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蛋白质组检测技术进展
"蛋白质组学"概念自1994年提出之后,其研究技术得到了突飞猛进的发展,主要采用的是双向凝胶电泳,但该方法存在很多不足,尤其在蛋白质的检测手段和定量分析上还不尽如人意.目前广泛使用的染色技术是银染和考马斯亮蓝染色,荧光染色等更准确和灵敏的检测技术也为蛋白质组学技术提供了不可比拟的技术支持.差异凝胶电泳和同位素代码标记的出现,对以双向电泳为核心的传统方法提出了创新和改进,新产生的多元化的分析方法将大大加强目前双向凝胶电泳的应用能力,促进其解决更多的基础问题.
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080 蛋白质组学技术及其在高原医学中的应用
在后基因组时代,蛋白质组学的研究越来越受到关注.蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质;蛋白质组学研究技术方法主要包括双向电泳、质谱技术、蛋白质芯片技术、蛋白质复合物纯化技术、酵母双杂交系统、噬菌体显示技术、表面等离子体共振技术和生物信息学.本文对蛋白质组和蛋白质组学的概念及研究技术方法以及近年来蛋白质组学技术在高原医学领域的应用作了简要综述.
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蛋白质组学:在生殖系统疾病研究的新方法
人类基因组大规模测序,揭示基因组精细结构的同时,还显示出基因数量的有限性和结构的相对稳定.随着生物技术的飞速发展,创立了与基因组相对应的蛋白质组学(proteomics),将从生命功能的执行体--蛋白质水平研究基因的表达及功能.生殖系统的疾病,并非均由遗传变异引起,许多分子水平的变化发生在翻译后蛋白质的修饰.利用蛋白质组学可从分子水平了解生殖系统的健康状况和疾病的发生机制.
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大鼠精子发生过程中热休克蛋白70-2特异表达的研究
目的运用蛋白质组学方法,寻找大鼠精子发生相关蛋白质,找到目标蛋白质后,进一步用免疫组织化学方法做定位研究.方法用重力沉降法(STAPUT法)从9 d龄雄性大鼠睾丸中分离出A型精原细胞,从成年的雄性大鼠睾丸中分离出粗线期精母细胞、圆形精子细胞.分别提取这3种细胞的总蛋白质,进行双向电泳.对所得双向电泳凝胶扫描,分析并找出差异蛋白质.对挑选出的差异蛋白质做质谱分析,发现在这3种不同细胞的表达上有明显差异的蛋白.进一步做睾丸免疫组织化学组织定位、定量研究.结果双向电泳结果显示,HSP70-2在粗线期精母细胞、圆形精子细胞中表达量较高,在A型精原细胞则表达量极少.HSP70-2在粗线期精母细胞中表达量大.用HSP70-2抗体对大鼠睾丸组织切片行免疫组织化学研究,发现粗线期精母细胞、Sertoli细胞、Leydig细胞有阳性颗粒反应.HSP70-2主要表达于细胞质. 结论HSP70-2在精子发生过程中有明显的差异表达,推测其对精子发生起重要调节作用.
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苯并芘处理HELF阻滞于S期细胞的蛋白质差异表达谱
目的 观察由于苯并芘(BaP)作用而阻滞于细胞周期特定时相的人胚肺成纤维细胞的蛋白表达改变,探讨苯并芘引起的细胞应激和致癌机制.方法 利用流式细胞术对苯并芘作用后的细胞进行分析和分选,采用双向凝胶电泳与相应软件分析苯并芘处理后细胞内蛋白质的表达谱,MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight)质谱结合数据库检索鉴定差异表达的蛋白斑点.结果 细胞经5 μmol/L苯并芘处理后明显阻滞于S期,该时相细胞蛋白质表达的改变,主要包括热休克蛋白HSP70、HSP27,超氧化物歧化酶SOD[Mn],不均一核糖核蛋白H,翻译调控肿瘤蛋白,类肌钙蛋白,α-肌球蛋白,肌动蛋白结合蛋白和纽蛋白等参与氧化应激和肿瘤发生有关的蛋白.结论 这些表达改变的蛋白与苯并芘引发的细胞应激和细胞S周期阻滞有关,进一步研究可有助于阐明苯并芘的致癌机理.
