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利用体外靶点效率检测指导丹参SmPAL1基因的CRISPR/Cas9载体构建
为定向编辑丹参苯丙烷代谢途径中关键酶基因SmPAL1构建CRISPR/Cas9载体,通过在线软件设计CIRSPR/Cas9靶位点,采用体外酶切法进行体外靶点效率检测,筛选活性高的序列,构建到CRISPR/Cas9载体中.设计了3个可能的CRISPR/Cas9靶位点(SmPAL1-g1,SmPAL1-g2,SmPAL1-g3),通过体外靶点效率检测,其活性分别为53.3％,76.6％,10.0％,将筛选出活性较高的2个靶位点SmPAL1-g1和SmPAL1-g2构建到载体VK005-03中并命名为VK005-03-g1和VK005-03-g2.测序结果显示,设计的2个CRISPR/Cas靶位点全部插入到VK005-03中,载体构建成功.
关键词： 丹参 苯丙氨酸解氨酶 CRISPR/Cas9 基因编辑 靶点效率检测 -
中国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gei/07-30磷蛋白基因的分子特征及其编码蛋白特性分析
对我国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30进行磷蛋白基因序列测定,并进行分子生物学特征分析.首先应用逆转录聚合酶链式反应扩增出病毒磷蛋白基因片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析.小反刍兽疫病毒china/Tib/Gej/07-30磷蛋白基因由1 655个核苷酸组成,编码2个相互交叠的开放阅读框(0RF).第一个ORF长度为1530个核苷酸.编码的P蛋白长度为509个氨基酸.第二个ORF长度为534个核苷酸,编码的C蛋白长度为177个氨基酸.第一个ORF通过基因编辑在751位插入1个G核苷酸,转录生成第二个mRNA,长度为897个核苷酸,编码的V蛋白长度为298个氨基酸.小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的P蛋白与其他分离株氨基酸序列同源性为86.1%～97.3%,C蛋白氨基酸序列相似性为84.3%～94.9%,V蛋白为82.9%～96.3%.China/Tm/Gej/07-30的P蛋白第315～387位氨基酸是一段高度保守的七肽重复序列.
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CRISPR-Cas9系统在真核细胞领域内的研究进展
CRISPR-Cas免疫系统在天然状态下保护细菌和古生菌免受外来质粒或噬菌体的入侵.研究者们根据Ⅱ型CRISPR-Cas系统开发了全新的基因编辑工具——CRISPR-Cas9,它利用与靶序列互补的向导RNA引导Cas9酶定点切割DNA,该技术具有设计简单、操作方便、特异性强、效率高等优势,成为新一代基因组编辑技术.本文综述了CRISPR-Cas系统的技术发展史、新分类和作用原理,重点介绍了近几年来CRISPR-Cas9系统应用于真核细胞领域的研究进展.
关键词： CRISPR-Cas9系统 真核细胞 基因编辑 基因调节 -
CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展
CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域.该系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑.脱靶效应和编辑效率是该系统面临的两大问题.目前已有诸多研究从减少脱靶效应和提高编辑效率的方面对该系统进行优化,将有助于其安全性的提升及应用范围的拓展.
关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑 脱靶效应 编辑效率 -
人类胚胎基因编辑研究引发的伦理思考
随着人类胚胎基因编辑的研究被首次公开发表,科学界和伦理学界对此类研究是否符合伦理存在巨大争论.本文以此为切入点,梳理各方观点,并通过对基因编辑技术的伦理学分析,得出如下结论:不应禁止人类生殖系基因编辑的基础研究,而当先将此技术应用在临床实践中仍为时尚早.
