首页 > 文献资料
-
哺乳动物中介导RNA干扰的载体研究进展
RNA干扰是指利用双链RNA诱导同源靶基因的mRNA降解,从而抑制特异基因表达的过程.近年来,RNA干扰技术作为一种工具在哺乳动物基因功能研究方面发展十分迅速.本文综述了有关在哺乳动物中介导RNA干扰的载体研究新进展及其应用.
-
新型非病毒载体O-CHCS携带HBD2转染L929细胞及表达产物活性检测
目的 研究O-胆甾醇基壳聚糖(O-CHCS)作为基因载体进行人β防御素-2(HBD2)基因转染小鼠纤维母细胞L929的可行性及检测目的 基因表达产物的生物活性.方法 构建重组质粒pCMV-hBD2,通过O-CHCS介导转染于L929细胞,提取转染细胞总RNA,用RT-PCR检测HBD2基因转录水平;收集转染细胞培养上清液,用Westernblotting检测HBD2基因蛋白的表达;用Kirby-Bauer纸片法检测HBD2抗菌活性,同时以Lipofect脂质体转染试剂作为阳性对照.结果 经过O-CHCS介导转染的L929细胞,目的 基因HBD2在转录水平和蛋白水平均有表达,转染细胞上清液对金黄色葡萄球菌有抑菌圈形成,结果同Lipofect的转染效果基本一致.结论 成功构建了真核表达载体pcMV-hBD2,证实了O-CHCS可以作为基因载体用于目的 基因HBD2的转染,且目的 基因表达产物具有生物活性,为基因工程合成HBD2提供一条经济便捷的途径.
-
非病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达
为了观察非病毒载体pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因在小鼠32D细胞系中的表达,将B结构域缺失(△760aa-1639aa)的人FⅧcDNA(hFⅧBDcDNA)亚克隆至质粒载体pRC/RSV,构建重组质粒载体pRC/RSV-hFⅧBDcDNA.经SuperFeot Transfection Reagent转染小鼠32D细胞系,分别采用一期法、ELISA法和RT-PCR检测细胞培养上清液中人FⅧ的促凝活性(hFⅧ:C)和抗原含量(hFⅧ:Ag)以及细胞中hFⅧBDcDNA的转录.结果表明:小鼠32D细胞系培养上清液中的人FⅧ:Ag高达到了450.08毫微克/(106细胞·24小时),hFⅧ:C高达到了2.01单位/(106细胞·24小时),RT-PCR可检测到32D细胞中hFⅧBDcDNA转录的mRNA.结论:非病毒质粒载体pRC/RSV介导的人凝血因子Ⅷ基因能够在小鼠32D细胞系中表达人FⅧ蛋白,所表达的FⅧ与正常人血浆中的野生型FⅧ具有相似的凝血活性.
-
DNA疫苗非病毒载体的研究进展
DNA疫苗(DNA vaccine)又称为核酸疫苗或基因疫苗,是将编码特异性抗原的基因构建在表达性质粒中,经某种方法导入体内后,利用宿主细胞表达系统合成相应的病原体蛋白,诱导机体产生免疫应答以达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗自1990年发现以来,因具有良好的安全性及可诱导广泛的体液免疫和细胞免疫,已越来越受到人们的关注,是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗,在人和动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫病及肿瘤性疾病等领域发挥作用.
