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脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠成骨细胞Pax1表达的影响
目的 探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对小鼠成骨细胞骨骼发育相关基因Pax1表达的影响.方法 麻醉后取胎鼠的顶骨,采用改良的组织块培养法体外培养小鼠成骨细胞,碱性磷酸酶法鉴定成骨细胞,将浓度为100、200、500、1000和1500mg/L的DON分别作用于对数生长期的成骨细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测DON对成骨细胞增殖的作用.半定量RT-PCR和Western blotting检测不同剂量DON对体外培养小鼠成骨细胞Pax1 mRNA和蛋白质表达的影响.结果 培养的细胞鉴定为成骨细胞,不同浓度DON能降低小鼠成骨细胞的增殖速度,并可增加小鼠成骨细胞Pax1 mRNA和蛋白质表达,随着DON浓度增加,小鼠成骨细胞Pax1基因表达增多越显著.结论 DON促进小鼠成骨细胞Pax1基因的表达,进而影响骨骼的发育.
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几丁聚糖对镉抑制HepG2细胞DNA修复酶hOGG-1表达的影响
目的 研究几丁聚糖对氯化镉抑制 HepG2 细胞 DNA 氧化损伤修复酶 hOGG-1 表达的影响.方法 在氯化镉染毒 HepG2 细胞的同时,于培养液中加入不同浓度的几丁聚糖,采用 Western blotting 法检测氯化镉单独作用以及几丁聚糖和氯化镉联合作用下 HepG2 细胞 DNA 氧化损伤修复酶 hOGG-1 的表达水平.结果 ①以40 μmol/L 氯化镉染毒 HepG2 细胞 24 h 后,细胞内hOGG-1 表达显著下降;几丁聚糖对照组与正常对照组相比,hOGG-1 表达差异无统计学意义;②不同浓度几丁聚糖和氯化镉联合作用组 HepG2 细胞 hOGG-1 的表达水平均较氯化镉单独作用组高,随着几丁聚糖浓度的增加,hOGG-1 表达逐渐增强,并且在高剂量几丁聚糖(0.5 g/L)和氯化镉联合作用组差异有统计学意义.结论 几丁聚糖对氯化镉致 HepG2 细胞 hOGG-1 表达水平降低有拮抗作用.
关键词： 几丁聚糖 镉 DNA 损伤修复酶 Western blotting -
雄芍汤调节TGF-β/Smad通路有效部位的研究
目的：研究雄芍汤抗肝纤维化的药效物质基础，筛选其调节TGF-β/Smad通路的有效部位。方法：Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组、扶正化瘀胶囊组（扶正组）、雄芍汤组（雄芍组）、粗多糖组（多糖组）、总苷组、总生物碱组（总碱组），二甲基亚硝胺（DMN）腹腔注射复制大鼠肝纤维化模型。造模成功后，开始灌胃给药，治疗组分别给予扶正化瘀胶囊（0.105 g·mL-1）、雄芍汤粗多糖提取物（35.420 mg·mL-1）、雄芍汤总苷提取物（25.725 mg·mL-1）、雄芍汤总生物碱提取物（0.196 mg·mL-1），正常组与模型组灌服等量生理盐水，每日1次，疗程4周。4周后处死取材，实时荧光定量PCR检测肝组织TGF-β1 mRNA表达， Western blotting检测肝组织Smad3、Smad7蛋白表达。结果：与模型组比较，各治疗组TGF-β1 mRNA、Smad3蛋白表达均显著降低，Smad7蛋白表达均显著升高（P<0.05或P<0.01），总苷组Smad7、总碱组与模型组无显著性差异。结论：粗多糖部位和总苷部位为雄芍汤调节TGF-β/Smad通路的有效部位。
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逍遥散对慢性束缚应激肝郁脾虚证模型大鼠杏仁核Bax和Bcl-2蛋白表达的影响
目的:研究逍遥散对肝郁脾虚证模型大鼠杏仁核Bax和Bcl-2蛋白表达的影响.方法:36只SD雄性大鼠随机等分为正常组、模型组和逍遥散组.以14d慢性束缚应激造肝郁脾虚证模型组,除逍遥散组灌胃逍遥散悬液外,其余组均给予等量0.9％氯化钠溶液.取材后,通过Western Blotting方法观察各组杏仁核Bax和Bcl-2蛋白表达.结果:与正常组比较,模型组杏仁核中促凋亡因子Bax明显增多,而逍遥散能相应改善此种趋势；抑凋亡因子Bcl-2在3组杏仁核中表达无统计学差异.结论:逍遥散能够通过降低Bax的表达来改善慢性束缚应激致肝郁脾虚证模型大鼠杏仁核神经细胞的凋亡.
