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外泌小体内miRNA在多发性骨髓瘤进展中的作用及可能机制
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种起源于B细胞系的浆细胞恶性增殖性疾病,位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位.尽管针对MM的治疗方法不断取得进展,但患者的生存率及预后仍然不理想.因此,进一步明确MM的发病机理,以求发现新的治疗方法提高生存率、改善预后显得尤为重要.现有的研究已证实,骨髓微环境在MM的发病及进展过程中起着重要作用,且肿瘤微环境可通过改变其内细胞分泌的外泌小体(exo-some)所含物质(miRNA、mRNA及蛋白质)调控肿瘤细胞的生物学特性,促进肿瘤进展及转移,其中外泌小体所含的miRNA因具有抑癌基因和癌基因功能受到了广泛关注.现有研究结果显示,此种外泌小体所含miR-15a低表达,同/或miR-135b及miR-21高表达时,可通过调控一系列信号通路,如PI3K/Akt/eNOS/VEGF、FIH-HIF、MAPK/ERK/Ras等影响MM的发生发展,有望成为治疗MM的新靶点.本文就现有关于MM分泌的外泌小体所含miRNA在MM的发生发展中的作用及其可能的机制作一综述.
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miR-15a和miR-16通过调控bcl-2蛋白的表达逆转结肠癌细胞的耐药性
目的 研究miR-15a和miR-16靶向调控bcl-2的表达对结肠癌细胞耐药性的逆转作用.方法 将miR-15a和miR-16模拟物或抑制物转染结肠癌长春新碱(VCR)敏感细胞株HCT8或耐药细胞株HCT8/VCR,采用实时荧光定量PCR法检测miR-15a和miR-16的表达,Western blot法检测bcl-2和P糖蛋白(P-gp)蛋白的表达,细胞计数盒8(CCK8)法检测不同浓度VCR对HCT8和HCT8/VCR细胞生长的抑制作用.结果 实时荧光定量PCR法检测结果显示,空白对照组、阴性对照组和转染miR-15a模拟物组HCT8/VCR细胞中miR-15a的相对表达量分别为1.00、0.87±0.24和223.44±59.07,转染模拟物后,miR-15a的相对表达量明显升高(P＜0.001);空白对照组、阴性对照组和转染miR-16模拟物组HCT8/VCR细胞中miR-16的相对表达量分别为1.00、0.66±0.19和107.32±22.58,转染模拟物后,miR-16的相对表达量明显升高(P＜0.001).Western blot法检测结果显示,空白对照组、阴性对照组、转染miR-15a模拟物组和转染miR-16模拟物组HCT8/VCR细胞中bcl-2蛋白的相对表达量分别为1.00、0.97±0.02、0.51±0.06和0.65±0.03,转染模拟物后,bcl-2蛋白的表达下调(P＜0.05).而P-gp蛋白的表达在转染模拟物后没有明显变化.CCK8法检测结果显示,经1、5、25和125 μg/ml VCR处理后,空白对照组、阴性对照组、转染miR-15a模拟物组和转染miR-16模拟物组HCT8/VCR细胞存活率的变化趋势基本一致,转染模拟物后,HCT8/VCR细胞的存活率明显降低(P＜0.05).实时荧光定量PCR法检测结果显示,转染抑制物后,HCT8细胞中miR-15a和miR-16的表达明显降低(P ＜0.001).Western blot法检测结果显示,转染抑制物后,HCT8细胞bcl-2蛋白的表达明显上调(P＜0.05),而P-gp蛋白的表达没有明显变化.CCK8法检测结果显示,转染抑制物后,HCT8细胞的存活率明显高于空白对照组(均P＜0.05).结论 miR-15a和miR-16可逆转结肠癌细胞的耐药性,其可能的机制是通过调控bcl-2蛋白的表达.
