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铅离子对K562细胞红系分化的影响
目的 探索金属离子铅对K562细胞红系分化能力的影响.方法 应用胎盼蓝染色排除法分析铅离子对K562细胞的活性的影响;用联苯胺染色法检测铅离子作用下K562细胞的红系分化率;利用荧光标记抗体结合流式细胞技术分析铅离子处理K562细胞的细胞表面转铁蛋白受体CD71的表达.结果 铅离子(10-50μmol/L)分别作用24、48和72 h对K562细胞生长有浓度依赖性的抑制作用;铅离子(10～30 μmol/L)作用48 h对氯化高铁血红素诱导的K562细胞血红蛋白合成表现出较为明显的浓度依赖性抑制;铅离子(30μmol/L)作用48 h可一定程度地上调CD71在细胞表面的表达.结论 铅离子在一定的浓度作用下对K562细胞的诱导红系分化有抑制作用,为进一步应用K562细胞研究铅离子的红系血液毒性的细胞分子机制提供了一定的实验依据.
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模拟微重力对K562细胞增殖和分化的影响
目的 在航天飞行条件下航天员会出现"航天飞行性贫血",其分子机制尚不明确,实验观察了美国国家航空航天局(NASA)旋转式细胞培养系统模拟的微重力环境对重组人红细胞生成素(Epo)诱导K562细胞增殖分化的影响.方法 利用NASA旋转式细胞培养系统模拟的微重力环境,细胞计数分析细胞增殖情况,联苯胺染色法检测血红蛋白合成情况,应用免疫荧光和流式细胞术检测血型糖蛋白A(GPA)和转铁蛋白受体CD71在细胞表面的表达情况,应用荧光染料标记的鬼笔环肽和紫杉醇分别显示纤维型肌动蛋白和微管.结果 旋转培养的K562细胞的细胞增殖速度显著低于地面对照组;旋转培养还显著抑制Epo诱导的血红蛋白合成,联苯胺阳性细胞从Epo处理常规培养组的(15.0±1.2)%降为旋转培养组的(9.0±0.9)%;旋转培养还抑制GPA和CD71在细胞表面的表达.此外,旋转培养还促进微管解聚.结论 结果表明,旋转培养模拟微重力环境能抑制Epo诱导的K562细胞的增殖和分化;而模拟微重力环境使细胞骨架解聚可能使定位于细胞表面的蛋白(如GPA、CD71以及Epo受体等)在运输到细胞表面的过程发生障碍,从而降低对Epo的反应能力.
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5-氮杂-2'-脱氧胞苷和曲古抑菌素A对1,2,4-苯三醇调控K562细胞GATA结合蛋白1表达水平的影响
目的 GATA-1是在红系分化过程中发挥关键作用的转录因子,实验观察1,2,4-苯三醇对K562细胞GATA-1基因mRNA表达的影响,以及DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)的干预作用.方法 培养的K562细胞先经5、10和20μmol/L的1,2,4-苯三醇处理72 h,然后经氯化高铁血红素诱导后,应用联苯胺染色法检测细胞血红蛋白合成情况,采用反转录PCR检测细胞GATA-1的mRNA表达水平.培养的K562细胞先经20 μmol/L的1,2,4-苯三醇处理24或48 h后,或加入5-aza-CdR共同孵育48 h,或加入TSA共同孵育24 h,然后经氯化高铁血红素诱导后,采用反转录PCR检测细胞GATA-1的mRNA表达水平.结果 当K562细胞经5、10和20 μmol/L的苯三醇处理后,氯化高铁血红素诱导下的GA TA-1 mRNA表达水平分别只有对照组的91.1％、52.7％和23.2％,红系分化率分别只有对照组的93.3％、85.9％和65.5％.如果在20μmol/L的苯三醇处理24 h后加入5-Aza-CdR共同孵育48 h,氯化高铁血红素诱导的GA TA-1 mRNA表达水平相对于单纯苯三醇处理组有明显回升,达到对照组水平的80.0％.如果在20 μmol/L的苯三醇处理48 h后加入TSA共同孵育24 h,氯化高铁血红素诱导的GATA-1mRNA表达水平相对于单纯苯三醇处理组有明显回升,达到对照组水平的78.0％.结论 1,2,4-苯三醇可引起K562细胞GATA-1基因转录抑制,而DNA甲基化和组蛋白去乙酰化的表观遗传修饰方式的改变可能参与其中.