-
miRNA体内转染的研究进展
微小RNA（ MicroRNAs，miRNAs）是一种内源性非编码 RNA，主要参与基因转录后水平的调控。虽然miRNA的生物学功能刚刚被人们熟知，它在疾病的发病和进展中所显现的治疗潜力已引起人们极大的兴趣。越来越多的证据表明，以miRNA为基础的基因治疗，不管是增强或抑制miRNA的表达和活性，都有很大的应用前景。但是靶向特定器官和组织特异性差的缺点，使得其应用于临床还存在限制。这些限制包括基因传递的障碍，比如在体内稳定性差，分布不均匀，生物分布不合理，易被降解，内源性 RNA 饱和以及不良的副作用等。近年来开发的病毒载体和非病毒载体可以克服这些障碍。病毒载体是高效的基因转染载体，但其毒性和免疫原性限制了在临床上的应用。本文中，我们回顾了近的基因载体进展，探讨miRNA非病毒载体的输送机制和策略，为以miRNA为基础的基因治疗提供一个新的视角。
-
多功能靶向纳米载体的制备及其对神经母细胞瘤的靶向性和MRI示踪性观察
目的 制备集靶向siRNA传递及MRI显像功能于一体的多功能靶向纳米载体,并验证其对神经母细胞瘤的靶向性及MRI示踪性.方法 制备PEG-PEI-SPION,scAbGD2 -PEG-PEI-SPION并检测其基本特性.利用凝胶阻滞检测纳米载体与siRNA的复合能力；以CLSM及MRI验证纳米载体的靶向性.结果 PEG-PEI-SPION,scAbGD2-PEG-PEI-SPION平均粒径分别为(60.0±2.3)nm及(90.0±7.8)nm.氮磷比(N/P)≥2.2时siRNA与PEG-PEI-SPION,scAbGD2 -PEG-PEI-SPION完全复合.CLSM实验及MRI结果证实scAbGD2-PEG-PEI-SPION具有靶向性.结论 scAbGD2-PEG-PEI-SPION对神经母细胞瘤具有靶向传递siRNA及MRI显影的功能.
-
神经营养素-3基因修饰嗅鞘细胞移植对急性脊髓损伤作用的实验研究
目的:观察神经营养素-3(NT-3)基因转染嗅鞘细胞(OEG)移植对急性大鼠脊髓损伤的作用.方法:将自行构建的质粒pEGFP-NT3应用脂质体介导的方法导入体外培养的嗅鞘细胞,并移植入急性脊髓损伤大鼠体内,连续观察12周,与接受单纯OEG、空白质粒转染OEG移植的脊髓损伤大鼠进行比较.结果:移植转染pEGFP-NT3后的OEG能在体内长期存活,表达NT-3基因,与对照组比较能更好地促进脊髓损伤区轴突的再生和后肢功能的恢复.结论:OEG是脊髓损伤基因治疗较好的受体细胞.转染NT-3基因的OEG移植后可以在体内较长时间存活,能明显促进急性脊髓损伤神经纤维的再生和功能恢复,为基因修饰嗅鞘细胞在脊髓损伤治疗中的应用提供了实验和理论依据.
-
磁感应纳米基因靶向治疗方法的研究与展望
磁感应纳米基因靶向治疗方法是一种联合磁感应热疗和热诱导基因治疗的综合肿瘤治疗方法.磁性纳米颗粒既是磁感应热疗的核心介质,也可以作为肿瘤基因治疗的非病毒载体.
-
基因治疗在创伤愈合中的应用
创伤修复是一个复杂的生物学过程,各种生长因子、炎症介质等在创面愈合过程中扮演着重要角色.基因治疗是现代生物治疗的一项重要技术,在创伤修复,尤其是难愈性创面的治疗中具有广阔的应用前景.基因治疗分为病毒载体导入系统(逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒相关病毒等)和非病毒载体导入系统的基因感染(直接注射、显微注射、基因枪、电穿孔、脂质体和脂质体复合物、阳离子多聚物等).本文对创伤修复及基因治疗在该领域的应用进行文献综述.
-
非病毒性基因治疗递送载体(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k的构建及性能研究
目的 构建非病毒性基因治疗递送载体(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k,探讨其细胞毒性及对质粒基因(pDNA)的递送性能.方法 通过开环聚合反应制备共聚物mPEG5k-PCL1.2k-OH,将其羟基末端化学转化为N-羟基琥珀酰亚胺(-NHS)生成mPEG5k-PCL1.2k-NHS,随后同枝化PEI10k进行反应生成三元共聚物(mPEG5K-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k.应用傅立叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振(NMR)和凝胶渗透色谱对(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k进行结构表征分析;通过MTT分析,比较(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10K与PEI10k的细胞毒性;通过复凝聚法制备(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10K/pDNA复合物;通过细胞转染实验,观察不同质量比的复合物转染细胞后报告基因的表达效果,考察转染时间和培养基pH值对报告基因表达的影响.结果 成功合成了递送载体(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k.浓度小于62.5g/ml时,(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k的细胞毒性显著小于PEI10k.(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k载体能够压缩绿色荧光蛋白质粒报告因(pEGFP)形成(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k/pEGFP复合物,并有效转染细胞获得目的 基因表达;当载体与质粒的质量比为10∶1时,绿色荧光蛋白的表达效果好.转染时间和培养基pH值均可影响(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k/pEGFP的转染效率,转染效率在48h优于24h和72h,pH 6.8培养基优于pH 7.2培养基.结论 递送载体(mPEG5k-PCL1.2k)1.4-g-PEI10k细胞毒性较低,能够递送pDNA进入细胞并表达目的 蛋白.
