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利用CRISPR/Cas9技术高效建立FUS-GFP荧光报告细胞系
利用CRISPR/Cas9基因敲入技术建立稳定表达FUS(fused in sarcoma)的细胞系.方法:扩增FUS 5''arm序列,puro-T2A-GFP报告基因,FUS 3''arm序列,将3个片段一次连接至目的载体上.制作长链ssDNA做为同源重组模板.将FUS agRNA,cas9,ssDNA共转染hela和hct116细胞,通过细胞同源重组修复途径,实现报告基因GFP的敲入,嘌呤霉素筛选阳性细胞,流式分选纯化和富集带有绿色荧光的细胞,建立表达FUS-GFP融合蛋白的细胞系.结果:成功构建了带有FUS 5''arm+puro-T2A-GFP+FUS 3''arm的靶向载体质粒.琼脂糖凝胶显示ssDNA的成功产生.共聚焦显微镜显示转染后药筛48小时的hela和hct116细胞均出现绿色荧光.流式分选显示,带有绿色荧光的细胞比例约为30％-40％.结论:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了FUS-GFP荧光报告细胞系.
关键词： CRISPR/Cas9 knockin 同源重组 ssDNA FUS -
展望CRISPR/Cas9基因编辑技术在药用植物研究中的应用
CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发现的一种基因组定点编辑技术,该技术已经广泛应用在基因治疗、基因功能研究、动物模型制造、农作物品种改良等领域的研究中.该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术,并提出了这项技术在药用植物功能基因组学研究、活性成分次生代谢及合成生物学研究、药用植物分子育种研究等方面的应用前景,为开辟药用植物新领域的研究提供了参考.
关键词： 药用植物 CRISPR/Cas9 基因编辑技术 -
基因编辑技术的研究进展及其在中药研究中的前景展望
基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术,可对特定DNA片段进行敲除、加入和替换等,从而在基因组水平上进行精确的基因编辑.其技术本质均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复,联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变.基因编辑技术在科研、农业、医疗等领域都具有极其广泛的发展前景和应用价值.在疾病基因治疗领域,基因编辑技术在癌症如白血病、遗传性疾病如血友病、地中海贫血、多种肌肉营养障碍症和逆转录病毒相关传染病如艾滋病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩:结合基因编辑技术开展的实验新方法学研究及动物模型的制备工作也在迅猛地发展和完善;世界各地的实验室也已将基因编辑技术应用于预防疟疾、器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活等多个研究领域.该文就基因编辑技术在上述领域中的研究进展进行一些概括和总结.此外还归纳了一些当前针对基因编辑技术存在的争议和思考,并初步探讨了该技术在中药研究中的潜在应用前景.
关键词： 基因编辑技术 CRISPR/Cas9 ZFNs TALENs -
利用体外靶点效率检测指导丹参SmPAL1基因的CRISPR/Cas9载体构建
为定向编辑丹参苯丙烷代谢途径中关键酶基因SmPAL1构建CRISPR/Cas9载体,通过在线软件设计CIRSPR/Cas9靶位点,采用体外酶切法进行体外靶点效率检测,筛选活性高的序列,构建到CRISPR/Cas9载体中.设计了3个可能的CRISPR/Cas9靶位点(SmPAL1-g1,SmPAL1-g2,SmPAL1-g3),通过体外靶点效率检测,其活性分别为53.3％,76.6％,10.0％,将筛选出活性较高的2个靶位点SmPAL1-g1和SmPAL1-g2构建到载体VK005-03中并命名为VK005-03-g1和VK005-03-g2.测序结果显示,设计的2个CRISPR/Cas靶位点全部插入到VK005-03中,载体构建成功.