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L-02肝细胞蛋白质双向电泳条件的建立
人类蛋白质组学的研究是揭示人类生命活动和疾病机制的终阶段,运用蛋白质组学技术寻找各种疾病的关键蛋白和标志蛋白,可实现更加及时、准确的诊断[1].双向电泳技术一个主要的应用领域是"蛋白质组分析",包括对来自一个样品的大量蛋白质同时进行系统地分离、识别和定量.本实验通过比较几种不同的蛋白处理方法,优化双向电泳条件,找出较佳的样本处理方式,为成功进行双向电泳及质谱鉴定提供基础.
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白藜芦醇对UVB损伤HaCaT细胞保护作用的双向电泳图谱差异分析
目的 利用双向电泳技术(2-DE)从蛋白质组学角度分析白藜芦醇对中波紫外线(UVB)照射的人角质形成细胞(HaCaT细胞)的保护作用,以探讨白藜芦醇防御UVB损伤的作用靶点及有关机制.方法 MTT法检测不同浓度的白藜芦醇对经或不经UVB照射的HaCaT细胞增殖的影响.2-DE实验分对照组、UVB组、白藜芦醇组、UVB+白藜芦醇干预组(共同干预组),提取各组蛋白进行2-DE实验,结合质谱(M ALDI-TOF-MS)分析与数据库检索对差异蛋白质点进行鉴定.结果 筛选10个存在明显差异的蛋白点,质谱鉴定出8种蛋白质,除4种功能未知蛋白外,其余4种蛋白分别为转录起始因子IIE-β( TFIIE-β)、组蛋白H1.2、锌指蛋白、MAGOH蛋白.UVB组细胞内组蛋白H1.2水平较其它各组明显增高(P＜0.05)；UVB组、UVB+白藜芦醇干预组的TFIE-β及锌指蛋白表达水平均降低,UVB组下降为明显(P＜0.05)；UVB组的MAGOH蛋白较各组明显减少(P＜0.05).结论 应用2-DE联合质谱技术发现了白藜芦醇对UVB诱导的HaCaT细胞损伤防护作用相关的差异蛋白点.
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双向电泳-质谱技术筛选克山病血清差异蛋白
目的 比较克山病患者与健康者血清蛋白表达谱,探讨克山病发病机制,寻找与克山病发生相关差异蛋白.方法 从克山病病区选择8例慢型克山病,病区对照以及非病区对照各8例,应用双向凝胶电泳技术分离克山病患者同健康者的差异蛋白点,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱鉴定差异蛋白.结果 凝胶图像分析显示9个差异蛋白质点,经质谱鉴定确定8种蛋白.3种蛋白在克山病组较非病区健康组上调,其功能主要与脂类代谢,免疫调节,凋亡抑制有关.3种蛋白下调,主要与细胞内铁离子平衡密切相关.克山病组较病区健康组2种蛋白表达上调,主要与蛋白酶抑制等功能有关.结论 该研究发现触珠蛋白、血清白蛋白和α1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α2-HS糖蛋白可作为克山病的诊断与预后的候选生物学指标,具有重要意义.
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苯并[a]芘作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法的建立
目的 建立苯并[a]芘(B[a]P)作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法.方法 使用免疫共沉淀技术收集可能发生ADP-核糖基化修饰的蛋白,同步使用高效液相色谱技术和双向电泳技术对蛋白进行分离,再进行MALDI-TOF-MS/MS鉴定,比较两种分离方法鉴定蛋白的差异,并将鉴定蛋白的氨基酸序列与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白的保守序列进行比对.结果 通过高效液相色谱分离结合质谱鉴定找出3个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定找出12个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定方法存在明显优势;所鉴定蛋白存在与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白相似的保守序列.结论 免疫共沉淀蛋白双向电泳分离结合质谱鉴定方法可用于分析ADP-核糖基化修饰蛋白,并发现ADP-核糖基化蛋白存在相对保守的结合序列.
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蛋白质组双向电泳技术研究进展
双向电泳(2-DE)是蛋白质组研究的核心技术,本文重点介绍了2-DE的原理、样品制备及常用改善分辨率的方法,并对一向等电聚焦、二向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及凝胶染色方法进行了简要介绍.
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双向电泳分离大鼠子宫组织提取物的佳条件摸索
目的:建立并优化大鼠子宫组织提取物的双向电泳分离条件.方法:机械匀浆法制备子宫组织总蛋白提取物,采用不同方法处理样品及不同pH范围的固相梯度胶条进行双向电泳分析.结果:经丙酮沉淀处理的提取物在pH 5～8范围的固相梯度胶条进行双向电泳分离,可获得分辨率清晰和重复性较好的二维图谱.特别是在高分子量蛋白区域得到独立清晰的蛋白质斑点.结论:通过建立并优化双向电泳分离条件,为进一步分析生理与病理状态的子宫蛋白成分提供了技术支持.
