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聚乙二醇修饰埃坡霉素B偶联物的合成及其体外抗肿瘤作用
目的 埃坡霉素B(EPOB)在治疗恶性肿瘤方面处于临床研究状态.为改善其水溶性,本文合成了聚乙二醇(PEG)修饰的EPOB偶联物PEG5000-EPOB和PEG20 000-EPOB.方法 采用N,N-二环己基碳二亚胺作为缩合剂,4-二甲氨基吡啶作为催化剂的酯化方法,将相对分子质量分别为5000和20 000的PEG-COOH与EPOB偶联.通过1 H NMR和MALDI-TOF-MS对合成产物进行结构表征.用UPLC测定产物在水中的溶解度.MTT法评价偶联物对人乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性.结果 结构鉴定表明,EPOB与PEG按照1∶1发生偶联且偶联位点是EPOB的7-OH.PEG5000-EPOB和PEG20 000-EPOB的溶解度分别为4.93×101和1.58 ×l0-2mol/L,与EPOB的溶解度1.4×10-3mol/L相比分别提高了35倍和11倍.EPOB、PEG5000-EPOB和PEG20 000-EPOB对人乳腺癌细胞系的IC50值分别为6.0×10-4、5.7×10-4和8.4 ×10-3 μmol/L.结论 PEG修饰EPOB后溶解度提高,且修饰后的化合物具有体外细胞毒性,为进一步的研究奠定了基础.
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聚乙二醇化重组人生长激素在大鼠体内的药代动力学研究
用125I标记示踪法研究大鼠皮下注射聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)药代动力学特征.大鼠sc PEG-rhGH后,测定血清PEG-rhGH浓度,用3P97程序拟和分析并计算药代动力学参数.大鼠sc PEG-rhGH 150、300或600μg.kg-1后,药物消除符合一房室模型.经与相关文献比较可知,生长激素经PEG化修饰后能延长其在体内的作用时间,达到长效目的.
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促红细胞生成素的研究进展
重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rHuEPO)已成功用于治疗肾性贫血20余年,但由于其半衰期相对较短,需要频繁注射给药,降低了病人的依从性.近10年来多种新型促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)制剂获批上市,促红细胞生成素仍是目前临床治疗肾性贫血的主要药物.目前长效促红细胞生成素的设计方法主要有增加糖基化位点、聚乙二醇修饰、构建融合蛋白和促红细胞生成素拟肽.本文综述了促红细胞生成素药物的发展、长效促红细胞生成素的设计方法及其新进展.
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新型Y型聚乙二醇-尿酸氧化酶修饰物的制备及免疫原性和生物活性评价
目的 制备一种新型支链(Y型)聚乙二醇(Y-shape polyethylene glycol,PEG)修饰的尿酸氧化酶,并对该修饰酶的体外酶活性和稳定性,在大鼠体内药效学、药动学和免疫原性进行评估,为其临床研究给药方案的设计和优化提供依据.方法 运用凝胶电泳、高效液相色谱技术研究聚乙二醇修饰产物的理化特征,采用酶反应-紫外分光光度法对酶生物活性进行检测,结合ELISA方法分析修饰酶的免疫原性.以大鼠为模型,研究不同聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶在体内的药动学.结果 Y型聚乙二醇尿酸氧化酶修饰物rUOX-mPEG2的表观相对分子质量比线性聚乙二醇修饰的产物rUOX-mPEG更大,聚乙二醇分子的修饰度更高,在相同温度和pH条件下的活性明显高于直链型聚乙二醇尿酸氧化酶修饰物.动物实验表明,该聚乙二醇-尿酸氧化酶修饰物在体内呈现良好的动力学特征,并在体内具有更长的药效维持时间.免疫原性实验结果也表明,Y型聚乙二醇修饰能有效降低免疫原性.结论 Y型聚乙二醇修饰尿酸氧化酶的酶学性质明显优于重组酶和直链型修饰的尿酸氧化酶,药效维持时间显著高于后者,免疫原性和国外品种采用的直链修饰尿酸氧化酶相当,且明显低于重组酶,在大鼠体内呈线性动力学特征.
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细胞因子聚乙二醇修饰物的研究进展
目的综述细胞因子聚乙二醇(PEG)修饰物的研究进展.方法通过查阅近年来国内外的相关文献,从制备、产物稳定性及药物动力学等方面进行了总结.结果与结论细胞因子聚乙二醇修饰物的稳定性与体内药动学特性均有改善,其生物活性的发挥则受多种因素的影响,但可通过定点选择性修饰、优化反应条件等手段提高PEG修饰物的生物活性.