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miR-15a诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的作用机制
目的 探讨miR-15a在诱导乳腺癌细胞凋亡中的作用及机制.方法 采用定量聚合酶链反应检测人乳腺上皮细胞株MCF-10A和乳腺癌细胞株MCF-7中miR-15a的表达水平.采用软件预测miR-15a的靶点,并通过荧光素酶报告基因系统验证.将miR-15a经脂质体法转染MCF-7细胞,采用Western blot法检测Bcl-2蛋白的表达,并采用流式细胞术检测MCF-7细胞的凋亡率.结果 miR-15a在乳腺癌细胞株MCF-7中的表达明显低于乳腺上皮细胞株MCF-10A (0.253∶1,P＜0.0001).miR-15a可显著抑制抗凋亡基因Bcl-2 3′-UTR荧光素酶报告基因的表达(P＜0.05).与未转染组(对照组)相比,miR-15a转染组MCF-7细胞中Bcl-2的表达水平显著下降,凋亡明显增加(P＜0.05).结论 miR-15a 作为一个潜在的抑癌基因,可通过靶向于Bcl-2诱导乳腺癌细胞MCF-7发生凋亡,其可为乳腺癌的临床治疗提供新的靶点和理论依据.
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miR-15a下调BCL-2和BCL2L2对下咽鳞癌FaDu细胞凋亡影响
目的： miR-15a在许多癌症中均发现有表达异常，但其在下咽鳞状细胞癌的作用不清。本研究通过miR-15a抑制BCL-2和BCL2L2表达，探讨在将miR-15a对下咽鳞癌细胞凋亡的影响。方法通过Lipofectamine2000将miR-15a mimics转染入下咽鳞癌FaDu细胞中。RT-PCR检测BCL-2和BCL2L2 mRNA的表达；Western Blotting检测BCL-2和BCL2L2蛋白的表达；流式细胞术检测检测miR-15a的对细胞凋亡的影响。结果 BCL-2和BCL2L2在FaDu细胞中表达较强；转染miR-15a mimics后的FaDu细胞中，BCL-2和BCL2L2蛋白和mRNA 的表达水平逐渐下调；同时转染miR-15a mimics后，FaDu细胞凋亡明显增加。结论 miR-15a可以下调BCL-2和BCL2L2的表达，促进下咽鳞癌细胞凋亡。
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miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达变化及临床意义
目的 探讨miR-15a在子宫内膜癌组织中表达变化及临床意义,分析miR-15a在子宫内膜癌发生发展过程中的可能机制.方法 通过荧光定量PCR法测定68例子宫内膜癌组织和68例癌旁组织的miR-15a表达情况;分别将无关序列模拟物(非转染组)、miR-15a模拟物(转染组)转染入RL95-2人子宫内膜癌细胞,设立阴性对照组,比较3组的miR-15a和基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达情况;并通过Transwell肿瘤细胞侵袭试验和Transwell肿瘤细胞迁移试验检测RL95-2细胞的侵袭力和迁移能力.结果 子宫内膜癌组织miR-15a相对表达量明显低于癌旁组织(P<0.05);miR-15a相对表达量与子宫内膜癌患者的FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润程度、分化程度相关(P<0.05);转染组miR-15a相对表达量明显高于未转染组和对照组,MMP-2相对表达量明显低于未转染组和对照组(P<0.05);转染组侵袭力与迁移力均明显低于未转染组和对照组(P<0.05).结论 在子宫内膜癌患者中miR-15a以低表达为主,且与淋巴结转移、分化程度、肌层浸润程度、FIGO分期有关,miR-15a作为抑癌基因可能是通过抑制MMP-2蛋白发挥抑制癌细胞转移及侵袭的作用.
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microRNA-15a在阿尔茨海默病中的作用及机制
目的 探讨microRNA(miR)-15a在阿尔茨海默病(AD)中的作用及机制.方法 Realtime PCR法检测miR-15a在AD组及正常健康(对照组)血液中的表达.将PC12细胞随机分为正常对照组、模型组〔20 μmol/L淀粉样蛋白(Aβ25~35)〕,阴性对照组(miR-15a NC+20 μmol/L Aβ25~35)及促进组(miR-15a mimics+20 μmol/L Aβ25~35).MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,紫外分光光度法检测天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、Caspase9活性,Western印迹检测B淋巴细胞瘤(Bcl)-2及c-myc蛋白表达.结果 与对照组比较,AD组miR-15a表达量显著下调;与正常对照组比较,模型组及阴性对照组中细胞活力降低,细胞凋亡率、Caspase3及Caspase9活性提高,Bcl-2及c-myc表达量下调(均P<0.01);与模型组及阴性对照组比较,促进组细胞活力提高,细胞凋亡率、Caspase3及Caspase9活性降低,Bcl-2及c-myc表达量上调(均P<0.01).结论 miR-15a在AD患者中低表达,上调miR-15a表达能抵抗Aβ25~35诱导的PC12细胞凋亡.
