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定点诱变法构建β地中海贫血IVS-2-654(C＞T)突变基因质粒
目的 构建含β地中海贫血(简称β地贫)IVS-2-654 (C＞T)突变基因的质粒.方法 以含β珠蛋白野生型基因的质粒DNA为模板,采用重叠延伸PCR (OE-PCR)定点诱变后行TA克隆的方法构建含IVS-2-654 (C＞T)突变基因的质粒.结果 双向测序结果表明:重组质粒的确含β地贫IVS-2-654 (C＞T)突变基因,β珠蛋白IVS-2-654处的碱基已由C突变成T,其余序列与野生型完全相同,成功实现了定点诱变.结论 成功地构建了含β地贫IVS-2-654 (C＞T)突变基因的质粒,进一步为该病基因诊断与筛查技术的研究奠定了实验基础；OE-PCR定点诱变法简便、经济,值得推广应用.
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nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒XJ-160复制子载体特性的影响
为观察nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)XJ-160复制子载体特性的影响,以XJ160病毒复制子载体pBRepXJ为分子基础,利用定点诱变方法分别构建突变载体pBRep-726L、pBRep-726S、pBRep-726V和pBRep-726A.将新霉素抗性基因(Neomycin~r,Neo~r)克隆到pBRepXJ和各突变载体中,通过细胞培养方法观察nsP2-726Pro定点诱变对载体致细胞病变作用(Cytopathic effect,CPE)的影响;并将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green-fluorcscent protein,EGFP)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase,R.luc)报告基因分别插入到各载体中,定性与定量检测定点诱变对复制子载体自主复制能力的影响.实验结果表明,突变载体pBRep-726V和pBRep-726A在BHK-21细胞中的自主复制能力高于pBRepXJ,所诱发的细胞病变进程更快.替换突变nsP2726Pro→Leu的引入使载体在保持包装能力的同时,完全丧失在细胞上引起CPE的能力.而pBRep-726S则具有中间表型.提示nsP2-726Pro定点诱变在影响XJ-160复制子载体自主复制能力的同时,也改变了CPE的进程.这将为研究辛德毕斯病毒基因组结构与功能的关系及构建非细胞病变的甲病毒载体奠定基础.
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登革2型病毒全长cDNA克隆定点诱变的OL-PCR方法
目的对带有登革2型病毒(DEN-2)全长cDNA的质粒pDVWS501上E62、E203位点进行定点诱变. 方法设计4对点诱变引物,运用OL-PCR(overlap PCR)法,扩增出分别在E62或E203位带有点突变的2条DNA片段,克隆至T载体,获T-TB62、T-TB203两个克隆.将T-TB62用ClaⅠ和SphⅠ分别酶切,T-TB203用SphⅠ+NheⅠ酶切后,用T4连接酶分别连接至pDVWS501,获重组质粒TB62和TB203.对TB62和TB203进行序列测定. 结果成功得到分别在E62、E203位带有点突变的TB62、TB203克隆. 结论 OL-PCR法是具有较高突变效率的定点诱变方法.
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新型粘膜免疫佐剂候选株LTAˉB+的构建
目的:产肠毒素大肠杆菌产生的不耐热肠毒素(LT)不仅是很强的口服免疫原,而且其粘膜免疫佐剂作用显著.LT的毒性限制了它的直接使用,希望通过体外定点诱变技术,获得具有粘膜免疫佐剂作用的LT减毒株.方法:以人源LT基因为研究对象,首先构建了重组质粒pUC19-LT,然后用单引物PCR法和重叠延伸PCR法分别构建了LT Q7和K63基因突变体.结果:CHO细胞体外试验和家兔肠结扎体内试验毒性测定的结果表明,LT突变体K63的毒性明显降低.结论:K63有希望成为候选的高效粘膜免疫佐剂.
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巨血小板综合征糖蛋白Ⅸ基因异常的分子生物学研究
目的探讨糖蛋白(GP)Ⅸ基因点突变G2113→A在导致巨血小板综合征(BSS)中的意义.方法用限制性内切酶分析患者和其直系亲属以及40名正常人等位基因;采用定点诱变技术构建含有GPⅨ点突变G2113→A的质粒PD-ⅨG2113A;用含有GPⅠbα,GPⅠbβ和GPⅨ或GPⅨ突变型全长编码序列的质粒对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞共转染;流式细胞仪检测转染后的CHO细胞表面GP的表达;免疫染色和免疫印迹分析转染后的CHO细胞胞浆中GPⅠbα和GPⅨ的表达.结果先证者为纯合子,母亲和兄长均为杂合子;突变型CHO 细胞膜上GPⅨ和GPⅠbα的表达显著减少,但大量存在于细胞胞浆中.结论本例BSS患者的发病机制为GPⅨAla139(GCC)→Thr(ACC)突变.该突变不影响GPⅠb/Ⅸ在细胞内的合成与组装,但影响其在细胞膜表面的锚定与表达.