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医药快讯
Pegylated Asparaginase用于儿童急性淋巴细胞白血病有获益
《柳叶刀肿瘤学》杂志于2015年12月第16卷第16期发布了一项关于比较静脉注射用 Pegylat-ed Asparaginase（参考译名：聚乙二醇修饰门冬酰胺酶）和肌内注射用原始大肠埃希菌门冬酰胺酶（通用名：Asparaginase ）用于新近诊断的儿童急性淋巴细胞白血病的芋期临床试验内容。 -
聚乙二醇化重组人生长激素对离体豚鼠乳头肌细胞动作电位的影响
目的 探讨聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)对离体豚鼠乳头肌细胞动作电位的影响,并以重组人生长激素(rhGH)为阳性对照物比较二者的体外生物活性.方法 健康雄性DHP豚鼠12只,随机分为2组,PEG-rhGH干预组和rhGH干预组,每组6只.采用累计给药法和给药前后自身对照方法,分别观察不同质量浓度(1、5、10、50、100、500、1 000μg/L)的PEG-rhgH和rhGH对豚鼠乳头肌细胞动作电位的效应,并比较两者效应的大小.以常规玻璃微电极技术记录和测量动作电位各参数,包括静息电位(RP)、动作电位振幅(APA)、动作电位复极50%时程(APD50)和动作电位复极90%时程(APD90).结果 PEG-rhGH和rhGH对RP、APA均无明显影响(P＞0.05),但浓度依赖性延长APD50和APD90,两者差异有显著统计学意义(P＜0.01),且APD50延长程度稍大于APD90.相同浓度的PEG-rhGH和rhGH对APD50和APD90的延长程度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 PEG-rhGH和rhGH均可延长离体豚鼠乳头肌细胞动作电位时程,以平台期为主,两者效应相近,PEG-rhGH具有与rhGH相似的体外生物活性.
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重组人复合干扰素的定点诱变及PEG化修饰
目的 将复合干扰素(consensus interferon,cIFN)76位点丙氨酸(Ala)突变为半胱氨酸(Cys),以期获得一种高效和可供聚乙二醇马来酰亚胺(PEG-MAL)定点修饰的IFN突变体分子.方法 采用同源序列对比、空间结构模拟并结合IFNα与受体结合的特点设计突变位点.通过基因工程方法获得cIFNm76工程菌,IPTG诱导表达,所得包涵体经变复性、DEAE阴离子及CM阳离子两步交换层析纯化后,采用SDS-PAGE和高效液相色谱法(HPLC)检测cIFNm76的纯度;细胞病变抑制法检测其体外抗病毒活性;REFLEXTMⅢ基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)测定其相对分子质量;SDS-PAGE分析cIFNm76与PEG-MAL的交联反应;并进行N-末端、C-末端序列测定及紫外光谱扫描.结果 cIFNm76以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30％以上,纯度大于95％,比活性约为1.08×108 IU/mg,N-末端、C-末端氨基酸序列与理论一致,相对分子质量经MALDI-TOF-MS测定为19 500,紫外特征吸收波长为280 nm,与PEG-MAL成功交联.结论 成功获得一种高效和可供PEG-MAL定点修饰的cIFNm76,解决了现有PEG定点修饰技术存在的问题.
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干扰素聚乙二醇修饰的研究进展
干扰素(Interferon,IFN)是一类具有抗病毒、免疫调节、抑制细胞增殖等多种生物活性的细胞因子,而体内循环半衰期短限制了其在临床上的应用.聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)修饰可以有效地改善干扰素的理化性质和生物学特性,延长体内循环半衰期.本文综述了聚乙二醇修饰干扰素的研究进展,着重介绍了聚乙二醇修饰化学的发展,α、β、γ干扰素各自不同的聚乙二醇化学修饰方法,并对聚乙二醇化干扰素的发展趋势进行了展望.
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蛋白质、多肽类药物聚乙二醇修饰的研究进展
随着基因工程技术的发展,蛋白质、多肽类药物的临床应用越来越受到重视.但蛋白质、多肽类药物的免疫原性和毒副反应及半衰期短等问题限制了其应用和发展.聚乙二醇( Polyethylene glycol,PEG)能够使蛋白药物溶解行为改善,稳定性增强,免疫原性消除或降低,循环半衰期延长,药代动力学优化,在生物技术和生物医学中具有广泛的应用前景.本文就蛋白质、多肽类药物的PEG修饰、修饰技术的发展、修饰的主要途径以及PEG修饰药物的现状及前景作一综述.