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CRISPR-Cas9技术的发展与临床应用前景
CRISPR-Cas系统作为细菌、真菌体内的适应性免疫系统用以抵御外来噬菌体的感染.经过改造的CRISPR-Cas9已成为继ZFN、TALEN之后的第三代基因编辑技术.在CRISPR-Cas9基础上衍生的CRISPRi、CRISPRa等系统可以实现暂时抑制、激活或改变基因表观遗传学修饰的功能.相比传统基因编辑技术,CRISPR-Cas9具有效率高、操作简便、价格低等优势,因而在基因制备动物模型,治疗感染性疾病、遗传性疾病以及癌症等方面均有广阔的应用前景.本文主要对CRISPR-Cas9技术的发展与临床应用进展进行综述.
关键词： CRISPR-Cas9 基因编辑 临床应用前景 -
CRISPR/Cas基因编辑技术及其在血液系统疾病中的应用
CRISPR/Cas基因编辑技术是近年来新兴的对特定位点进行基因编辑的技术,利用CRISPR/Cas系统在某一特定位点导入目的基因,可以使有基因缺陷的细胞恢复正常功能,也可以在正常细胞内导入疾病相关基因从而构建相应疾病模型.CRISPR/Cas技术具有精确的打靶作用,作为基因剪切和编辑工具而广泛应用于各种实验,能够帮助深入研究基因功能以及治疗遗传性疾病.目前,CRISPR/Cas技术正成为农业、畜牧业、生物技术及医学领域的研究热点,本文就CRISPR/Cas系统在血液系统疾病中的新研究进展作一综述.
关键词： CRISPR/Cas 基因编辑 白血病 贫血 血友病 -
CRISPR/Cas9系统及其在血液病基因治疗中的研究进展
近年来随着基因编辑技术的兴起,可以实现对基因组中特定的基因进行编辑,使基因突变性疾病的治愈成为可能.在众多基因编辑技术中,CRISPR/Cas9系统因其操作简便性、靶向特异性、经济性等特点备受关注,已广泛应用于分子生物学以及生命科学的领域研究中.本文就此系统结构、作用机制以及在血友病、β-地中海贫血、慢性髓系白血病等血液病中基因治疗的新研究进展作一综述.
关键词： CRISPR/Cas9 血友病 β-地中海贫血 慢性髓系白血病 基因编辑 -
Cas9稳定表达人肿瘤细胞株的建立及其基因编辑活性
目的：建立多种Cas9蛋白稳定表达的人肿瘤细胞株，验证细胞中Cas9的基因编辑活性，方便后续研究中目的基因的编辑。方法在15种来自不同组织的人肿瘤细胞株中通过慢病毒感染pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo或pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro及克隆筛选的方式建立Cas9稳定表达的细胞株；在其中3个细胞株中瞬时转入靶向TSC22基因的向导RNA，挑选单克隆，通过基因组PCR、测序及Western blot检测Cas9蛋白的基因编辑活性。结果筛选得到了69株Cas9稳定表达的人肿瘤细胞株，瞬时转入向导RNA后成功造成了细胞中TSC22基因的大片段缺失。结论成功建立了69株Cas9稳定表达的人肿瘤细胞株，其中的Cas9蛋白具有基因编辑活性。这些细胞株在大规模药物筛选、新药作用靶点的筛选以及基因功能研究等方面有潜在应用价值。
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规律簇集间断的短回文重复序列及其相关核酸酶9系统应用于糖尿病领域的研究进展
规律簇集间断的短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统是一种新型的基因编辑工具,可同时研究多个基因的功能及相互关系,已在多种疾病中显示出巨大的潜在价值.与其他基因编辑技术,如锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9更简单、高效.随着CRISPR/Cas9系统技术的广泛应用,在糖尿病领域有不少相关研究出现.本文从基础到临床对CRISPR/Cas9在糖尿病领域的研究进展作文献回顾,期待为相关人员提供参考.
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基因修饰猪在异种器官移植中的研究进展
器官移植是治疗终末期器官衰竭的有效手段,但供器官严重匮乏已成为器官移植发展的大障碍,异种器官移植为解决这一问题开辟了新思路.猪在遗传学、解剖学及生理特性等方面与人具有较大的相似性,因此被认为是异种器官移植理想的供体来源.随着基因编辑技术的发展,基因修饰猪在异种器官移植领域中的研究与应用已取得较大进展.本文就基因修饰猪在猪-灵长类动物异种器官移植中的研究与应用进行综述.