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侧脑室微量注射瘦素对OEP大鼠子宫腔液蛋白表达的影响
目的:探讨瘦素通过下丘脑-垂体轴对子宫的调节作用.方法:应用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离OEP大鼠侧脑室微量注射瘦素及生理盐水6 h后的子宫腔液总蛋白,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对差异表达的蛋白质点进行鉴定.结果:与生理盐水对照组相比,瘦素实验组有6个差异表达蛋白质,其中5个蛋白点升高,1个蛋白点降低.经过质谱分析结合数据库检索,获得有意义的蛋白点,上调蛋白点为补体B因子、冠蛋白、肌动蛋白结合蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂B1、烯醇酶,下调蛋白点为补体C3.结论:这些差异表达蛋白涉及炎症反应、细胞分化、细胞迁移、细胞凋亡等功能,瘦素可能通过下丘脑-垂体轴从免疫、生殖等方面对子宫发挥调节作用.
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类风湿性关节炎关节滑液蛋白质双向电泳分析
目的:探讨类风湿性关节炎与其他关节炎病人关节腔滑液内IgG类蛋白组分的差异.方法:采用饱和硫酸铵分级沉淀离心法分离纯化各关节炎病人关节滑液内IgG类蛋白,对其进行双向电泳及专业分析软件分析、比较.结果:对类风湿性关节炎与风湿性关节炎、退行性变关节炎病人的标本蛋白质双向电泳图谱分析后发现在pH8.0-9.5之间、MW14.4-50KDa之间有明显差异.结论:类风湿性关节炎与其他关节炎关节滑液内IgG类蛋白有明显差异.
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吉兰-巴雷综合征相关空肠弯曲菌的蛋白质谱特征分析
目的分析吉兰-巴雷综合征(GBS)相关空肠弯曲菌(Cj)与非GBS相关Cj的蛋白质谱特征.方法利用双向电泳对这两类Cj各8株菌的全菌蛋白进行分离,比较蛋白质谱之间的差异,并对差异蛋白进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析.结果比较发现20个差异蛋白,质谱分析鉴定出17个蛋白质,包括wlaX蛋白,参与能量代谢的苹果酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、镍-铁还原酶小亚单位、半胱氨酸合成酶及支链氨基酸氨基转移酶,参与细胞加工处理过程的热休克蛋白、铁吸收ABC转运系统周质铁结合蛋白、烷基过氧化氢还原酶以及与细胞表面结构有关的鞭毛蛋白、UDP-N-乙酰烯醇式丙酮酸葡萄糖胺还原酶等.结论 wlaX蛋白可能与致GBS相关脂多糖的独特结构合成或细菌的毒力有关,wlaX蛋白及鞭毛蛋白有可能为GBS相关Cj的特征蛋白.
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胃癌相关幽门螺杆菌蛋白图谱特征初步分析
目的寻找幽门螺杆菌(Hp)与胃癌相关蛋白.方法利用双向电泳分离Hp的全菌蛋白,应用ImageMaster 2D v3.1软件对3株分离自胃癌患者的Hp菌株、1株胃癌动物模型菌株及9株分离自非胃癌患者的Hp菌株的蛋白图谱进行比较,对目的蛋白进行基质辅助激光解析及电离飞行时间质谱分析,应用Mascot软件进行蛋白搜库.结果发现3种蛋白可能与胃癌相关,经肽指纹图谱鉴定,一种为酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶,其Mowse分值为79,序列覆盖率为32%,另两种蛋白在现有的质谱库中无明确匹配蛋白存在.结论酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶可能为与胃癌相关的Hp特异蛋白,另两种为新发现的可能与胃癌相关的Hp特异蛋白,其相关机制尚待进一步阐明.
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光剥舌苔的差异蛋白质组学研究
目的 利用蛋白质组学方法,识别剥苔差异表达的蛋白质,为进一步探讨病理舌苔产生机制奠定基础.方法 运用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离正常组和剥苔组舌苔组织的总蛋白质、银染显色、凝胶扫描入计算机,ImageMaster 2D Platinum软件分析比较电泳图谱.应用图象分析软件比较分析,识别差异表达的蛋白质:应用质谱仪(mass spectrometry)得到相应的肽质指纹图谱(peptide mass finger print,PMF),搜索数据库鉴定差异蛋白质.结果 建立正常舌苔和剥苔双向凝胶电泳图谱;对四组舌苔组织的蛋白质组进行分离分析,发现凝胶中可检测的蛋白质斑点数分别为1082±105个和1143±140个:较正常组8个蛋白质点表达上调、7个表达下调,鉴定出9种差异表达蛋白质.结论 建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱;可识别和鉴定出一些与剥苔相关的差异表达蚩白质.