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益气活血中药对脑出血大鼠脑组织促血管生成素-1蛋白表达的影响
目的:通过研究益气活血中药方剂对脑出血大鼠脑损伤区组织促血管生成素-1(Ang-1)表达的影响,探讨益气活血法治疗脑出血的作用机制.方法:155只SD大鼠被随机分为正常组5只,假手术组、模型组、益气活血组、益气组和活血组各30只.用Ⅶ型胶原酶诱导脑出血大鼠模型.各组相应灌服益气活血法代表方补阳还五汤全方及其益气组分、活血组分药物.各组于术后1、4、7、14、21和28d各取5只大鼠,采用Western blotting方法检测Ang-1的表达,结果进行光密度扫描半定量分析.结果:正常组及假手术组不同时间点Ang-1表达未见明显阳性信号;模型组、益气组、活血组及益气活血组脑出血后1d即有Ang-1表达,模型组至21d达到高峰,随后开始下降,益气组、活血组及益气活血组表达高峰时间提前至14d,活血组及益气活血组至21d仍维持一定的表达水平;各个时间点益气活血组表达均高于其他组.结论:益气活血中药可能通过使脑出血血肿周围脑组织Ang-1的表达增强,而促进脑出血损伤区血管新生和成熟,并促进脑出血大鼠神经功能的恢复.
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丝裂原激活蛋白激酶在内毒素脂多糖诱导大鼠施万细胞一氧化氮合酶表达中的作用
目的 主要研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号途径在内毒素脂多糖(LPS)诱导大鼠施万细胞(Scs)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达和一氧化氮(NO)产生中的作用.方法 先用3种MAPK的特异性抑制剂PD98059(ERK1/2)、SB202190(P38 MAPK)和SP600125(JNK)以不同浓度预处理细胞1h,再用LPS作用施万细胞4 h后,用RT-PCR检测细胞中iNOS mRNA、IL-6 mRNA和TNF-α mRNA的表达;Western blotting观察iNOS蛋白水平的表达变化;通过测定细胞培养液中亚硝酸盐含量来观察NO的水平.结果 LPS可显著激活施万细胞中MAPK信号通路诱导iNOS表达.MAPK的抑制剂预处理细胞后,可显著抑制细胞iNOS mRNA和NO的合成及IL-6 mRNA和TNF-α mRNA的表达.结论 MAPK信号通路参与了LPS介导的大鼠施万细胞iNOS基因表达和NO产生,通过阻断细胞内信号转导通路来减少iNOS及其他细胞因子的产生,为抑制周围神经损伤后的炎症以及免疫反应发生提供了一条新思路.
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连接蛋白36和闭锁小带蛋白1在HeLa细胞的表达及相互关系研究
目的观察连接蛋白36和闭锁小带蛋白1在HeLa细胞的表达及探讨两者之间的相互关系.方法RT-PCR获得Cx36全长编码区基因片段,与PCR2.1TOPO克隆载体连接测序,亚克隆到pcDNA3真核表达载体,脂质体介导法转染HeLa细胞,G418抗性筛选阳性克隆,Western blotting,双标记免疫荧光和免疫沉淀分析HeLa细胞Cx36和ZO-1表达及关系.结果构建了重组真核表达载体Cx36-pcDNA3,转染的HeLa细胞获得稳定表达Cx36的克隆,Western blotting显示转染的HeLa细胞表达Cx36蛋白.双标记免疫荧光染色显示,HeLa细胞膜之间Cx36呈点状或线状表达,在Cx36表达部位也同样表达ZO-1.免疫沉淀显示细胞裂解液分别与抗ZO-1或抗Cx36抗体共沉淀,抗Cx36或抗ZO-1抗体进行免疫检测,前者在36kD有特异性Cx36蛋白带,后者在220kD处有ZO-1蛋白带.结论转染Cx36的HeLa细胞表达Cx36和ZO-1,两者共表达并且相互结合.