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一步PCR法在单碱基定点诱变中的应用
定点诱变技术广泛应用于基因工程和蛋白质工程,常用的方法有化学诱变、寡核苷酸介导的诱变,盒式诱变和基于PCR的诱变,其中基于PCR的诱变包括重叠延伸PCR(over-lap extension PCR,OEPCR),大引物PCR(mega primer PCR),环状质粒PCR.本方法属于环状质粒PCR,与常用的OE-PCR相比,本方法在质粒上进行诱变更为简便快捷,只需设计一对引物,进行一次PCR.
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发生点突变的pCDNA3.1(+)质粒的构建
体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具,也是我们在实验室中改造,优化基因常用的手段.蛋白质的结构决定其功能,二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一.
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HCT116-p53-/-细胞中p53基因突变子模型的建立
目的:合成p53基因突变子及构建真核表达载体,并在HCT116-p53-/-细胞中建立248W和273H突变子表达模型,为研究p53突变子在肿瘤发生中的作用及通过封闭p53突变子的方法进行肿瘤基因治疗提供实验基础.方法:以野生型p53基因为模板,采用引物重叠PCR定点突变技术,合成p53基因248W和273H突变子,并利用基因重组技术构建出表达载体,用脂质体转染法建立模型,Western blotting检测p53突变子蛋白.结果:经基因测序后证实第248位密码子由精氨酸(CGG)突变为色氨酸(TGG),第273位密码子由精氨酸(CGT)突变为组氨酸(CAT),说明成功合成p53突变子,构建的表达载体转染HCT116细胞后,经Western blotting检测,以特异表达条带与内参GAPDH的比值做为相对值进行半定量比较,特异蛋白表达显著升高,证实模型建立成功.结论:通过引物重叠PCR定点突变技术成功构建p53基因248W和273H突变子,并在HCT116细胞中成功表达.
关键词： 基因 P53 转染 定点诱变 Western blotting -
人葡萄糖调节蛋白78基因磷酸化位点的真核突变载体的构建及表达
目的 构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)基因编码区磷酸化位点的真核突变载体,并在肝癌SMMC-7721细胞中进行表达.方法 利用定点诱变技术将GRP78基因的两个磷酸化位点进行突变,即203位苏氨酸(T)用丙氨酸(A)替换,466位酪氨酸(Y)用苯丙氨酸(F)替换,以质粒pEGFP-N1-GRP78为模板,进行PCR扩增后,构建突变质粒pEGFP-N1-GRP78(T203A)、pEGFP-N 1-GRP78(Y466F)和pEGFP-N1-GRP78(T203A/Y466F),并进行DNA测序分析.将测序正确的突变质粒转染肝癌SMMC-7721细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,Western blot法检测融合蛋白在细胞中的表达.结果 突变质粒pEGFP-N1-GRP78(T203A)、pEGFP-N1-GRP78(Y466F)和pEGFP-N1-GRP78(T203A/Y466F)经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;突变质粒组荧光蛋白表达分布于细胞质内,细胞核内无表达产物分布;3个突变质粒转染组在相对分子质量约105 000处均可见目的蛋白条带,大小与预期相符.结论 成功构建了人GRP78单突变T203A、Y466F和双突变T203A/Y466F真核表达载体,并可在肝癌SMMC-7721细胞中表达,为进一步研究GRP78基因磷酸化位点T203、Y466在肝肿瘤侵袭和转移中的作用奠定了基础.
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重组人复合干扰素的定点诱变及PEG化修饰
目的 将复合干扰素(consensus interferon,cIFN)76位点丙氨酸(Ala)突变为半胱氨酸(Cys),以期获得一种高效和可供聚乙二醇马来酰亚胺(PEG-MAL)定点修饰的IFN突变体分子.方法 采用同源序列对比、空间结构模拟并结合IFNα与受体结合的特点设计突变位点.通过基因工程方法获得cIFNm76工程菌,IPTG诱导表达,所得包涵体经变复性、DEAE阴离子及CM阳离子两步交换层析纯化后,采用SDS-PAGE和高效液相色谱法(HPLC)检测cIFNm76的纯度;细胞病变抑制法检测其体外抗病毒活性;REFLEXTMⅢ基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)测定其相对分子质量;SDS-PAGE分析cIFNm76与PEG-MAL的交联反应;并进行N-末端、C-末端序列测定及紫外光谱扫描.结果 cIFNm76以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30％以上,纯度大于95％,比活性约为1.08×108 IU/mg,N-末端、C-末端氨基酸序列与理论一致,相对分子质量经MALDI-TOF-MS测定为19 500,紫外特征吸收波长为280 nm,与PEG-MAL成功交联.结论 成功获得一种高效和可供PEG-MAL定点修饰的cIFNm76,解决了现有PEG定点修饰技术存在的问题.