-
siRNA抑Smad4或Runx2基因表达治疗大鼠异位骨化效果比较
目的:研究siRNA抑制Smad4基因表达治疗异位骨化大鼠模型的效果,并与抑制Runx2的疗效进行比较.方法:1、设计6条分别针对大鼠Smad4和Runx2的mRNA模板,用体外转录合成法分别合成6条siRNA,采用RT-PCR从mRNA水平在培养的原代成骨前体细胞中筛选有明显抑制作用的siRNA.2、设计合成针对Smad4基因和Runx2基因编码的发卡样siRNA的双链DNA,与腺病毒的穿梭质粒连接后,取其启动子和终止子连接于非病毒载体上.在培养的大鼠原代成骨细胞中,采用RT-PCR和western blot测定Smad4特异性siRNA非病毒对Smad4的抑制作用和Runx2特异性siRNA非病毒对Runx2的抑制作用.3、采用体内实验测定Smad4或Runx2特异性siRNA非病毒载体对切断大鼠跟腱诱导异位骨化动物模型的影响:实验组行跟腱切断术和植入100μg的Smad4-siRNA或Runx2-siRNA重组非病毒载体,对照组行跟腱切断术和植入100 μg的pcDNA4/HisA非病毒载体.10周后,行CT三位重建检测形成的异位骨大小,HE染色观察其组织形态.结果:1、在合成的3条Smad4-siRNA中,siRNA<'139-159>对Smad4抑制效果明显,在合成的3条Runx2-siRNA中,siRNA<'1057-1077>对Runx2的抑制效果明显.2、成功构建重组非病毒载体,转染原代成骨细胞可明显抑制Smad4和Runx2的表达.3、CT_E位重建显示,Smad4-siRNA实验组形成的异位骨体积较对照组减小92%,Runx2-siRNA实验组形成的异位骨体积较对照组减小93%,差异均有统计学意义(P<0.05).组织学观察显示非病毒载体介导的特异性[Smad4-siRNA和Runx2-siRNA在体内可以抑制异位骨形成,两者之间的抑制效果差异无统计学意义(P>0.05).结论:Smad4和Runx2两种信号通路的特异性siRNA可以明显抑制切断跟腱诱导的异位骨化,但两种不同siRNA的抑制效果无差别.
-
脑靶向非病毒基因递释系统的研究进展
脑靶向非病毒基因递释系统可有效介导基因药物跨越血脑屏障,到达病变部位发挥疗效,已成为研究热点之一.多项研究结果显示,通过适当机制如配体.受体特异性结合作用可显著提高非病毒基因递释系统在脑部的蓄积量,从而提高所携带外源基因在脑部的表达量.本文主要从受体介导和吸附介导两种机制入手,综述脑靶向非病毒基因递释系统的新研究进展.
-
基因治疗中非病毒载体的研究进展
基因治疗中非病毒载体具有病毒载体无法比拟的优点,目前主要包括聚合物、微粒系统和肽介导的载体,连接配体以后可以靶向性传释基因,本文就其近年来的研究进展作一综述.
-
癌基因治疗传递系统研究的新进展
基因治疗的主要目的是开发和利用高效无毒的基因载体,包裹和传递外源性基因材料到靶细胞.病毒型基因载体包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒相关病毒和痘病毒,基因传递效率高,但安全性差和基因载量低.非病毒载体包括阳离子聚合物、阳离子多肽和阳离子脂质体,基因传递效率比病毒载体低,但更安全、制备简单、基因包裹率高.
-
新型非病毒载体聚乙烯亚胺体内应用的研究进展
聚乙烯亚胺是1995年发现的重要的真核细胞基因转染载体,在非病毒载体的研究中处于重要的地位.聚乙烯亚胺体外研究已取得显著的进展,但在体内基因治疗的应用面临着一系列局限.本文综述了非病毒载体聚丙烯亚胺体内应用的障碍和克服办法,包括聚乙烯亚胺-DNA复合物的脂质体包裹或聚乙二醇化修饰等.