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蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表达对黑色素瘤B16细胞侵袭与转移的作用
目的 探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin(sv-cystatin)在黑色素瘤细胞侵袭与转移中的作用.方法 构建真核表达质粒pcDNA3.1/sv-cystatin,采用脂质体法将重组质粒导入小鼠黑色素瘤B16F1细胞,G418筛选抗性克隆,Western blotting法和RT-PCR鉴定sv-cystatin在黑色素瘤细胞中的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测肿瘤细胞体外生长和黏附能力的变化,体外侵袭、运动实验和小鼠实验性肺转移模型分析sv-cystatin表达对黑色素瘤细胞体内、外侵袭力的影响.结果 sv-cystatin基因稳定转染后B16F1细胞体外侵袭与运动能力明显降低,其穿膜的细胞数显著低于B16F1/pcDNA3.1空载体组和未转染细胞组(P＜0.01);sv-cystatin的表达可抑制C57BL/6小鼠肺转移瘤灶的形成;其体外增殖及黏附能力未见明显改变.结论 sv-cystatin基因转染可抑制黑色素瘤B16细胞的体内、外侵袭与转移能力.
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皮质酮对大鼠肝再生过程中鸟氨酸脱羧酶的抑制
目的 研究大鼠体内主要的糖皮质激素--皮质酮对部分肝切除(PH)诱导的再生肝鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因表达及酶活性的影响.方法 乙醚麻醉大鼠,于PH前3d行双侧肾上腺切除术及假手术,皮质酮悬浮于芝麻油中皮下注射玄肾上腺鼠.用RT-PCR、Western blotting及高效液相色谱法(HPLC)分别测定ODC mRNA、ODC蛋白及酶活性.结果 与再生肝相比,完整肝中ODC mRNA、蛋白及其酶活性水平较低.PH后所有组(每组n=6)中ODCmRNA水平均显著升高,5h达到峰值.7h前mRNA含量由高到低依次为去肾上腺组、去肾上腺假手术组(即对照组)、10和40ms/kg体重皮质酮处理组.去肾上腺组(n=13,下同)的ODC蛋白量高于对照组.10mg/kg体重皮质酮处理,在PH后0～24h下降,40mg/kg皮质酬处理组低.PH后,所有组(每组n=6)ODC活性迅速升高,6h达到峰值;皮质酮处理后活性在6h下降显著,40ms/kg体重皮质酮处理组活性低.结论 皮质酮处理后,大鼠完整肝及再生肝中ODC mRNA及蛋白水平呈剂量依赖性下降;ODC活性变化的部分原因是由于ODC mRNA及其蛋白量的改变.
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血管内皮生长因子在大鼠肝再生过程中的表达变化
目的通过检测血管内皮生长因子(VEGF)在大鼠肝再生过程中表达量的变化,探讨VEGF在肝再生中的作用.方法300只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组和实验组.实验组大鼠切除2/3肝,分别于术后不同时段取肝组织或原位灌注分离肝实质细胞.用免疫组织化学和Western blotting技术检测肝组织和肝实质细胞中VEGF的表达变化.结果正常肝组织的VEGF阳性细胞很少;肝切除(PH)后24 h阳性细胞数显著增加(P＜0.01),主要分布于门管区周围;PH 72 h时阳性细胞数达到高峰,几乎遍及整个肝小叶;从PH 120h起VEGF阳性细胞数逐渐减少至正常.Western blotting检测结果表明,肝实质细胞的VEGF表达量于PH 0～12 h较少,PH 12 h后增多,PH 24～72 h的表达量约为PH 0～12 h的2倍,PH72 h后逐渐下降,至120 h恢复正常;肝组织VEGF的表达量于PH 0～12 h较少,PH 12 h后逐渐增多,PH 72 h时出现高峰,约为PH 0～12 h的4倍;肝组织VEGF的表达量大于肝实质细胞的表达量.结论VEGF可能是参与肝脏组织结构重建的重要的生长因子:肝实质细胞是肝中VEGF的重要来源之一.
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阿糖胞苷对肺腺癌细胞凋亡的诱导作用及其机制
目的探讨阿糖胞苷(Ara-C)对人肺腺癌细胞株A549的凋亡诱导作用及其机制.方法Ara-C体外作用于A549细胞,噻唑蓝还原法(MTT法)检测Ara-C对A549细胞增殖的抑制作用;Hoechst33258荧光染色观察细胞核形态学的变化;单细胞凝胶电泳技术(comet assay)测定A549细胞DNA的损伤程度;以Western blotting进一步证明A549细胞发生凋亡.结果Ara-C对A549细胞的增殖有明显抑制作用;观察到特异性的凋亡小体;Ara-C导致A549细胞发生DNA链断裂,并呈明显剂量依赖性增强:Western blotting显示caspase 8,9,3都不同程度被激活,多聚ADP核糖聚合酶(PARP)被剪切降解.结论揭示了Ara-C明显诱导A549细胞凋亡;细胞凋亡通路不仅通过线粒体途径,还通过膜受体途径,两条通路协同作用使凋亡信号增强;提示Ara-C对A549细胞有明显的化疗作用.
