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MEG8-DMR对人肝癌Huh7细胞DLK1表达水平的影响
目的 DLK1-DIO3印记区间位于人14号染色体、小鼠12号染色体上,在两者的表达中高度保守,其间有三个父本控制的蛋白质编码区域,以及多个母本控制的非编码转录本,还有大量的C/D snoRNA和microRNA.其间有三个差异甲基化区,分别为父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR,以及母本甲基化的MEG8-DMR.先前关于对MEG8-DMR的研究集中于肿瘤方面的较少,因此探究差异甲基化区MEG8-DMR对肿瘤发生的影响以及其调控机制,深入分析印记基因参与肿瘤的发病机理,具有重要的意义.方法 本实验通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,先依据脱靶位点少的原则选择sgRNA,构建重组载体并通过脂质体法将其转染入Huh7细胞后检测出重组载体在Huh7细胞系中对MEG8-DMR区域进行了有效的敲除.结果 敲除MEG8-DMR后细胞形态没有发现明显变化,同时发现敲除MEG8-DMR导致上游基因DLK1表达水平的下调.结论 本实验中通过对MEG8-DMR的敲除,导致DLK1表达下调,而DLK1在几种肿瘤包括神经纤维瘤、骨髓增生异常综合征和肝癌患者的血清中呈高表达,且肿瘤的形成是多因素、多基因共同参与的结果,MEG8-DMR上下游区域分布着一系列母系表达非编码转录本,和大量的miRNA和C/D snoRNA,因此,MEG8-DMR及临近基因在肝细胞性肝癌的发生过程中可能具有表达调控的重要功能.
关键词： MEG8-DMR 肝细胞性肝癌 CRISPR/Cas9 Huh7细胞 DLK1 -
肾细胞癌组织中DLK1蛋白表达及与临床病理学特征的相关性研究
目的 探讨不同组织类型的肾细胞癌组织中DLK1蛋白表达与肾癌临床病理特征及转移的关系.方法 采用免疫组织化学方法,检测94例肾原发透明细胞癌、76例乳头状肾细胞癌、45例嫌色细胞癌、71例透明细胞癌远处转移灶、24例透明细胞癌淋巴结转移灶及18例正常肾组织标本中DLK1蛋白表达情况,分析其与临床病理特征及转移的相关性.结果 正常肾组织近端及远端肾小管中DLK1蛋白表达均为阳性,透明细胞癌、乳头状肾细胞癌及嫌色细胞癌组织低表达率分别为33.0%(31/94)、27.6%(21/76)及33.3%(15/45),与正常肾组织相比,差异有统计学意义(P＜0.05),3种类型肾癌组织之间DLK1蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).DLK1蛋白表达水平与透明细胞癌患者性别(男60例,女34例)、年龄(≥55岁50例,＜55岁44例)、病理分期(Ⅰ期41例,Ⅱ期9例,Ⅲ期21例,Ⅳ期23例)及淋巴结转移状态(无转移76例,有转移18例)等无明显相关性(P＞0.05).透明细胞癌原发灶、淋巴结转移灶、远处转移灶肿瘤组织中DLK1蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 不同类型的肾细胞癌组织中DLK1蛋白表达降低.DLK1蛋白低表达与透明细胞癌的临床病理特征及肿瘤转移无关.
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肝癌组织DLK1和Jagged1表达临床意义探讨
目的 探讨DLK1和Jagged1在原发性肝细胞性肝癌组织中的表达情况,深入分析两者与肝癌临床病理资料的关系及其临床意义.方法 收集2001-01-01-2009-10-30顺德第一人民医院病理科采用免疫组化SP法检查10例正常肝组织、50例肝炎、50例肝硬化和150例肝细胞性肝癌组织中DLK1和Jagged1的表达情况.结果 DLK1阳性表达率在正常肝组织为0(0/10)、肝炎组为6.00％(3/50)、肝硬化组为28.00％(14/50)、肝癌组为46.67％ (70/150),四组间阳性率比较差异有统计学意义,x2=34.38,P＜0.05.正常肝组织和肝炎组,正常肝组织和肝硬化组,正常肝组织和肝癌组,肝硬化和肝癌组两两比较差异均无统计学意义,P值均＞0.05.肝炎和肝硬化组(x2=8.575,P=0.003),肝炎和肝癌组(x2=26.757,P＜0.001)两两比较差异均有统计学意义.Jagged1阳性表达率在正常肝组织中为40.00％(4/10)、肝炎组为40.00％(20/50)、肝硬化组为62.00％(31/50)、肝癌组为71.33％(107/150),四组间阳性率比较差异有统计学意义,x2=17.92,P＜0.05.正常肝组织和肝炎组,正常肝组织和肝硬化组,正常肝组织和肝癌组,肝炎组和肝硬化组,肝硬化组和肝癌组,两两比较差异均无统计学意义,P值均＞0.05.肝炎组和肝癌组比较差异有统计学意义,x2=15.885,P＜0.001.DLK1表达与年龄有关(x2=15.01,P＜0.05),Jagged1表达与年龄(x2=7.94,P＜0.05)、分化程度(x2=14.79,P＜0.05)、HBsAg(x2 =4.53,P＜0.05)和预后(x2=3.92,P＜0.05)有关.DLK1和Jagged1在肝细胞癌组织中表达密切相关,x2=12.79,P＜0.05.结论 DLK1和Jagged1的异常表达与肝癌的发生、发展和分化密切相关.