-
小干扰RNA治疗药物载体递送技术研究进展
RNA干扰(RNAi)是一种控制靶基因表达的序列特异性调控机制.体内外研究结果表明,RNAi技术的应用对多种疾病治疗有巨大的前景,其瓶颈在于如何将基于RNAi的药物有效递送至靶细胞或靶组织.常用的载体递送系统可分为病毒载体系统和非病毒载体系统.研究载体递送系统需重点考虑的因素有脱靶效应、递送方式、免疫反应诱导及剂量等.如果这些关键问题能够解决,将大大增加RNAi成为治疗药物的可能性.
-
脑靶向基因转运免疫脂质体的制备
构建一种高效的可以携带外源基因通过静脉注射的方式、透过血脑屏障进入脑内特异性表达目的蛋白的非病毒载体.通过不同比例的配比.对免疫脂质体合成过程中油相种类和油水比例、磷脂和胆固醇比例、旋转蒸发温度、超声温度和时间进行筛选优化,测定免疫脂质体的包封率和抗体偶联率.将包裹LacZ基因的免疫脂质体经尾静脉注射至大鼠体内,通过组织化学染色检测LacZ基因在大鼠体内的表达情况,验证合成的免疫脂质体是否可以转运外源基因跨过血脑屏障进入脑内表达.免疫脂质体合成的佳比例为磷脂-胆固醇为1∶1;脂药比为100∶1;油相种类为二氯甲烷,油水比例为4∶1;旋转蒸发温度为30℃;超声温度为10℃;超声时间为5 min,10%海藻糖可以增加免疫脂质体的稳定性.脂质体的包封率为87.24%,抗体偶联率为69%.将免疫脂质体通过尾静脉注射到大鼠体内后观察到LacZ基因在脑内及周围器官的表达.因此,通过工艺优化可以得到携带外源基因的免疫脂质体,其可以通过静脉系统跨过血脑屏障进入脑内并且表达,为实现颅内疾病的基因治疗奠定了基础.
-
眼部疾病的基因治疗与递送策略
眼睛独特的生理构造使其在基因治疗方面彰显出明显的优势.近年来,越来越多治疗眼部疾病的基因药物进入临床试验,其中大部分是以腺相关病毒作为递送载体,通过局部注射途径给药,存在一定的风险.针对各种眼部疾病,传统的无创治疗手段如眼表滴入或全身给药虽能够达到一定的治疗效果,但是对于眼内和眼后段疾病,即使小分子药物也难以到达,这使得对基因药物眼部递送策略的研究迫在眉睫.为了更好地了解基因治疗眼部疾病的新热点,本文介绍了相关的疾病与基因药物,总结了眼内基因递送的途径与吸收屏障,并侧重介绍了近年来报道的基因递送策略.克服眼部的吸收屏障并降低给药的潜在风险,有望为眼部基因治疗的临床应用带来曙光.
-
siRNA非病毒递送载体的研究现状
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年发展起来的一种新技术.RNAi是指通过外源性或内源性的双链RNA在体内诱导靶基因mRNA产生特异性降解,进而引起不同水平的基因沉默.RNAi已经用于肿瘤、病毒感染、乙型肝炎等多种疾病的治疗.小干扰RNA(siRNA)是RNAi的效应分子,可在体内诱导RNAi效应.但是裸siRNA在体内容易被核酶(RNase)降解,且半衰期短,转染效率低.因此,siRNA需要借助递送载体进入细胞发挥治疗作用.病毒载体在基因治疗中有潜在的免疫原性、致突变等副作用.所以,非病毒载体成为当前的研究热点.本文对siRNA非病毒递送载体的研究现状进行了综述.
-
阳离子聚合物基因载体的研究进展
与病毒基因载体相比，非病毒基因载体具有毒性低、免疫原性小、结构改造可实现基因靶向递送、可重复应用等优点。而其中阳离子聚合物能够与基因形成稳定复合物，促进细胞对复合物的内吞，受到越来越广泛的关注。本文主要从修饰方法以及靶向传递等方面介绍了阳离子聚合物在基因传递方面的应用。