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苯代谢物1,2,4-苯三醇对K562细胞的凋亡诱导和分化抑制作用
目的 研究苯代谢产物1,2,4-苯三醇对K562细胞的增殖和分化的影响.方法 应用台盼蓝染色排除法计数活细胞数,应用碘化丙啶(PI)染色结合流式细胞术分析细胞周期分布情况,应用PI/FITC-annexin V双染结合流式细胞术分析细胞凋亡情况,联苯胺染色法计数分析K562细胞红系分化情况.结果 1,2,4-苯三醇(0.025～0.4 mmol/L)处理24 h对K562细胞产生浓度依赖性的增殖抑制.0.2 mmol/L的1,2,4-苯三醇作用24 h后,K562细胞G0/G1期细胞比例显著下降,S期和G2/M期细胞比例显著升高,细胞出现明显的细胞凋亡.用0.005 mmol/L浓度的1,2,4-苯三醇预处理24h的K562细胞经氯化高铁血红素诱导24、48和72 h的红细胞分化率分别是21.57%、40.62%和46.60%,均显著低于对照细胞相应时间点的红细胞分化率.结论 在本试验条件下,苯代谢物1,2,4-苯三醇在一定的浓度范围内对K562细胞表现出浓度依赖性的增殖抑制作用,这种增殖抑制作用可能是通过细胞周期改变进而引起细胞凋亡来实现的,而在无细胞毒性的低浓度下1,2,4-苯三醇就可明显抑制K562细胞的红系分化,1,2,4-苯三醇的凋亡诱导作用和分化抑制作用可能在苯血液毒性机制方面有重要意义.
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补肾益髓生血法AA大鼠含药血清对大鼠造血干细胞红系分化JA K2／S TA T5信号通路的影响
目的：探讨补肾益髓生血法再生障碍性贫血（Aplastic Anemia，AA，简称再障）大鼠含药血清对大鼠骨髓造血干细胞红系分化JAK2/STAT5信号通路的影响。方法：在前期整体动物实验的基础上，体外培养正常大鼠造血干细胞，诱导其定向红系分化，分为空白对照组、正常对照组、模型组、司坦唑醇组（康力龙组）、益髓生血组、温肾生血组和滋肾生血组，在培养体系中加入含药血清干预4d后，提取红系细胞总RNA及蛋白，分别采用RT-PCR和Western blot检测细胞JAK2、STAT5mRNA及蛋白表达情况。结果：与正常对照组相比，模型组细胞JAK2、STAT5mRNA及蛋白表达均明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，各治疗组JAK2、STAT5mRNA及蛋白表达明显升高（P＜0.01或P＜0.05）；滋肾生血组JAK2、STAT5mRNA及蛋白表达高于益髓生血组和温肾生血组（P＜0.05）。结论：补肾益髓生血法能够增强JAK2、STAT5的表达，可能通过影响JAK2/STAT5信号通路来促进红系细胞的分化成熟，其中滋肾生血法优于益髓生血法和温肾生血法。
关键词： 补肾益髓生血法 再障 造血干细胞 红系分化 JAK2/STAT5 信号通路 -
Nrf2通过调控EZH2的表达促进DMSO诱导的MEL细胞红系分化
目的 探讨Nrf2/EZH2通路参与DMSO诱导MEL细胞红系分化的作用及相关分子机制.方法 以MEL细胞为靶细胞,DMSO为刺激源,联苯胺染色法检测细胞红系分化情况;免疫印迹检测EZH2和Nrf2蛋白表达水平.结果 DMSO可显著诱导MEL细胞红系分化,同时EZH2和Nrf2表达水平也明显升高.通过使用Nrf2诱导剂TBHQ及Nrf2 shRNA,证明Nrf2调控MEL细胞中EZH2的表达.敲低Nrf2和EZH2的表达能够抑制DMSO诱导的MEL细胞红系分化.结论 Nrf2可通过调控EZH2的蛋白水平从而发挥促进MEL细胞红系分化的作用.
