3.1(+) Gag 基因表达 -
流感病毒血凝素基因HA1区的克隆及其真核表达载体的构建
目的克隆甲型流感病毒血凝素基因HA1区及构建其真核表达载体.方法从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增血凝素基因HA1区.将所扩增片断克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),转化感受态大肠杆菌JM109并筛选阳性克隆.结果经双酶切、PCR及测序鉴定证实血凝素基因HA1区的真核表达载体构建成功.结论甲型流感病毒血凝素的HA1区是与宿主细胞膜表面受体结合的部位并起着诱导机体产生保护性抗体的作用,HA1区的克隆和其真核表达质粒的构建将为防治病毒侵入宿主细胞及核酸疫苗的研究打下基础.
关键词： 流感病毒 血凝素 pcDNA3.1(+) -
GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达
目的克隆绿色荧光蛋白(GFP)基因并构建真核表达载体,观察其在人胚肾293(下称293细胞)细胞中的表达和分布,为制备自行设计的以λ噬菌体为载体的人类免疫缺陷病毒(HIV)核酸疫苗的阳性对照奠定基础.方法以克隆好的pUC18/GFP为模板,根据Genbank中GFP的核苷酸序列设计引物,并在引物的5′端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性扩增GFP基因.TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含GFP编码基因的真核表达载体,酶切鉴定分析后,将该重组质粒通过脂质体介导,转染293细胞.荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达和分布.结果重组质粒经BamHⅠ、 XhoⅠ双酶切成5.4kb与0.7kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了GFP基因片断,测序结果表明编码框正确,并在293细胞中获得了表达,分布均匀.结论 pcDNA3.1(+)/GFP真核表达载体已成功构建,并可在293细胞中表达.
关键词： 绿色荧光蛋白 pcDNA3.1(+) 293细胞 -
真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建
目的:构建含MAGE-1基因的重组真核表达质粒.方法:用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至pGEM-T载体,测序证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒.结果与结论:RT-PCR获得长度为927 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-MAGE-1构建成功.
关键词： MAGE-1 pcDNA3.1(+) 真核表达载体 -
MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达
目的构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达.方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌(HCC)组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒.重组质粒用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达.结果RT-PCR获得长度为927 bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确.并在转化细胞中检测到了MAGE-1的表达.结论真核表达质粒pcDNA3.1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株.
关键词： MAGE-1 基因 pcDNA3.1(+) 真核表达 -
c-fos反义基因对缺血缺氧心肌细胞肌钙蛋白表达的影响
目的探讨c-fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞肌钙蛋白表达的影响.方法烧伤血清采自30%TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠:采用含1%O2的混和气体作为缺氧模型;采用基因重组技术构建c-fos反义基因重组体;由Lipo-fectamine Kit介导心肌细胞转染;于缺氧复合烧伤血清处理1,3,7h不同时相点采用Western blot检测c-fos蛋白,肌钙蛋白-T(TnT)的表达变化.结果加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞(简称非转染组),c-fos蛋白显著表达,3h达到高峰,与正常对照组比较,TnT表达显著下降,7h降至低水平;转染c-fos反义基因重组体(简称转染组)后,c-fos蛋白表达显著下降,TnT表达却显著回升.结论缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞TnT表达较正常心肌细胞明显减少,当在缺氧复合烧伤血清处理前转染c-fos反义基因后,心肌细胞TnT表达较单纯缺氧复合烧伤处理心肌细胞显著回升,表明c-fos反义基因转染能抑制心肌细胞TnT的表达下降.
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pcDNA3.1(+)/NspA真核表达载体的构建及鉴定
目的构建pcDNA3.1(+)淋病奈瑟菌外膜蛋白-奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface Protein A,NspA)基因真核表达载体,为研制淋病奈瑟菌核酸疫苗奠定基础.方法根据淋病奈瑟菌NspA基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出NspA基因片段,将扩增的产物连接于测序载体pUCm T上,并构建重组体pcDNA3.1(+)/NspA,进行酶切、PCR及测序鉴定. 结果 NspA基因体外扩增产物大小约为525 bp.所构建的pcDNA3.1(+)/NspA重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片断的大小相符;测序结果与GenBank中收录的NspA全长序列一致,表明pcDNA3.1(+)/NspA真核表达载体构建正确.结论成功地构建了淋病奈瑟菌真核重组表达载体pcD-NA3.1(+)/NspA,为NspA蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌核酸疫苗的研制提供了物质基础.