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大引物PCR定点诱变技术的研究进展
PCR技术自问世以来发展迅速,现已成为细胞生物学及分子生物学研究中常用的方法.而基于PCR的定点诱变技术又成为研究基因的生物学特性,探索蛋白质结构和功能相关关系的强有力工具.其中的大引物PCR定点诱变技术因其简便高效而倍受研究者欢迎.本文从该技术的每一层面人手,对此方法的研究进展进行概述.
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血红素加氧酶-1中第39位赖氨酸对电子传递功能的影响
目的验证血红素加氧酶-1(HO-1)中的第39位赖氨酸(K39)对电子传递的影响.方法通过定点诱变将K39置换为酸性氨基酸谷氨酸(E),并将得到的变异型酶基因克隆到高度表达的载体上表达,提纯变异型HO,测定其活性,比较变异型酶与野生型酶的活性区别,以了解高保守的碱性氨基酸K39对电子传递的影响.结果 HO催化血红素的体外反应,由抗坏血酸提供电子时,变异型酶K39E与野生型酶比较活性没有显著性差异;而HO催化血红素的模拟体内反应,由NADPH- 细胞色素P450还原酶提供电子时,变异型酶K39E与野生型酶相比活性有显著性差异.结论 HO的碱性氨基酸K39在接受并传递NADPH-细胞色素P450所提供的电子时具有重要作用.
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PCR定点诱变改造低效价抗胶质瘤单克隆抗体的初步报告
目的抗胶质瘤单克隆抗体建株初期效价为1:105,经长期传代培养后效价下降至低于1:104,为探索其分子机制并将其改造为有活性的单链抗体,为构建靶向基因转移载体奠定基础.方法通过RT-PCR克隆该单抗可变区基因,发现轻链可变区CDR1区出现一终止密码子,为此利用PCR定点诱变技术将其突变为该亚组相应的氨基酸,进一步构建单链抗体表达载体,并在大肠杆菌表达.结果改造后的单链抗体能高效表达,Western blot和免疫荧光证实能与相应的膜抗原特异结合.结论成功地改造并构建单链抗体,可用于胶质瘤靶向基因治疗.
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人载脂蛋白M野生型和突变型表达载体的构建及鉴定
目的:构建人载脂蛋白M(ApoM)野生型和突变型原核表达载体pGEX-KG-ApoM及真核表达载体pcDNA3.1(+)-ApoM.方法:Trizol法抽提HepG2细胞总RNA,RT-PCR扩增 ApoM全长基因,将基因片断重组到PMD18-T 质粒中构建PMD18-T-ApoM重组质粒载体,转化到大肠埃希菌JM109后筛选阳性克隆,提取质粒酶切和测序鉴定.采用Sited-directed Mutagenesis定点诱变试剂盒对ApoM基因进行体外定点诱变,DNA测序鉴定定点诱变成功与否.用双酶切方法分别将ApoM野生型和突变型基因定向连接到原核表达载体pGEX-KG和真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建野生型和突变型pGEX-KG-ApoM重组体和pcDNA3.1(+)-ApoM重组体,分别转化到大肠埃希菌DH5α内,提取质粒酶切鉴定和测序鉴定.结果:成功克隆了ApoM并构建了野生型和突变型原核表达载体和真核表达载体.结论:通过 RT- PCR,定点诱变及基因重组技术成功构建野生型和突变型重组表达质粒pGEX-KG-ApoM和pcDNA3.1(+)-ApoM,为进一步研究ApoM的功能奠定了基础.
关键词： 载脂蛋白M pGEX-KG pcDNA3.1(+) 定点诱变 -
重叠延伸PCR法构建β地中海贫血基因突变质粒标准品
目的:构建含β地中海贫血(简称β地贫)-28(A ＞G)与IVS-2-654(C ＞T)突变基因的质粒标准品.方法:以含β珠蛋白野生型基因的质粒DNA为模板,采用重叠延伸PCR( Overlap extension PCR,OE-PCR)定点诱变后行TA克隆的方法分别构建含-28(A ＞G)与IVS-2-654(C＞T)突变基因的质粒.结果:DNA测序表明:重组质粒1的确含β地贫-28(A＞ G)突变基因,β珠蛋白-28处的碱基已由A突变成G,其余序列与野生型完全相同;重组质粒2的确含IVS-2-654(C ＞T)突变基因,β珠蛋白IVS-2-654处的碱基已由C突变成T,其余序列与野生型完全相.成功实现了定点诱变.结论:分别成功地构建了含β地贫-28(A ＞G)与IVS-2-654(C＞T)突变基因的质粒标准品,进一步为HRM技术检测β地贫基因突变方法的建立及该病其它基因诊断与筛查技术的研究奠定了实验基础.