关键词： 丹参 苯丙氨酸解氨酶 CRISPR/Cas9 基因编辑 靶点效率检测 -
利用CRISPR/Cas9基因敲除技术研究Importin-α7对流感病毒生长特性的影响
流感病毒的跨种传播是一个包含病毒和宿主因子之间大量相互作用的复杂过程.除了转换细胞表面受体结合特异性,禽流感病毒还要克服核膜形成的另一个重要屏障-核输入机制来进入细胞核进行有效转录和复制.本文主要研究人源importin-α7对不同来源、不同亚型流感病毒生长的影响.根据CRISPR/Cas9靶点设计原则分别在人importin-α7功能域第5和第6个外显子设计一对小向导RNA(sgRNAs)并克隆入pX459载体,重组质粒共转染A549细胞,构建A549-importin-α7-KO细胞系;再分别用不同来源(人源、猪源和禽源)、不同亚型的甲型流感病毒与乙型流感病毒感染A549-importin-α7-KO细胞和野生型A549细胞,研究importin-α7对流感病毒生长特性的影响.经测序和Western blotting验证,成功构建A549-importin j-KO细胞系;激光共聚焦观察结果显示,importin-α7敲除后vRNPs入核减少;同时Importin-α7敲除后流感病毒的生长均受到抑制,其中importinα7对人流感病毒A/California/04/2009(H1N1)和B/Brisbane/60/2008、禽流感病毒A/Quail/Hong Kong/G1/1997(H9N2)、猪流感病毒A/Hunan/42443/2015(H1N1)和A/Jiangsu/1/2011(H1N1)的生长影响显著,而人流感病毒A/HongKong/4801/2014(H3N2)和禽流感病毒A/Guangzhou/333/99 (H9N2)在两种细胞中的生长差异不明显.不同流感病毒结合importin α的特异性不同,提示流感病毒可能已经进化出不同机制来利用importin-α亚型进行核输入,这对于流感病毒的宿主适应性和致病力研究具有重要意义.
关键词： CRISPR/Cas9 Importin-α 流感病毒 vRNP 入核 适应性突变 致病力 -
基于CRISPR/Cas9系统的HEK293T细胞DMD基因第51号外显子的靶向敲除
目的 应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,完成HEK293T细胞中DMD基因第51号外显子(exon51)高效的靶向敲除.方法 设计靶向人DMD基因exon515′端及3′端的sgRNA并克隆至CRISPR/Cas9载体质粒PX459中,转染至HEK293T细胞后,提取基因组DNA并使用Surveyor法检测切割活性;使用目标外显子两端切割活性高的sgRNA构建PX459-2sgRNA质粒,转染至HEK293T细胞后用PCR及T载体测序检测靶向外显子切除情况.结果 50%的HEK293T细胞中DMD基因 exon51被定向切除,编辑效率较高.结论 建立使用CRISPR/Cas9单质粒敲除人DMD基因 exon51的平台,为DMD及其他遗传病的基因治疗研究奠定实验基础.
关键词： CRISPR/Cas9 DMD基因 单载体质粒 HEK293T细胞 外显子敲除 -
通过CRISPR/Cas9系统敲除人源PDE10A基因
目的 建立敲除基因组中PDE10A基因的CRISPR/Cas9系统.方法 设计3个长20bp的sgRNA,分别靶向PDE10A的exon 6、exon 7和exon 11.化学合成sgRNA寡核苷酸序列,并克隆进PX330质粒中.将克隆正确的质粒PX330-sgRNA转染至HEK293T细胞中,提取基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,再通过SURVEYOR分析和一代测序对敲除效率进行检测.后采用有限稀释法挑选稳定敲除PDE10A的HEK 293T细胞株.结果 目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入PX330质粒中且序列正确;靶向Exon 7的sgRNA可成功敲除PDE10A,且敲除效率高达31.4％;稳定敲除PDE10A的细胞株筛选成功,可导致2 bp缺失.结论 PDE10A基因CRISPR/Cas9敲除系统构建成功.
关键词： PDE10A CRISPR/Cas9 稳定细胞株 -
利用CRISPR/Cas9构建R778L类型肝豆状核变性疾病小鼠模型
目的 利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统构建针对人肝豆状核变性R778L突变类型的R780L突变小鼠.方法 通过BLAST比对人和小鼠中ATP7B基因和蛋白的序列,证明二者保守性.通过CRISPR/Cas9系统进行小鼠受精卵显微注射,并对小鼠肝豆状核变性症状进行病理和生理学检测.结果 人和小鼠中ATP7B基因和蛋白的序列高度保守.通过CRISPR/Cas9技术成功获得纯合的R780L突变小鼠,该小鼠存在明显的肝脏铜离子淤积以及血清ALT、AST的升高且未发现有可检测出的脱靶效应.结论 成功利用CRISPR/Cas9介导的基因敲入系统构建了针对人肝豆状核变性R778L类型的R780L突变小鼠模型.