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DLK1基因在非小细胞肺癌中异常表达及其调控机制
目的：探讨DLK1基因在非小细胞肺癌患者肿瘤组织中的表达情况及其调控机制。方法采用免疫组化检测DLK1蛋白在204例非小细胞肺癌组织中的表达，分析DLK1蛋白表达与患者临床特征的关系。采用亚硫酸氢盐测序法检测18例非小细胞肺癌肿瘤组织中DLK1基因启动子区CpG岛的DNA甲基化状态，结合相应组织中DLK1蛋白的表达情况，配对分析DNA甲基化状态与DLK1蛋白表达水平的关系。结果在102例肺鳞癌及癌旁支气管上皮组织中，DLK1呈阳性表达分别72例和37例，差异有统计学意义（ P＝0．001）；在102例肺腺癌及癌旁肺泡组织中，DLK1呈阳性表达分别77例和7例，差异有统计学意义（ P＜0．001）。 DLK1蛋白的表达水平与患者的组织类型、临床分期和肿瘤大小均有关（均P＜0．05），DLK1蛋白的表达水平与基因启动子区CpG岛甲基化程度呈负相关关系（ P＜0．05）。结论在非小细胞肺癌组织中DLK1蛋白异常高表达，而DLK1基因启动子区的低甲基化是导致其异常高表达的调控机制之一。
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基因重组DLK1蛋白肝癌疫苗研制的初步结果
DLK1是胚胎干细胞表面分子标记之一,属于EGF超家族,具有6次跨膜结构,参与细胞分化和决定[1].成年人,DLK1在除脑组织外的健康体细胞不表达,但在部分肿瘤中表达,如小细胞肺癌、骨髓纤维化和肝癌[1,2].由于DLK1是细胞膜表面蛋白,因此其作为疫苗具有一定可行性,本文将讨论此方面的内容.
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DLK1基因在急性白血病细胞系中的表达及其意义
目的:研究急性白血病细胞系DLK1基因的表达水平在红系分化中的作用.方法:采用RT-PCR、Western bitting时白血病细胞系K562、HL-60进行DLK1水平的检测.培养K562细胞,用氯化高铁血红素(hemin)诱导其分化,观察DLK1在红系分化中的变化.结果:K562细胞DLK1mRNA、蛋白水平存在明显表达,HL-60细胞DLK1则不表达.通过RT-PCR检测了hemin诱导K562细胞向红系分化过程中各时间点DLK1mRNA的变化,显示随着K562向红系分化,DLK1mRNA的水平逐渐下降.结论:K562细胞表达DLK1,HL-60不表达DLK1.DLK1基因可能参与K562细胞向红系分化的过程,可能抑制其分化.
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DLK1对人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的影响
目的 研究DLK1在人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖分化中的作用.方法 用免疫组织化学分析法来检测小鼠上颌第一磨牙中DLK1的表达.构建重组慢病毒使DLK1在hDPSCs中稳定过表达,用CCK8法和EdU核素渗入法分别检测hDPSCs的细胞活力和增殖;hDPSCs进行成牙本质细胞向分化诱导后,通过ALP活性分析、ALP和茜素红染色,以及ALP、DSPP、DMP1等矿化相关基因的表达,研究hDPSCs的成牙本质细胞向的分化.结果 DLK1在小鼠上颌第一磨牙的成牙本质细胞和牙髓细胞中高表达,而且正常hDPSCs在成牙本质细胞向分化诱导14 d后,ALP蛋白水平增长1.6倍,DSPP增长1.16倍,DMP1增长1.42倍,DLK1增长1.54倍.hDPSCs中过表达DLK1后,相比于对照组增加了1.7倍,显著促进了细胞增殖,却抑制了其成牙本质细胞向分化.结论 DLK1在牙齿发育中发挥重要作用,DLK1过表达促进hDPSCs的增殖,但抑制其成牙本质细胞向分化.