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大肠杆菌不耐热肠毒素基因克隆和无毒突变体mLT63的构建及序列分析
目的:大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是很强的免疫原,也具有很强的粘膜免疫佐剂作用,但LT的毒性限制了它在人类疫苗中使用.本研究希望通过定点诱变构建无毒或减毒并保持LT免疫学特性的突变体.方法:以人源肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌株E.coli 44815为研究对象,应用本研究室改进的SDS裂解法小量制备含LT基因的野生大质粒,PCR扩增LT基因,构建重组质粒pNEB193-elt;采用重叠延伸法PCR对LT第63位氨基酸进行体外定点诱变,构建LT突变基因的重组克隆载体,测序并进行序列分析鉴定.结果:采用本研究室改进的SDS裂解法,可成功地小量提取满足扩增模板要求的大质粒;所克隆的LT基因与GenBank公布的一致;定点诱变正确,无非特异性突变.结论:克隆的LT野生基因和定点诱变基因可用于构建重组表达载体,表达重组蛋白,对其粘膜免疫佐剂性或其他相关特性进一步研究.
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乳头瘤病毒表位融合蛋白的基因定点诱变
目的定点诱变热休克蛋白-乳头瘤病毒表位融合蛋白的基因中编码半胱氨酸的密码子,解决下游纯化工作中产生多聚体蛋白的问题.方法在对蛋白质序列进行计算机表位预测及生物学特性分析的基础上,利用PCR的定点诱变技术,使原始基因序列中编码半胱氨酸的TGC突变为编码甘氨酸的GGC,克隆并表达了该基因编码的蛋白质.结果经克隆、测序后证实已成功获得突变基因,其编码的融合蛋白经纯化后没有多聚体的产生.结论利用PCR定点诱变技术对基因进行突变,在不改变蛋白质抗原性质的基础上,优化蛋白质序列,提高蛋白质纯化质量和效率.
关键词： 乳头瘤病毒表位融合基因 定点诱变 表位预测 蛋白质纯化 -
载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190 T→A突变对其转录的影响
为探讨载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190 bp处的碱基突变(T→A)对载脂蛋白CⅡ基因转录的影响,及其与血浆载脂蛋白CⅡ浓度降低的关系.通过定点诱变技术构建带有-190 bp处 T→A突变的载脂蛋白CⅡ启动子的荧光素酶表达载体pGL3;应用脂质体介导的基因转染技术,将带有正常的载脂蛋白CⅡ启动子的表达质粒和构建的突变质粒分别与内参照质粒pRL-TK共转染HepG2细胞,瞬时表达;利用双荧光素酶测试系统检测荧光素酶活性.结果发现,带有启动子区-190 T→A突变的载脂蛋白C Ⅱ启动子的荧光素酶表达活性比正常的载脂蛋白C Ⅱ启动子的表达活性低18.56%.结果提示,载脂蛋白CⅡ基因启动子区-190 bp处的碱基由T突变为A降低了载脂蛋白CⅡ启动子的转录活性.
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定点诱变自我剪接Ⅰ型内含子核酶
目的验证嗜热四膜虫核酶自我剪接功能,定点诱变Ⅰ型内含子核酶及检测其自我剪接功能.方法PCR扩增嗜热四膜虫核酶基因连入pGEM-T载体,通过重组PCR获得3个非发夹区域定点诱变的Ⅰ型内含子核酶基因,连入pG-EM-T载体,分别进行体外转录.结果嗜热四膜虫核酶及诱变的3个核酶自我剪接功能完全.结论非发夹区诱变的核酶不改变其自我剪接的功能,为以后反式剪接核酶的设计构建提供了更多的选择基础.
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SARS相关冠状病毒Spike蛋白定点诱变
目的 分析确定SARS-CoV Spike蛋白序列中对SARS-CoV的感染能力相关性较强的位点,并进行定点诱变.方法 比对不同来源株SARS-CoV的Spike蛋白的序列,计算其相应位点的突变墒值和突变几率,结合进一步的生物信息学分析,筛选出经预测可能影响Spike蛋白与其受体结合进而导致SARS病毒对宿主细胞的膜融合侵染能力的7个位点,对各个位点用重叠延伸PCR法或直接PCR法进行人工定点诱变,获7个突变片段,之后将各片段亚克隆至克隆载体PSP72中.结果 经PCR和测序确认各片段点突变成功,并正确插入克隆载体PSP72中.结论 成功实施Spike蛋白的定点诱变,获得7个突变片段的重组子,这些突变体可为研究这些突变位点在Spike蛋白与受体结合中的意义,进而可为阐述Spike蛋白的结构与功能的关系、揭示Spike蛋白变异与SARS病毒侵入(染)细胞能力的相关性提供坚实的实验基础.