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β-连环蛋白对毛囊细胞增殖的调节作用
目的 探索β-连环蛋白促进毛囊干细胞增殖作用的分子机制.方法 利用含有氨基端删除的β-连环蛋白的表达质粒转染毛囊细胞,观察转染细胞增殖,利用Westen blotting及原位杂交法观察其目的基因c-myc的表达.结果 转染ΔN90β-连环蛋白基因后细胞集落形成率增加,细胞K19阳性率亦有所增加;转染细胞c-myc的表达在蛋白质水平与mRNA水平均增加.结论 β-连环蛋白对毛囊细胞增殖分化的促进作用可能是通过促进c-myc基因的表达实现的.
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人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体的表达和生物学活性检测
目的 探讨人神经营养素-3受体TrkC基因重组腺病毒载体(Adeno-TrkC)在神经干细胞内的表达及其对神经干细胞的生物活性作用.方法 用RT-PCR检测Adeno-TrkC感染的293细胞的TrkC mRNA含量.用免疫细胞化学和Western blotting检测Adeno-TrkC感染的神经干细胞表达TrkC受体蛋白.在体外培养条件下,观察人神经营养素-3(NT-3)对感染了Adeno-TrkC的神经干细胞分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞的影响.结果 在Adeno-TrkC感染的293细胞和神经干细胞中检测到TrkC mRNA和TrkC受体蛋白,且表达产物和其配体NT-3结合后能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞,分化率达到55.2%,均高于其他对照组.结论 Adeno-TrkC能在神经干细胞内表达TrkC受体蛋白,这种TrkC受体蛋白具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞活性的作用,这为进一步应用NT-3和TrkC联合进行基因治疗中枢神经损伤研究奠定了基础.
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乙醛脱氢酶2抑制剂大豆甙对缺氧心肌细胞的MAPK信号转导作用
目的 检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)对大鼠心肌细胞在缺氧状态下氧自由基(ROS)产生、凋亡发生和信号转导的影响.方法 通过缺氧模型比较大鼠心肌细胞缺氧和经大豆甙(daidzin)24h预处理后缺氧的活性变化,用C400测定ROS,用TUNEL试剂盒检测凋亡,丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路酶磷酸化的改变用Westernblotting的方法检测.每组实验(n)均重复3次以上. 结果 当心肌细胞ALDH2被特异大豆甙抑制后,更易在缺氧环境下诱导产生ROS和凋亡,且与MAPK有关的磷酸化酶活性均表达增强. 结论 当ALDH2被抑制后,心肌细胞对缺氧的耐受性下降,这与ROS的产生、凋亡和MAPK信号通路的激活有关,ALDH2对缺氧引起的细胞改变具有保护作用.
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卫氏并殖吸虫成虫重组抗原的表达与鉴定
目的表达已转化入大肠杆菌的卫氏并殖吸虫成虫抗原(PwAg)基因,并评价其应用于免疫学诊断的价值. 方法用IPTG诱导表达已亚克隆入表达载体pRESETB的卫氏并殖吸虫成虫抗原基因,以SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物. 结果 SDS-PAGE电泳可见32 ku处有1条明显的蛋白质带,该带只被卫氏并殖吸虫成虫免疫兔、感染犬和病人血清识别. 结论成功构建重组克隆PwAg,其表达产物具有卫氏并殖吸虫成虫期特异性,推测可用于并殖吸虫病的免疫学诊断.
关键词： 卫氏并殖吸虫成虫 重组抗原 表达 Western blotting -
鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗候选基因在大肠杆菌中的表达
目的构建柔嫩艾美耳球虫子孢子表面抗原原核表达载体,并且在大肠杆菌中表达. 方法将本室构建的pMD-Mz5-7克隆质粒酶切回收目的片段定向亚克隆到pET-28b(+)载体上,构建成原核表达载体pET-28b-Mz5-7,酶切鉴定正确后,在Escherichia coli BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,并经SDS-PAGE 及Western blotting 鉴定. 结果成功构建了目的抗原基因的原核重组表达质粒pET-28b-Mz5-7,IPTG诱导表达该融合蛋白,SDS-PAGE电泳表明,其能表达一分子质量约为37 ku的融合蛋白,与预测分子质量相符,佳反应条件为1 mol/L IPTG诱导4 h后表达量高.薄层扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18%,Western blotting结果显示,表达产物可被抗柔嫩艾美尔球虫的多克隆抗体识别,说明该融合蛋白具有很好的反应原性. 结论在原核细胞融合表达Mz5-7成功,为鸡球虫病重组苗的研究奠定了基础.