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大叶蛇葡萄蛋白质组双向电泳分析＊
目的：利用双向电泳法研究大叶蛇葡萄活性成分蛋白表达。方法：采用Tris饱和酚提取和醋酸铵甲醇沉淀大叶蛇葡萄嫩叶中的蛋白质；运用双向电泳法分离蛋白质，并对扫描后的二维凝胶电泳图谱进行分析，得到蛋白质表征图谱。结果：根据各个样品间蛋白点灰度值的比值差异，选择了差异较大的7个蛋白点进行质谱鉴定，鉴定了其中两种蛋白，分别为Hypothetical Protein和Unnamed Protein Product。结论：双向电泳技术的应用为从分子水平研究大叶蛇葡萄活性成分蛋白表达奠定了良好的基础。
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双向电泳分析快速老化痴呆鼠脑蛋白质的异常表达及针刺的影响
目的:从整体上观察快速老化及伴随的痴呆对脑蛋白质组的影响以及针刺对其的调节作用.方法:以8月龄快速老化痴呆鼠SAMP10和同源正常老化鼠SAMR1为材料,分为P10针刺组、P10非穴组、P10对照组和R1对照组.针刺组施以"益气调血,扶本培元"针法,针刺"膻中""中脘""气海""血海""足三里";非穴组针刺双胁下非穴固定点.双向电泳展示各组小鼠大脑蛋白图谱.结果:双向电泳显示,伴随着快速老化和痴呆,3个蛋白发生了质的变化,其中一个蛋白为P10所特有,两个为R1所特有;9个蛋白发生了量的变化,其中7个蛋白伴快速老化和痴呆高表达,2个低表达.针刺穴位具有良性调节作用,可明显改善上述某些蛋白的表达异常,减缓衰老;而非穴无特异性.结论:伴快速老化,SAMP10痴呆鼠大脑某些蛋白的表达发生了异常,针刺可改善其中某些蛋白的异常,并具有穴位特异性.
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桂枝汤对发热大鼠下丘脑蛋白质组影响初探
目的:初步观察桂枝汤对发热大鼠下丘脑组织中蛋白质的差异表达,为进一步探讨桂枝汤的解热分子机制奠定基础.方法:应用蛋白质组技术,对酵母发热大鼠模型和桂枝汤治疗组下丘脑组织中蛋白质表达进行比较,观察其差异点.结果:发现模型和治疗大鼠下丘脑蛋白表达有明显差异,主要是蛋白表达量的增加和减少以及个别蛋白等电点的改变,其中在给予桂枝汤后有8种蛋白(Mr/pI:28.9 kD/4.47,24.4 kD/6.28,25.4 kD/6.39,25.9 kD/6.39,17.6 kD/7.38,17.2 kD/7.43,24.9 kD/7.39,26.9 kD/7.59)表达增强,6种蛋白(Mr/pI:14.3kD/4.83,28.5 kD/4.39,16.2kD/4.11,15.3 kD/6.7,30.5 kD/7.09,30.5 kD/7.13)表达降低,1种蛋白(Mr/pI:14.8 kD/5.4)等电点发生了改变,差异蛋白数量约占可分辨蛋白点的2.3%,本次实验未发现新的差异蛋白点.结论:桂枝汤的解热作用可能与改变下丘脑组织中某些蛋白质的表达及修饰有关.
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葵瓜子仁蛋白实验室提取条件探讨
目的:探讨葵瓜子仁蛋白的实验室提取条件.方法:选取8种不同条件(P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8)提取葵瓜子仁蛋白,采用Bradford法测定蛋白质纯度,应用双向电泳对提取条件进行分析,通过二维电泳图谱确定佳提取条件.结果:8种条件下提取的葵瓜子仁蛋白干粉质量57.43 ～63.59 mg,差异无统计学意义,但P3,P4,P7,P8提取的蛋白质纯度显著高于其他4种条件,双向电泳结果显示P4,P8条件下蛋白点多,分别为(196±11),(194 ±20)个,但P4条件下得到的蛋白点更清晰.佳提取条件为提取温度50℃,提取溶剂为去离子水,超声提取时间20 min.结论:P4条件下得到的蛋白质总量和种类多,为植物蛋白的蛋白组学研究提供参考.