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microRNA-15a模拟物对人关节软骨细胞增殖与凋亡的影响
目的:近年来研究表明,关节软骨细胞凋亡在骨关节炎发病过程中起到了重要的作用,本文旨在探讨microma-15a模拟物对于原代人膝关节软骨细胞增殖与凋亡的影响.方法:取人外伤性截肢后的膝关节软骨,采用双酶消化法分离获得人膝关节软骨细胞,并进行体外培养,通过甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行软骨细胞鉴定.将培养的软骨细胞传代后取第1代细胞,分为实验组和对照组,实验组采用mir-15a模拟物(has-mir-15a mimics)转染软骨细胞,上调软骨细胞内mir-15a的表达量;对照组分为阴性对照组、空白对照组.采用MTT法测定细胞增殖曲线,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果:原代细胞中细胞呈多角形、圆形与梭型,贴壁生长;甲苯胺蓝染色胞质呈深蓝色,Ⅱ型胶原染色胞质呈黄褐色,为特异性染色.经统计学分析,实验组与对照组相比增殖速率明显下降(P＜0.05).实验组凋亡率(7.13％±0.57)与阴性对照组凋亡率(2.66％±0.15)相比明显增高(P＜0.05).结论:采用双酶消化法成功分离并培养具有生物学特性的原代人膝关节软骨细胞,通过转染mir-15a模拟物外源性增加关节软骨细胞内mir-15a表达量可显著促进其凋亡并抑制其增殖,为阐明骨关节炎发病机制提供了新的理论依据,为临床治疗提供了新的靶点.
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miR-15a和miR-16-1模拟物对人骨肉瘤细胞系SOSP-9607凋亡和增殖的影响水
目的:探讨miR-15a和miR-16-1 模拟物对于人骨肉瘤细胞系SOSP-9607 凋亡和增殖的影响.方法:将SOSP-9607 细胞分为实验组和对照组.实验组分为miR-15a组、miR-l6-1组、miR-15a+miR-16-1组.以miR-15a组为例.采用miR-15a模拟物(hsa-miR-15a mimics)上调 SOSP-9607细胞内的miR-15a 表达量.对照组分为阴性对照组和空白对照组.采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,并计算细胞增殖效率.结果:通过统计学分析,实验组凋亡率与阴性对照组凋亡率相比明显增高(P<0.05);实验组的细胞增殖率明显低于对照组(P<0.05).结论:上调SOSP-9607细胞内miR-15a和miR-16-1 的表达量可促进SOSP-9607 细胞的凋亡并抑制其增殖.
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miR-15a/miR-16-1增强Raji细胞对阿糖胞苷的敏感性
目的 探讨miR-15a和miR-16-1寡核苷酸能否增强Raji细胞对阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)的敏感性.方法 将化学合成的miR-15a和miR-16-1寡核苷酸利用脂质体2000转染入Raji细胞后,联合Ara-C,CCK8法检测Ara-C的IC50值变化;锥虫蓝细胞计数法检测细胞增殖活性;Hoechst染色观察细胞的凋亡形态;流式细胞仪Annexin V/PI双染法测凋亡率.结果 miR-15a和miR-16-1寡核苷酸转染Raji细胞后,再加入Ara-C,24 h Ara-C的IC50值分别为10.41和10.86,明显低于单用Ara-C组(15.43)和随机序列联用Ara-C组(14.92,P<0.05).锥虫蓝拒染法结果显示,转染后各时间点miR-15a/miR-16-1+Ara-C组较单用miR-15a/miR-16-1组、单用Ara-C组及随机序列+Ara-C组明显抑制了Raji细胞的生长,Ho-echst染色可见大量凋亡细胞;流式细胞仪AnnexinV/PI双染色法检测显示,miR-15a+Ara-C组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为20.93%和25.27%,miR-16-1+Ara-C组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为20.69%和23.13%,均明显高于miR-15a组、miR-16-1组、Ara-C组及随机序列+Ara-C组(P<0.05),后四者的早期凋亡率分别为6.99%、4.73%、10.88%和14.39%,晚期凋亡率分别为10.08%、10.64%、11.83%和11.93%.结论 miR-15a和miR-16-1寡核苷酸可增强Raji细胞对Ara-C的敏感性.