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Dlk1、Jagged1基因在大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖及转分化中的作用
目的 研究Notch的配体Dlk1和Jagged1分别激活Notch信号通路后对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)转分化及增殖的影响.方法 在细胞培养体系中,分别加入重组蛋白Dlk1和重组人核转录因子-κB(rhNF-κB) (Jagged1激活剂),止常组加入含120 mL/L胎牛血清的DMEM培养基作为对照,光镜和电镜下观察48、72、96 h时间点AECⅡ增殖和转分化状况.血细胞计数器计数细胞;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖能力;免疫荧光双标法检测AECⅡ特异性肺泡表面活性蛋白C(SP-C)及肺泡Ⅰ型上皮细胞(AEC Ⅰ)特异性水通道蛋白5 (AQP5)的表达;时实荧光定量PCR检测转分化前后各时间点Notch配体Dlk1和Jagged1、通路活化标志Notch1、靶基因Hesl及转分化标志物SP-C、AQP5 mRNA的表达变化.结果 细胞数及增殖能力:与正常组比较,Dlk1组细胞数及增殖能力明显提高[细胞数(×109/L) 9.05±0.45比7.95±0.65,11.68±0.43比8.68±0.52,11.55 ±0.17比8.73±0.48,P均＜0.05;MTT结果(A值)0.699±0.050比0.462±0.080,0.912±0.080比0.535±0.040,0.726±0.050比0.540±0.020,P均＜0.05],转分化速度减慢;rhNF-κB组细胞数及增殖能力降低[细胞数(×109/L) 4.95±0.33比7.95 ±0.65,4.73±0.71比8.68±0.52,4.04 ±0.11比8.73±0.48,P均＜0.05;细胞增殖能力0.398±0.030比0.462±0.080,0.402±0.070比0.535±0.040,0.380±0.110比0.540±0.020,P均＜0.05],转分化速度加快;单因素方差分析3组细胞之间的差别有统计学意义(细胞数:F=486.73,P=0.02;细胞增殖能力:F=37.16,P=0.02).mRNA表达:与正常组比较,Dlk1组SP-C mRNA表达明显增多(P＜0.05),AQP5 mRNA表达延迟且明显减少(P＜0.05),Jagged1 mRNA始终呈弱表达或不表达,Dlk1、Notch1 mRNA表达增多(P＜0.05),Hes1 mRNA表达减少(P＜ 0.05);rhNF-κB组SP-CmR NA表达明显降低(P＜0.05),AQP5 mRNA表达提前,且增多(P＜0.05),Dlk1 mRNA弱表达或不表达,Jag-ged1、Hes1、Notch1 mRNA表达增强(P＜0.05).单因素方差分析3组细胞之间SP-C、AQP5、Dlk1、Jagged1、Hes1、Notch1 mRNA的表达差异统计学意义(F=96.80,P=0.01;F=82.55,P=0.01;F =269.80,P=0.00;F=312.34,P=0.00;F=169.17,P=0.01;F=19.85,P=0.02).结论 不同配体激活Notch信号通路后,对AECⅡ转分化和增殖有不同影响,Dlk1能促进增殖,抑制转分化,而Jagged1则抑制增殖,促进转分化.
关键词： 肺泡Ⅱ型上皮细胞 Notch DLK1 Jagged1 新生儿呼吸窘迫综合征 -
DLK1的研究进展
穿膜蛋白DLK1是表皮生长因子(EGF)家族的成员之一,其结构特征为蛋白的细胞外区域拥有6串在结构及氨基酸序列上与表皮生长因子高度同源的重复结构.DLK1基因为父系表达的印记基因,定位于人类染色体14q32.DLK1可以抑制脂肪前体细胞向脂肪细胞分化,在正常神经内分泌细胞及其肿瘤细胞中表达,提示DLK1在神经内分泌轴中起着调控细胞生长分化的作用,同时DLK1在胚胎肝、造血干细胞及早期肌肉组织中均有表达.