关键词： 肝豆状核变性 CRISPR/Cas9 点突变R778L 小鼠模型 -
利用CRISPR/CAS9技术构建QKI敲除GC1-spg细胞株及其生物学功能检测
目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建QKI敲除的GC1-spg细胞株,并在体外研究QKI对GC1-spg细胞增殖和分化的影响.方法 利用CRISPR/Cas9系统的PX330质粒构建敲除QKI的重组质粒,转染GC1-spg野生型细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和基因测序鉴定出GC1-spg敲除QKI细胞株;常规培养野生型和敲除细胞株,利用细胞计数检测试剂盒(CCK8)绘制增殖曲线和荧光定量PCR(q-PCR)检测减数分裂相关基因变化.结果 本研究成功构建出QKI敲除GC1-spg细胞株,与对照组相比,QKI敲除细胞株的增殖明显下降(P<0.05),减数分裂相关分子标志基因c-kit、Mtl5和Hspa2表达量明显降低(P<0.05).结论 QKI蛋白可以影响GC1-spg的增殖和分化,因此QKI蛋白可能通过影响增殖和分化而影响精子发生.
关键词： CRISPR/Cas9 GC1-spg QKI 精子发生 -
CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展
CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域.该系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑.脱靶效应和编辑效率是该系统面临的两大问题.目前已有诸多研究从减少脱靶效应和提高编辑效率的方面对该系统进行优化,将有助于其安全性的提升及应用范围的拓展.
关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑 脱靶效应 编辑效率 -
利用CRISPR/Cas9系统构建4T1细胞CXCR4基因敲除稳定细胞株
目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的CXCR4基因,构建稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在美国国立生物技术信息中心(NCBI) 上找到CXCR4基因序列的外显子区域,设计两条sgRNA,用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒后转染至293T细胞中包装成慢病毒.收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞.提取筛选出的单克隆细胞基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序;用Real-time PCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况.结果 LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功;经过基因组DNA片段PCR扩增测序得1株缺失27 bp的稳定敲除CXCR4基因的细胞株;细胞株CXCR4mRNA的表达量低且几乎无CXCR4蛋白质的表达.结论 通过CRISPR/Cas9系统获得靶向敲除CXCR4基因的重组质粒,并筛选出稳定敲除CXCR4基因的细胞株.
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基于CRISPR/Cas9的雄激素受体基因敲除的实验研究
目的探讨细胞水平的雄激素受体（AR）基因敲除方法，为前列腺疾病AR通路的功能研究提供细胞株材料。方法通过在线软件设计针对AR的sgRNA靶向序列，将设计好的sgRNA靶序列克隆到PX330载体中并测序验证。将克隆好的CRISPR?AR载体转染T293细胞，提取DNA，PCR产物酶切和测序鉴定基因敲除效率。结果 CRISPR?AR载体测序证明质粒载体构建成功，293T细胞转染和酶切鉴定实验证明CRISPR?AR载体具有95.3%的敲除效率。结论基于CRISPR/Cas9技术构建的CRISPR?AR载体可用于细胞的AR基因敲除，可进一步构建AR基因敲除的细胞株。
关键词： 受体 雄激素 前列腺增生 前列腺肿瘤 CRISPR/Cas9 -
利用CRISPR/Cas9技术构建微RNA-155基因敲除小鼠模型
目的 探讨利用CRISPR/Cas9技术构建微RNA-155(miR-155)基因敲除小鼠模型.方法 选择健康C57BL/6J小鼠,首先进行小鼠基因组靶序列的扩增和测序,明确miR-155序列及位点,然后设计并构建Cas9载体质粒(Cas9 RNA)及打靶载体单导向RNA(sgRNA),随后将体外转录的Cas9 RNA及sgRNA显微注射入小鼠的受精卵,并将受精卵体外培养.将培养合格的胚胎移植到代孕小鼠的输卵管中,待小鼠生育后得到F0代小鼠.通过对F0代小鼠基因型检测确定基因敲除情况,进而繁育并建立基因敲除小鼠模型.结果 利用CRISPR/Cas9技术构建模型小鼠得到F0代小鼠18只,其中4号小鼠出现DNA单链碱基片段缺失,且基因型可以稳定传代.对其进行繁育后,得到F1代杂合子小鼠3只.杂合子小鼠交配繁育,得到F2代纯合子基因敲除小鼠,电泳及测序结果证实其缺失114 bp碱基序列,成功敲除miR-155基因.miR-155基因敲除小鼠在清洁级动物饲养环境中可以正常繁育.结论 CRISPR/Cas9技术能够快速、有效地构建miR-155基因敲除小鼠模型.