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子宫内膜癌组织中miR-15a的表达变化及其对子宫内膜癌细胞侵袭转移的影响
目的：探讨miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达及其对子宫内膜癌细胞侵袭转移的影响。方法选取原发性子宫内膜癌组织及癌旁组织标本79份，利用荧光定量PCR检测组织中miR-15a的表达。将miR-15a模拟物（miR-15a转染组）、无关序列模拟物（非转染组）转染入RL95-2人子宫内膜癌细胞，并设立阴性对照组。利用荧光定量PCR检测RL95-2细胞中miR-15a表达，利用Transwell肿瘤细胞迁移实验和Transwell肿瘤细胞侵袭实验对RL95-2细胞迁移能力和侵袭力进行检测，利用Western blotting法检测RL95-2细胞中基质金属蛋白酶2（ MMP-2）的表达。结果 miR-15a在子宫内膜癌组织中相对表达量（2．37±0．96）显著低于癌旁组织（4．83±1．27）（ P＜0．05）；miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达与FIGO分期、淋巴结转移和远处转移有关（ P均＜0．05）；miR-15a转染组细胞中miR-15a相对表达量（8．71±2．65）显著高于阴性对照组（3．62±1．97）和未转染组（3．59±1．83）（P均＜0．05）；miR-15a转染组穿膜细胞数显著低于阴性对照组和未转染组（P均＜0．05）；miR-15a转染组细胞中MMP-2蛋白相对表达量（1．62±0．59）显著低于阴性对照组（4．57±2．05）和未转染组（4．64±2．17）（P均＜0．05）。结论 miR-15a在子宫内膜癌组织中呈低表达，过表达的miR-15a可通过抑制MMP-2蛋白抑制肿瘤细胞的侵袭及转移。
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miR -15 a对肝癌 HepG2细胞增殖和 DLK1表达的影响
目的：探讨miR-15a对肝癌中DLK1表达的调节作用和对肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法常规培养肝癌细胞系HepG2，经脂质体转染miR-15a模拟物mimic和抑制物inhibitors及各自阴性对照片段NC 48 h后，用RT-PCR和Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平，MTT和流式细胞术（FCM）检测细胞增殖和周期情况。结果 RT-PCR和Western blot结果显示转染miR-15a mimic后DLK1的mRNA和蛋白表达量降低（P＜0.05），而转染miR-15a inhibitors后DLK1的mRNA和蛋白表达量升高（P＜0.05）；MTT结果显示转染miR-15a mimic后细胞的增殖能力明显减慢（P＜0.05），而转染miR-15a inhibitors 后细胞增殖能力加快（P＜0.05）。 FCM结果显示转染 miR-15a mimic 后细胞抑制在 G1期。结论过表达miR -15a能抑制DLK1的mRNA和蛋白表达，并抑制肝癌HepG2细胞的增殖。
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miR-15a在脓毒性休克内皮细胞模型中的表达及作用机制
目的 探究miR-15a在脓毒性休克内皮细胞模型中表达的意义及作用机制.方法 运用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测健康对照者(n=25),脓毒症患者(n=34)和脓毒性休克患者(n=26)血浆样本中miR-15a的表达水平.在人类脐静脉内皮细胞株HUVEC中转染miR-15a模拟物和miR-15a抑制物后,LPS刺激4h后,TER (transendothelial electrical resistance)法测定各组HUVEC跨内皮电阻,并计算通透性.构建荧光素酶报告载体pMIR-肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MYLK)的3'UTR,利用荧光素酶活性检测鉴定miR-15a的预测靶基因MYLK.qRT-PCR和Western blot法分别检测MYLK的mRNA和蛋白质的表达水平.结果 miR-15a在脓毒性休克患者血浆中的含量较脓毒症患者显著下降(P＜0.05).转染miR-15a模拟物能够抑制LPS作用HUVEC后细胞通透性的升高,而转染miR-15a抑制剂则能促进LPS作用HUVEC后细胞通透性的升高.转染miR-15a模拟物显著抑制荧光素酶的活性(P＜0.05),并显著下调HUVEC细胞中MYLK的mRNA(P＜0.05)和蛋白质的表达水平;相反地,转染miR-15a抑制物则显著上调了HUVEC细胞中MYLK的mRNA (P＜0.05)和蛋白质的表达水平.结论 miR-15a能够抑制LPS作用HUVEC后细胞通透性的改变,其可能的作用机制是下调了MYLK的表达.