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肝细胞癌中 DLK1、垂体瘤转化基因和血管内皮细胞生长因子的表达及其临床意义
DLK1基因（Delta drosophila homolog-like 1）属于印迹基因［1］，在肝细胞癌组织中表达明显上调，对肝癌的形成起重要作用。垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene，PT-TG）在人体正常组织如肝脏、结直肠、胰腺等组织中表达甚微，而在甲状腺癌、垂体瘤、胆管癌等有较高的表达浓度［2］。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）与肿瘤的血管生成密切相关［3］，在多种恶性肿瘤中表达明显增加，是肿瘤靶向治疗的理想靶点［4］。本实验联合检测 DLK1， PTTG和VEGF在肝细胞癌中的表达，分析三者与肝细胞癌发生、发展的相关性。
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DLK1在急性白血病中的表达及其在K562细胞红系分化中的作用
目的:探讨急性白血病(acute leukemia,AL)患者骨髓单个核细胞DLK1基因的表达水平及其在K562细胞红系分化中的作用.方法:采用RT-PCR对65例AL患者及34例正常骨髓对照进行DLK1mRNA水平的检测,对其中20例AL患者及13例正常骨髓用Western 印迹法检测DLK1蛋白表达水平.培养K562细胞,用氯化高铁血红素(hemin)诱导其分化,观察DLK1在红系分化中的变化.结果:在AL患者和正常骨髓对照的骨髓单个核细胞中DLK1基因均存在明确表达.DLK1mRNA的表达水平AL组高于对照组,差异有统计学意义(P=0.018),但在ALL和ANLL之间DLK1mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05),且DLK1mRNA的表达水平与患者初诊时骨髓原始细胞数、外周血白细胞数及血小板数无关.对部分样品检测DLK1蛋白的表达,发现AL患者DLK1蛋白阳性表达率高于对照组,与mRNA表达趋势一致.在hemin诱导K562细胞向红系分化过程中,DLK1mRNA的表达水平逐渐下降.结论:DLK1基因可能参与了AL的发病过程,但DLK1mRNA的表达水平与AL患者某些临床特征无相关性.DLK1基因可能抑制K562细胞向红系分化.
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DLK1和GPC3在不同肝组织的表达及其临床意义
目的 探讨脂肪前体细胞因子1(delta drosophila homolog-like1或delta-like1 homologue,DLK1)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)在原发性肝细胞性肝癌(HCC)中的表达状况及其临床意义.方法 分别应用免疫组化S-P法和原位杂交的方法检测HCC150例、肝硬化50例、肝炎组织50例和正常肝组织10例中DLK1和GPC3的表达.结果 DLK1和GPC3在HCC、肝硬化、肝炎和正常肝组织中的表达差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 DLK1和GPC3的异常表达与肝癌的发展密切相关,DLK1和GPC3之间具有相关性,两者在肝癌的发生发展过程中起非常重要的作用.
关键词： DLK1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 肝肿瘤 免疫组织化学 原位杂交 -
miR -15 a对肝癌 HepG2细胞增殖和 DLK1表达的影响
目的：探讨miR-15a对肝癌中DLK1表达的调节作用和对肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法常规培养肝癌细胞系HepG2，经脂质体转染miR-15a模拟物mimic和抑制物inhibitors及各自阴性对照片段NC 48 h后，用RT-PCR和Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平，MTT和流式细胞术（FCM）检测细胞增殖和周期情况。结果 RT-PCR和Western blot结果显示转染miR-15a mimic后DLK1的mRNA和蛋白表达量降低（P＜0.05），而转染miR-15a inhibitors后DLK1的mRNA和蛋白表达量升高（P＜0.05）；MTT结果显示转染miR-15a mimic后细胞的增殖能力明显减慢（P＜0.05），而转染miR-15a inhibitors 后细胞增殖能力加快（P＜0.05）。 FCM结果显示转染 miR-15a mimic 后细胞抑制在 G1期。结论过表达miR -15a能抑制DLK1的mRNA和蛋白表达，并抑制肝癌HepG2细胞的增殖。
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大鼠肝癌组织中DLC1、ASC、p16和DLK1基因甲基化状态与肝癌的关系
目的 探讨大鼠肝癌组织中DLC1、ASC、p16和DLK1基因启动子区甲基化状态与肝癌发生的关系.方法 55只Wistar雄性大鼠随机分为黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)实验组(35只)和空白对照组(20只),用AFB1诱发大鼠肝癌并建立大鼠实验动物肝癌模型.用甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术和琼脂糖凝胶电泳方法检测大鼠肝癌组织及正常肝脏组织中DLC1、ASC、p16和DLK1基因启动子区的甲基化情况,分析4个基因的甲基化状态与肝癌发生的关系.结果 在实验第52周可见大鼠肝脏发生典型的肝癌病理学改变,实验诱发大鼠肝癌模型制作成功.MS-PCR技术检测显示在大鼠肝癌组织中DLC1、ASC、p16和DLK1基因启动子区的甲基化率分别为83.3％、93.3％、86.7％和10.0％,在大鼠正常肝脏组织中的甲基化率分别为14.3％、35.7％、21.4％和85.7％,二者比较差异均有统计学意义(P均＜0.05).琼脂糖凝胶电泳法检测显示4种基因甲基化均为阳性.结论 大鼠肝癌组织中DLC1、ASC、p16基因启动子区高度甲基化,DLK1基因启动子呈低甲基化水平,提示DLC1、ASC、p16和DLK1基因启动子区的异常甲基化与大鼠肝癌发生的关系密切.