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CRISPR/Cas9系统及其在血液病基因治疗中的研究进展
近年来随着基因编辑技术的兴起,可以实现对基因组中特定的基因进行编辑,使基因突变性疾病的治愈成为可能.在众多基因编辑技术中,CRISPR/Cas9系统因其操作简便性、靶向特异性、经济性等特点备受关注,已广泛应用于分子生物学以及生命科学的领域研究中.本文就此系统结构、作用机制以及在血友病、β-地中海贫血、慢性髓系白血病等血液病中基因治疗的新研究进展作一综述.
关键词： CRISPR/Cas9 血友病 β-地中海贫血 慢性髓系白血病 基因编辑 -
敲除BMAL1基因促进HL-60细胞凋亡并抑制增殖
目的:运用CRISPR/Cas9技术敲除节律基因BMAL1的HL-60细胞系,探讨BMAL1分子在人急性髓系白血病中的生物学功能.方法:针对BMAL1基因设计2条sgRNA,构建含有sgRNA的PX459敲除载体;应用T7核酸内切酶I检测设计的sgRNA活性;应用打靶载体瞬时转染HL-60细胞构建BMAL1敲除细胞系,应用Western blot检测BMAL1蛋白的表达,应用流式细胞仪检测敲除细胞系的凋亡水平,应用CCK-8试剂盒检测敲除细胞系的增殖能力.结果:成功构建了针对BMAL1的PX459-sgRNA载体;并筛选得到了活性较高的打靶载体.Western blot实验在敲除细胞中未检测到BMAL1蛋白的表达.进一步实验发现,BMAL1敲除的HL-60细胞凋亡水平明显升高,细胞增殖能力明显减弱.结论:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了BMAL1基因敲除的HL-60细胞系,并发现BMAL1敲除可以促进HL-60细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,初步揭示了BMAL1生物节律基因在急性髓系白血病中的生物学作用.
关键词： CRISPR/Cas9 Bmal1 基因敲除 急性髓系白血病 -
CRISPR/Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除小鼠
目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立S1PR5基因敲除的小鼠模型,为研究鞘氨醇-1-磷酸受体5(sphingosine-1-phosphate receptor 5,S1PR5)在异基因造血干细胞移植中的作用提供实验工具.方法:根据S1PR5基因第三外显子碱基序列,设计针对S1PR5基因的sgRNA(single guide RNA),构建sgRNA表达质粒,利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6小鼠的受精卵进行显微注射.使用T7E1酶切和或基因测序检测S1PR5基因碱基的突变情况,然后应用qPCR和Western blot方法检检测S1PR5是否被成功敲除.结果:获得了2种S1PR5基因突变的F2代纯合子小鼠,即基因分别缺失170 bp和215 bp的S1PR5-170/-170小鼠和S1PR5-215/-215小鼠.在这两种小鼠中,S1PR5在mRNA和蛋白水平均没有表达.结论:成功建立了S1PR5基因敲除的小鼠模型,为探讨S1PR5在异基因造血干细胞移植的作用提供了研究平台.
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应用 CRISPR／Cas9系统靶向切割细胞内乙型肝炎病毒基因组的研究
目的：应用近年发展的基因编辑技术成簇规律间隔短回文重复序列（ clustered regularly interspaced short palindromic repeat， CRISPR）引导的Cas9核酸酶特异性靶向切割HBV DNA基因。方法基于慢病毒载体的lentiCRISPRv2系统，我们设计了3个特异靶向HBV基因组的向导RNA序列（ guide RNA， gRNA）。质粒pUC18－HBV1.2和lentiCRISPR-gRNAs共转染HepG2细胞，或lentiCRISPR-gRNAs与相关慢病毒载体转染293T细胞后产生相应慢病毒。用慢病毒处理整合了HBV DNA的HepG2.2.15细胞或者HepDE19细胞系；并用慢病毒处理基于C57BL／6小鼠腺相关病毒HBV复制模型。结果单靶向CRISPR／Cas9切割可以抑制30％～50％病毒蛋白产生。两个或三个靶向切割则显著提高抑制效率，可达70％～90％。以慢病毒体系处理HepG2.2.15或HepDES19细胞时， HepDES19细胞中HBeAg下降幅度约为HepG2.2.15细胞中的3倍。 HBV复制小鼠模型在CRISPR／Cas9慢病毒处理后，血清中HBsAg和HBeAg可转为阴性。结论 CRISPR／Cas9系统多位点靶向切割可高效清除细胞内基因组，相对于整合于染色体的基因组，游离于细胞核的HBV基因组对此靶向切割系统更加敏感。
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CRISPR/Cas9基因编辑系统中两种gRNA活性检测方法比较
目的:比较CRISPR/Cas9系统中gRNA活性检测的两种方法,即利用Surveyor/T7E1核酸酶检测方法或利用Cas9蛋白的体外检测方法.方法:一方面构建表达Cas9和特异gRNA的质粒,转染NIH3T3细胞,然后提取DNA,利用T7E1核酸内切酶检测gRNA介导Cas9切割靶DNA并产生indel突变的效率;另一方面,设计引物并利用PCR扩增出gRNA的DNA模板片段,通过体外转录获得gRNA,利用Cas9蛋白及gRNA进行体外反应检测切割效率.结果:利用Cas9蛋白体外酶切可以检测到较高的gRNA活性,然而通过T7E1核酸酶方法检测gRNA在细胞中活性整体偏低,且在不同基因之间差异较大.结论:细胞Surveyor/T7 E1法与Cas9蛋白体外酶切法检测到的gRNA活性不完全一致,体外活性检测法不能替代.