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集成干扰素突变体的构建、表达及纯化
目的 构建高效且可供单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-MAL)定点修饰的集成干扰素突变体(IIFNm108),并进行表达、纯化及鉴定.方法 采用同源序列对比、空间结构模拟并结合α干扰素与受体结合的特点设计突变位点.用重叠延伸PCR法,扩增IIFNm108基因,与pET-23b载体连接,构建重组表达质粒pET-23b-IIFNm108,转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,所得包涵体经变性、复性、DEAE阴离子交换及凝胶过滤两步层析纯化后,进行各项鉴定.结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确.目的 蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上,主要以包涵体形式存在.纯化的IIFNm108蛋白纯度大于95%,比活性约为(2.08±0.17)×108 IU/mg,N-端、C-端氨基酸序列与理论一致,相对分子质量为19 500,可与mPEG-MAL成功交联.结论 已获得一种高效且可供mPEG-MAL定点修饰的集成干扰素突变体IIFNm108.
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聚乙二醇衍生物及其蛋白药物修饰研究进展
聚乙二醇及其衍生物因其出色的亲水性、生物相容性、生物学惰性等特性而被广泛应用于蛋白药物修饰,其修饰可有效降低蛋白药物的免疫原性并延长体内半衰期.聚乙二醇衍生物的发展经历了第一代随机修饰,第二代特异性和功能性修饰,以及第三代分支型结构的应用.其应用也从简单的药物修饰扩展到生物传感、药物传输等方面.
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聚乙二醇修饰降纤酶的遗传毒性评价
目的 检测聚乙二醇修饰降纤酶的遗传毒性.方法 应用鼠伤寒沙门菌回复突变试验(Ames试验)、体外培养CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验检测聚乙二醇修饰降纤酶的遗传毒性.结果 Ames试验结果显示每平皿100、20、4、0.8、0.16 U各个剂量组,在加或不加S9代谢活化系统时对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535所诱发的回复突变菌落数均与溶剂对照的突变菌落数相近.体外培养CHO细胞染色体畸变试验结果显示2.5、5.0和10.0 U·mL-1各个剂量组在加S9代谢活化系统于24h和不加S9代谢活化系统于24h、48 h培养的CHO细胞染色体畸变率与溶剂对照组比较均无显著差异(P＞0.05).小鼠骨髓微核试验显示425、850、1700 U· kg-1各个剂量组对ICR小鼠的微核诱发率与溶剂对照组比较均无显著差异(P＞0.05).结论 聚乙二醇修饰降纤酶对鼠伤寒沙门菌无致突变性,对哺乳动物培养细胞的染色体无致畸变作用,对ICR小鼠无诱发骨髓嗜多染红细胞微核的效应.表明聚乙二醇修饰降纤酶在本实验条件下无遗传毒性.
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PEG化聚乙烯亚胺作为非病毒基因给药载体的研究
采用不同比例的单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基丙酸盐(mPEG-SPA)对支链聚乙烯亚胺(PEI)进行修饰,考察了不同接枝率的mPEG-PEI与DNA复合物的粒径、ζ电位、包封率,及其对A549细胞的转染效率和细胞毒性.体外转染试验表明,低PEG接枝率的PEI转染效果与PEI相当,且细胞毒性大大降低.
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PEG修饰蒿甲醚纳米结构脂质载体在大鼠体内的药动学
建立了液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠血浆中蒿甲醚及其活性代谢物双氢青蒿素的浓度.以未修饰的蒿甲醚纳米结构脂质载体(NLC)作对照,考察聚乙二醇(PEG)修饰体系(PEG-NLC)经尾静脉注射给药后在大鼠体内的药动学行为.结果显示,蒿甲醚及其代谢物双氢青蒿素在大鼠体内的药动学特征均符合双室模型.PEG-NLC组大鼠血浆中蒿甲醚的AUC0→t[(1 487.87±215.3 0)h·ng·ml-1]、t1/2(β)[(4.68±0.53)h]和MRT[(6.43±0.71)h]均显著大于NLC组[(1 054.11±192.95)h·ng·ml-1、(3.43±0.45)h和(4.67±0.5 4)h](P＜0.01);同时,双氢青蒿素的AUC0→t[(1 170.03±176.76) h.ng·ml-1]、t1/2(β)[(4.29±0.54)h]和MRT[(5.81±0.68)h]也均显著大于NLC组[(756.32±142.52)h·ng·ml-1、(2.71±0.44)h和(3.68±0.56) h] (P＜0.01).结果显示,与未修饰的蒿甲醚NLC相比,PEG-NLC静脉注射后可使蒿甲醚及其活性代谢物双氢青蒿素的血浆半衰期延长,血药浓度整体水平增加,血浆中的循环时间延长.