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DLK1在肝癌和相关慢性肝病组织中的表达
目的 探讨DLK1基因在肝癌和相关慢性肝病组织中的表达情况,寻找新的肝癌标志物.方法 采用免疫组化S-P法检测正常肝组织(Normal)、中度慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)、癌周肝硬化(PC)和肝细胞癌(HCC)共95例标本中AFP和DLK1的表达；应用原位杂交方法检测癌周肝硬化、肝细胞癌组织共45例标本中DLK1 mRNA和AFP mRNA的表达.结果 AFP蛋白和DLK1蛋白在正常肝组、慢性肝炎组和肝硬化组均不表达,在癌周肝硬化组阳性表达率为27.9％和23.3％,在肝癌组为46.7％和51.1％,肝癌组AFP蛋白阴性病例中仍有22.73％的DLK1蛋白阳性表达.肝癌组与癌周肝硬化组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),癌周肝硬化组AFP蛋白表达与DLK1蛋白表达之间具有相关性.AFP mRNA和DLK1 mRNA阳性表达率在癌周肝硬化组为23.3％和41.9％,在肝癌组为40％和31.1％.DLK1 mRNA阳性表达率在癌周肝硬化组和肝癌组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AFP联合检测DLK1蛋白可提高肝癌的检出率,DLK1蛋白可作为肝癌诊断候选标志物；癌周肝硬不同于不伴癌的肝硬化而具有癌前病变性质.
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沉默低氧诱导因子-2α下调DLK1表达对乳腺癌干细胞裸鼠移植瘤生长的影响
目的 探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默低氧诱导因子-2α(hypoxia induciblefactor-2α,HIF-2αα)基因下调DLK1表达对乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)裸鼠移植瘤生长的影响.方法 建立BCSCs裸鼠移植瘤模型,原位注射RNAi慢病毒载体和空载体慢病毒载体至裸鼠左右侧背部移植瘤组织中,定期观察成瘤时间、瘤体体积及重量,进一步绘制生长曲线及计算抑瘤率.HE染色检测移植瘤组织病理,RT-PCR和Western blot法检测移植瘤组织HIF-2α、DLK1及CD44 mRNA和蛋白表达.结果 成功建立BCSCs裸鼠移植瘤模型.与空载体组相比,RNAi组移植瘤生长速率、瘤体体积和重量均明显降低(15.1％ vs 21.6％,5.80 cm3 vs 3.30 cm3,3.0 g vs 1.7 g,P＜0.05),抑瘤率为43.1％；HE染色显示RNAi组出现明显缺血坏死；RT-PCR结果提示RNAi组移植瘤组织中HIF-2α、DLK1及CD44蛋白表达均明显下调(0.59 ±0.02 vs 0.21 ±0.01,0.32 ±0.01 vs 0.08 ±0.01,0.76 ±0.03 vs0.04 ±0.01,P＜0.05)；Western blot结果也提示RNAi组移植瘤组织中HIF-2α、DLK1及CD44蛋白表达均明显下调(0.49 ±0.02 vs 0.28 ±0.01,0.43 ±0.02 vs0.11 ±0.01,0.62±0.03 vs 0.23±0.01,P＜0.05).结论 沉默HIF-2α基因下调DLK1表达有效抑制BCSCs裸鼠移植瘤生长,DLK1可能参与BCSCs未分化表型维持,并增强其致瘤性.