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MEG8-DMR对人肝癌Huh7细胞DLK1表达水平的影响
目的 DLK1-DIO3印记区间位于人14号染色体、小鼠12号染色体上,在两者的表达中高度保守,其间有三个父本控制的蛋白质编码区域,以及多个母本控制的非编码转录本,还有大量的C/D snoRNA和microRNA.其间有三个差异甲基化区,分别为父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR,以及母本甲基化的MEG8-DMR.先前关于对MEG8-DMR的研究集中于肿瘤方面的较少,因此探究差异甲基化区MEG8-DMR对肿瘤发生的影响以及其调控机制,深入分析印记基因参与肿瘤的发病机理,具有重要的意义.方法 本实验通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,先依据脱靶位点少的原则选择sgRNA,构建重组载体并通过脂质体法将其转染入Huh7细胞后检测出重组载体在Huh7细胞系中对MEG8-DMR区域进行了有效的敲除.结果 敲除MEG8-DMR后细胞形态没有发现明显变化,同时发现敲除MEG8-DMR导致上游基因DLK1表达水平的下调.结论 本实验中通过对MEG8-DMR的敲除,导致DLK1表达下调,而DLK1在几种肿瘤包括神经纤维瘤、骨髓增生异常综合征和肝癌患者的血清中呈高表达,且肿瘤的形成是多因素、多基因共同参与的结果,MEG8-DMR上下游区域分布着一系列母系表达非编码转录本,和大量的miRNA和C/D snoRNA,因此,MEG8-DMR及临近基因在肝细胞性肝癌的发生过程中可能具有表达调控的重要功能.
关键词： MEG8-DMR 肝细胞性肝癌 CRISPR/Cas9 Huh7细胞 DLK1 -
Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株的建立
目的 建立Cas9蛋白稳定表达的人肝胆癌细胞株,并验证Cas9的基因编辑活性,以便利用CRISPR/Cas9系统开展肝胆细胞基因编辑的研究.方法 在人肝癌细胞(Huh7、PLC/PRF/5、HepG2、Hep3b、SK-HEP-1和Li-7)、人胆管癌细胞(RBE)和人胆囊癌细胞(GBC-SD)中,分别感染Cas9表达质粒pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo、pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro和Cas9m1.1,挑选单细胞克隆培养扩增.提取基因组DNA和总蛋白后,通过基因组聚合酶链反应(PCR)和Western blot验证Cas9的稳定表达.选取其中3个细胞株并感染Lv-EF1α-mCherry,流式细胞术分选出mCherry阳性的细胞,再通过慢病毒感染靶向mCherry基因的向导RNA,细胞扩增后,通过基因组PCR、荧光显微镜下观察和流式细胞术检测mCherry被敲除的情况.结果 筛选到100个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株,其中表达Cas9-Neo的细胞35株,表达Cas9-Puro的细胞25株,表达突变型Cas9的细胞40株.建立了3株mCherry稳定表达的细胞系Huh7-mCas9-M、PLC/PRF/5-Cas9-M和SK-HEP-1-Cas9-M.基因组PCR和测序显示,同时感染2种gRNA的细胞基因组内存在mCherry片段缺失.荧光显微镜下,同时感染2种gRNA的细胞可以观察到mCherry-EGFP+细胞.流式细胞仪检测结果显示,mCherry-EGFP+细胞占0.3％～93.6％.结论 成功建立了100个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株,其中的Cas9蛋白具有基因编辑活性.