关键词： 淋病奈瑟菌 表面蛋白A pcDNA3.1(+) 克隆 疫苗 -
c-jun反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞保护作用的分子机制研究
目的探讨c-jun反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞保护作用的分子机制.方法烧伤血清采自30% TBSA Ⅲ度烫伤Wistar大鼠;采用含1%O2的混和气体作为缺氧模型;采用基因重组技术构建c-jun反义基因重组体;由Lipofectamine kit介导心肌细胞转染;缺氧复合烧伤血清处理后12、24和48h不同时相点采用Western blot检测c-jun蛋白,PKCα和JNK的表达变化.结果加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞(非转染组),c-jun蛋白,PKCα和JNK均显著表达,24h达高峰;转染c-jun反义基因重组体(转染组)后,c-jun蛋白,PKCα和JNK表达均明显下降.结论 c-jun反义基因重组体转染通过PKCα和JNK的表达下降对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞起保护作用.
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HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达
目的 克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp120基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础.方法 以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp120基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5′端分别引入BamH Ⅰ及Xho Ⅰ酶切位点,特异性地扩增gp120基因.TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp120编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gp120.在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gp120基因的细胞系,用RT-PCR及Western boltting检测其在HepG2细胞中的表达.结果 重组质粒经BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切成5.4kb与1.44 kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gp120基因片断,测序结果表明编码框正确.RT-PCR及Westernblotting证实稳定转染gp120基因的HepG2细胞系中有该基因的表达.结论 成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gp120,并在HepG2细胞中获得稳定表达.
关键词： 人类免疫缺陷病毒 pcDNA3.1(+) gp120 基因表达 -
重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达
[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达.[方法]用RTPCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达.[结果]成功克隆1.74kb的全长tyrcDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达.[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达.
关键词： 黑色素瘤细胞 一元酚单氧酶/遗传学 质粒 pcDNA3.1(+) 基因表达 -
成纤维细胞激活蛋白及其突变体真核表达质粒的构建及鉴定
目的：构建并鉴定人成纤维细胞激活蛋白（ FAPα）真核表达质粒pcDNA－wFAPα（野生型FAPα）、pcDNA－tFAPα（胞外段FAPα）和pcDNA－mFAPα（缺失624～704位氨基酸的突变型FAPα）。方法以口腔癌组织总RNA为模板，采用RT－PCR方法扩增wFAPαcDNA基因片段，连接至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）获得重组pcDNA－wFAPα质粒。以重组 pcDNA －wFAPα为模板，扩增 tFAPα基因片段；用 overlap PCR 技术，获得mFAPα基因；分别连接至pcDNA3．1（＋）获得重组pcDNA－tFAPα和pcDNA－mFAPα质粒。结果酶切鉴定和测序验证皆显示pcDNA－wFAPα、pcDNA－tFAPα和pcDNA－mFAPα为正确重组质粒。结论成功构建人野生型FAPα（ wFAPα）、胞外段FAPα（ tFAPα）和突变型FAPα（ mFAPα）真核表达质粒，为进一步研究FAPα在口腔鳞癌发病过程中的分子机制奠定基础。
关键词： 成纤维细胞激活蛋白 真核表达载体 pcDNA3.1(+) -
HIV-1 B亚型包膜糖蛋白gp41基因真核表达载体的构建与鉴定
目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp41基因并构建真核表达载体,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础.方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp41基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入KpnⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gp41基因.TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp41编码基因的真核表达载体,并进行酶切及测序鉴定分析pcDNA 3.1(+)/gp41.结果重组质粒经KpnⅠ,XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.0kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gp41基因片断,测序结果表明编码框正确.结论成功构建了HIV-1 B亚型包膜糖蛋白gp41基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gp41.
关键词： 人类免疫缺陷病毒 pcDNA3.1(+) gp41 -
c-fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理大鼠心肌细胞保护作用的实验研究
目的探讨c-fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞的保护作用.方法烧伤血清采自30%TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠;采用含1%O2的混合气体作为缺氧模型;采用基因重组技术构建c-fos反义基因重组体;由Lipofectamine kit介导心肌细胞转染;于缺氧复合烧伤血清处理1,3,7 h不同时相点采用RT-PCR检测c-fos mRNA的表达变化,采用Western blot检测c-fos蛋白,肌钙蛋白-T(TnT)和β-微管蛋白(β-Tubulin)的表达变化.结果加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞(下文称非转染组),c-fos mRNA和蛋白显著表达,3 h达到高峰,与正常对照组比较,TnT和β-Tubulin表达显著下降,7 h降至低水平;转染c-fos反义基因重组体(下文称转染组)后,c-fos mRNA和蛋白表达显著下降,TnT和β-Tubulin表达却显著回升.结论缺氧复合烧伤血清处理产生的c-fos会引起心肌细胞损伤,c-fos反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞具有保护作用.