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Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株的建立
目的 建立Cas9蛋白稳定表达的人肝胆癌细胞株,并验证Cas9的基因编辑活性,以便利用CRISPR/Cas9系统开展肝胆细胞基因编辑的研究.方法 在人肝癌细胞(Huh7、PLC/PRF/5、HepG2、Hep3b、SK-HEP-1和Li-7)、人胆管癌细胞(RBE)和人胆囊癌细胞(GBC-SD)中,分别感染Cas9表达质粒pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo、pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro和Cas9m1.1,挑选单细胞克隆培养扩增.提取基因组DNA和总蛋白后,通过基因组聚合酶链反应(PCR)和Western blot验证Cas9的稳定表达.选取其中3个细胞株并感染Lv-EF1α-mCherry,流式细胞术分选出mCherry阳性的细胞,再通过慢病毒感染靶向mCherry基因的向导RNA,细胞扩增后,通过基因组PCR、荧光显微镜下观察和流式细胞术检测mCherry被敲除的情况.结果 筛选到100个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株,其中表达Cas9-Neo的细胞35株,表达Cas9-Puro的细胞25株,表达突变型Cas9的细胞40株.建立了3株mCherry稳定表达的细胞系Huh7-mCas9-M、PLC/PRF/5-Cas9-M和SK-HEP-1-Cas9-M.基因组PCR和测序显示,同时感染2种gRNA的细胞基因组内存在mCherry片段缺失.荧光显微镜下,同时感染2种gRNA的细胞可以观察到mCherry-EGFP+细胞.流式细胞仪检测结果显示,mCherry-EGFP+细胞占0.3％～93.6％.结论 成功建立了100个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株,其中的Cas9蛋白具有基因编辑活性.
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单碱基编辑工具及在基因治疗中的应用及前景
随着CRISPR/Cas9基因编辑工具效率的提高,其应用范围逐渐从实验室扩展到临床,但CRISPR/Cas9进行基因修改的效率还不够高.单碱基编辑工具直接将一种碱基对永久转变成另一种碱基对,是一种不需要切开双链DNA的化学修复方法,可以高效地进行基因修复.尽管单碱基编辑工具研发时间不长,但是已经在基因编辑领域得到了广泛的应用,包括在小鼠内耳的基因编辑.单碱基编辑工具将是开展耳聋基因治疗的有效工具.
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基因编辑在眼部遗传性疾病中的研究进展及应用
基因编辑是一项应用核酸酶识别并剪切特异性基因组DNA序列,导致DNA双链断裂后利用细胞内的DNA修复途径,如非同源末端连接、同源定向修复等,插入、替换或删除靶基因的技术.人类遗传性眼病和有眼部表现的全身遗传性疾病有600余种,其中大部分病因尚未完全阐明且无有效治疗方法.应用基因编辑技术,靶向改变动物基因组,建立眼部遗传性疾病的动物模型,可以明确目标基因与疾病表型之间的关系,为研究遗传性眼病的发病机制提供了有效的方法.此外,通过基因编辑改变致病基因也为遗传性眼病的基因治疗带来了希望.本文对归巢核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9共4种基因编辑工具酶的分子特点进行综述,并总结现阶段基因编辑在遗传性眼病发病机制研究中的应用.