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白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的聚乙二醇修饰
为提高纤溶酶的临床适用性,采用4种针对氨基修饰的mPEG试剂--mPEG-SPA 5K、mPEG-SMB 5K、mPEG-ButyrALD 5K和mPEG2-NHS 40K修饰蛇毒纤溶酶,以获得高比例的单修饰产物和较高的酶活性保留率.优化修饰反应条件,用Superdex 75凝胶过滤色谱法分离纯化修饰产物.终确定mPEG-SPA 5K为适宜的修饰剂.产物经SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS法检测为单修饰,修饰产物酶活性收率为67.3%,修饰产物的热稳定性提高,免疫原性显著下降.
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聚乙二醇修饰人参皂苷Rg1与原人参三醇的制备及其在胃中稳定性
目的:对人参皂苷Rg1与原人参三醇进行聚乙二醇修饰和表征,并考察PEG修饰前后人参皂苷Rg1在胃中的稳定性,比较修饰前后的变化.方法:选择单甲氧基聚乙二醇2000为原料,经过与丁二酸酐的催化酯化反应活化为单甲氧基聚乙二醇2000 -琥珀酸单酯后,再分别与人参皂苷Rg1和原人参三醇分子耦联,并采用核磁共振等方法来表征合成产物；以大鼠为实验动物,采用UPLC方法分析样品,分别考察人参皂苷Rg1与PEG-Rg1在离体胃中的稳定性情况,并对修饰前后的变化进行比较.结果:成功合成了原人参三醇与人参皂苷Rg1的聚乙二醇修饰产物,产率分别为16.2％和17.5％；人参皂苷Rg1在胃中容易降解,2h时降解73.2％,PEG-Rg1在2h时仅降解18.2％,稳定性提高.结论:成功合成了人参皂苷Rg1与原人参三醇的聚乙二醇修饰产物.修饰之后可以大大提高人参皂苷Rg1在胃中的稳定性.
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人胰岛素的酶促聚乙二醇修饰
为开发一种新的胰岛素聚乙二醇修饰方法,以人胰岛素为原料,用羧肽酶A切掉其B链C末端的苏氨酸残基,得到去掉B30的胰岛素(des-B30-insulin),然后在有机相中,使用胰蛋白酶做催化剂,将一个连有聚乙二醇链的苏氨酸衍生物链接到des-B30-insulin上,得到一种新的聚乙二醇-胰岛素轭合物.该方法的特点是聚乙二醇通过酶促反应被定位连接在人胰岛素的B链C末端氨基酸上,形成了一种新型的聚乙二醇-胰岛素轭合物.生物活性的测定表明该轭合物具有极好的胰岛素活性保留,并具有潜在的长效功能.
关键词： 人胰岛素 聚乙二醇修饰 酶促 聚乙二醇-胰岛素轭合物 -
聚乙二醇化蛋白质阳离子树脂色谱行为的研究
以溶菌酶(LYS)作为模式蛋白,对聚乙二醇化蛋白质在不同阳离子交换填料中色谱行为进行了比较研究.考察了不同分子质量的聚乙二醇化溶菌酶(PEG-LYS)在4种阳离子树脂中的动态载样量的差异,同时比较了不同上样量对纯度和洗脱盐浓度的影响.研究结果显示PEG修饰能降低蛋白质和离子交换树脂的结合力,且随着PEG的分子质量的增加,PEG-LYS动态载样量降低.对相同分子质量的PEG-LYS,产物纯度以及PEG-LYS的洗脱盐浓度随着上样量的增加而降低,研究结果显示,PEG分子质量和上样量对纯化工艺的研究有重要意义.
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中华眼镜蛇蛇毒组分SDM的聚乙二醇修饰与免疫原性相关性研究
对中华眼镜蛇蛇毒抗肿瘤活性组分SDM进行PEG修饰,考察其免疫原性.SDM与分子质量分别为5 k、10 k和20 k的PEG按摩尔比1:4混合,在20℃、pH 8.0的0.02 mol/L磷酸缓冲液中反应4 h.其修饰度分别为50.3%.46.8%,40.6%.C57BL/6小鼠免疫实验表明SDM经PEG修饰后免疫原性显著降低,诱导抗体的能力SDM204＜SDM054＜SDM104.SDM204抗体诱导能力为SDM的1/640;豚鼠全身过敏性实验表明SDM经PEG修饰后诱发过敏性反应级数显著降低,其中以SDM204为显著.实验结果表明,经PEG修饰的SDM免疫原性明显下降.