关键词： 柔嫩艾美耳球虫GZ株 大肠杆菌 表达 Western blotting -
福氏志贺杆菌2a 2457T免疫蛋白质组学方法的建立
目的:建立福氏志贺杆菌2a 2457T的免疫蛋白质组学研究方法.方法:提取福氏志贺杆菌2a 2457T全菌蛋白进行不同pH梯度的双向电泳,结合Western Blotting技术寻找发生免疫反应的蛋白质.结果:蛋白经胶内酶切后使用基质辅助激光解析/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱鉴定了19个免疫反应蛋白点,对应于10种蛋白质.结论:该文成功建立了福氏志贺杆菌2a2457T的免疫蛋白质组学研究方法,为寻找保护性抗原的工作打下了基础.
关键词： 福氏志贺杆菌 Western blotting 免疫蛋白质组学 双向电泳 质谱 -
P75NTR在兔骨折不愈合局部组织中的表达及意义
目的 探讨P75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75NTR)在兔骨折不愈合局部组织中的表达及意义.方法 30只新西兰大白兔随机分成A、B、C三组,每组10只.A组建立骨折不愈合模型,B组建立骨折模型,C组不予处理为正常组.骨折不愈合造模成功、骨折模型愈合后,利用免疫组织化学、Western blotting及IPP6.0病理图像分析软件对三组组织中P75NTR的表达进行半定量分析,测定其平均吸光度值及P75NTR与β-action的比值.结果 P75NTR平均吸光度值骨折不愈合组为0.3287±0.0419,骨折组为0.0267士0.0187,正常组为0.0159 ±0.0136.骨折不愈合组与其他两组比较差异有统计学意义(P＜0.05),骨折组与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05);P75NTR/β-action骨折不愈合组为3.6434±0.0596,正常组为0.1390±0.0294,骨折组为0.1489士0.0317.骨折不愈合组与其他两组比较差异有统计学意义(P＜0.05),骨折组与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05).骨折不愈合组高表达P75NTR,骨折组和正常组中P75NTR表达较低,骨折不愈合组与其他两组比较差异有统计学意义(两种检测均显示P＜0.05);骨折组与正常组比较P75NTR的表达无统计学意义(两种检测均显示P＞0.05).结论 P75 NTR在兔骨折不愈合局部组织中表达,且明显高于骨折组和正常组,它可能是骨折不愈合形成的一个重要因素.
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MMP-3、MMP-13在骨性关节炎患者滑膜中的表达及意义
目的：探讨MMP-3、MMP-13在骨性关节炎患者滑膜中的表达及相关性。方法应用免疫组化和Western blotting法检测MMP-3、MMP-13蛋白在30例骨性关节炎（ OA，实验组）与30例非OA（对照组）患者滑膜组织中的表达情况。结果免疫组化结果表明MMP-3、MMP-13蛋白在实验组与对照组患者滑膜中的表达有显著性差异（ P＜0.01），且阳性表达多定位于滑膜细胞的胞浆；Western blotting分析结果显示MMP-3、MMP-13蛋白在实验组患者滑膜中表达明显高于对照组患者，且二者在OA组中表达呈正相关性。结论 MMP-3、MMP-13蛋白与骨性关节炎发生发展密切相关，可能作为诊断及判断骨性关节炎的一项重要指标。
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模拟失重对大鼠肝脏Hsp70及其基因表达的影响
目的 探讨模拟失重环境中大鼠肝脏组织Hsp70及Hsp70mRNA表达变化.方法 成年Wistar大鼠48只,体重(300±20)g).随机分为6组,按模拟失重时相分别为6、12、24、48、96、0 h组(地面对照组).采用尾悬吊法建立模拟失重动物模型.应用RT-PCR和Western blot技术分别检测各组大鼠肝组织Hsp70蛋白和mRNA的表达.结果 不同时相模拟失重环境下大鼠肝脏Hsp70mRNA水平均显著高于对照组(P<0.05),模拟失重6 h组肝脏Hsp70mRNA表达显著升高,12 h组达高峰,24 h和48 h略有下降,但仍然显著高于对照组(P<0.05).Hsp70蛋白表达水平在6 h组形成高峰,随模拟失重时间的延长,则呈明显下降趋势.96 h组降低到对照组水平.结论 模拟失重使大鼠肝脏组织中Hsp70蛋白和基因表达发生明显变化,提示肝脏Hsp70表达变化与失重应激反应和失重耐受有密切关系.