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鼠疫耶尔森菌基因组无痕修饰方法的建立
目的 构建鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)中基因组无痕修饰的技术平台,深入研究鼠疫菌相关基因的功能及作用机制.方法 通过不对称PCR扩增抗性盒片段(含修饰靶标区域上下游同源臂),将其导入含pKD46质粒的鼠疫菌中.在阿拉伯糖的诱导下,pKD46质粒可表达与同源重组相关的3个酶(Exo, Beta和Gam蛋白),诱导重组后再导入pKSI-1质粒与目的基因的重组载体,与抗性盒进行第二次同源重组.通过加入阿拉伯糖和IPTG诱导pREDTKI表达重组酶和I-SceⅠ酶,可对未发生重组的抗性盒片段和pKSI-1质粒上的I-SceⅠ位点酶切,从而起到消除抗性盒与质粒作用,达到无痕修饰的目的.结果与结论 成功构建了鼠疫菌的ΔwaaA和waaA(△9nt)两个突变株.根据不同的实验目的选择相应的基因敲除方法,得到的无痕修饰菌株为鼠疫菌相关基因的功能研究奠定了基础.
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关键词：
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤耐药研究中的应用进展
成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统是存在于细菌和古生细菌中的一种抵御外源DNA入侵的适应性免疫反应系统.与传统的锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样因子效应物核酸酶(TALEN)基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9操作更加简便、高效.目前,该技术已在肿瘤耐药研究中得到广泛应用,包括乳腺癌和白血病耐药等诸多方面.CRISPR/Cas9技术的应用虽仍存在脱靶效应等问题,但其应用前景非常广阔.本文就其在肿瘤耐药研究方面的应用进行综述.
关键词： 肿瘤耐药 CRISPR/Cas9 基因编辑 -
罕见病基因治疗的研究进展
罕见病因发病率低,治疗药物的市场需求低,导致其治疗药物的研发成本过高,相关治疗策略进展缓慢.近年来,随着分子生物学技术的发展和精准医疗概念的提出,基因治疗技术在遗传性罕见病的研究中取得了重大进展,其研究成果在罕见病的临床诊断、药物研发和治疗中发挥着重要作用,为彻底治愈疾病提供了可能.本文综述了基因治疗的主要原理、策略和在罕见病中的潜在应用,重点介绍了基因编辑技术在罕见病治疗中的优势,并总结了近年来基因治疗相关的临床试验,为基因治疗在罕见病精准医疗领域的研究和应用提供参考.
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眼部疾病的基因治疗与递送策略
眼睛独特的生理构造使其在基因治疗方面彰显出明显的优势.近年来,越来越多治疗眼部疾病的基因药物进入临床试验,其中大部分是以腺相关病毒作为递送载体,通过局部注射途径给药,存在一定的风险.针对各种眼部疾病,传统的无创治疗手段如眼表滴入或全身给药虽能够达到一定的治疗效果,但是对于眼内和眼后段疾病,即使小分子药物也难以到达,这使得对基因药物眼部递送策略的研究迫在眉睫.为了更好地了解基因治疗眼部疾病的新热点,本文介绍了相关的疾病与基因药物,总结了眼内基因递送的途径与吸收屏障,并侧重介绍了近年来报道的基因递送策略.克服眼部的吸收屏障并降低给药的潜在风险,有望为眼部基因治疗的临床应用带来曙光.
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基于CRISPR-Cas9定向编辑CCL17和CCL22基因的研究
目的 针对人源的CCL17和CCL22基因进行CRISPR/Cas9-gRNA设计,并验证设计的sgRNA的有效敲除效率.方法 利用CRISPR网站提供的工具对CCL17和CCL22基因的靶向编辑位点进行筛选设计,然后构建CRISPR-Cas9-CCL17和CRISPR-Cas9-CCL22敲除质粒,并将构建好的质粒转入293 T细胞系,然后通过基因组PCR产物的T-A克隆测序方法分别验证设计的sgRNA敲除质粒的编辑效率.结果 成功构建针对于人源CCL17和CCL22基因的sgRNA敲除质粒,并有着良好的编辑效率,均达70％以上.结论 针对CCL17和CCL22基因设计的CRISPR敲除质粒对靶基因有着很好的编辑效果,为后续基于CCL17和CCL22的相关性研究奠定了基础.