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MicroRNA-144调控红系分化
目的 研究microRNA-144(miR-144)通过调节视网膜母细胞瘤蛋白(RB)对红系分化的影响.方法 用氯化高铁血红素(hemin)诱导人慢性髓系白血病细胞系K562可实现在体外模拟红系分化过程,使用Real-time PCR检测miR-144表达;利用体外合成的寡核苷酸(mimic-144)转染K562细胞,检测过量表达miR-144对红系分化的影响;结合生物信息学分析、双荧光素酶报告系统和Western blot寻找并确定miR-144的靶基因.结果 miR-144在hemin诱导的K562红系分化过程中表达显著升高(P<0.05),在K562细胞中过表达miR-144可以促进血红蛋白(γ-globin)和红细胞表面标志CD235a的表达和积累;RB为miR-144的靶基因之一;在K562红系分化中,RB呈先略升后降的趋势,以0 h为参照,12 h RB/GAPDH灰度值低为:0.092±0.007(P<0.05).结论 miR-144通过负调控RB的表达促进heroin诱导的K562红系分化.
关键词： microRNA-144 红系分化 视网膜母细胞瘤蛋白 -
CDK2促进K562细胞早期红系分化
目的 探讨细胞周期调节蛋白CDK2对K562细胞红系分化的影响.方法 分别用CDK2表达质粒和干扰RNA分子转染K562细胞,用Western blot法检测过表达或干扰效率,使用real-time PCR和联苯胺染色法检测K562细胞分化.结果 CDK2在K562细胞红系分化早期呈现表达上升趋势;在K562细胞中过表达CDK2可促进hemin诱导的红系分化;反之,干扰K562内源的CDK2表达会对K562红系分化产生抑制作用.结论 CDK2在K562细胞早期红系分化过程中发挥促进作用.
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RNAi介导的pirin低表达降低了K562细胞的红系分化能力
目的 研究pirin低表达对人红白血病细胞系K562红系分化和细胞活力的影响.方法 通过短发卡RNA(shRNA)干扰技术,构建pirin低表达细胞稳定株,用Western blot方法对干扰效果进行检测,并用联苯胺染色和MTT法分别检测下扰pirin后对K562细胞的红系分化和增殖的影响.结果 转染了pirin-shRNA的细胞其pirin的表达量明显低于对照组(随机干扰组),pirin低表达与对照组相比对细胞增殖无影响,但在诱导剂诱导分化过程中,血红蛋白的合成出现了显著性的降低(P＜0.05).结论 Pirin低表达不影响K562细胞的增殖能力,但能降低其红系分化能力.
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药物诱导的小鼠红白血病细胞沿红系分化过程中基因表达的差异显示分析
应用mRNA差异显示技术分析了药物诱导MEL细胞沿红系分化过程中基因表达的改变.以六个锚定引物和六个随机引物共36种组合进行差异显示分析,得到67个差异片段.对部分片段进行克隆测序,获20个片段的序列,其中12个新的表达序列标签.以反向斑点杂交检测部分差异显示带的差异性,阳性率为27/39(69%).
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IFN-γ促进红系终末分化
目的 探索IFN-γ对体外红系终末分化的调节作用.方法 用real-time PCR法检测IFN-γR1/R2在血红素(he-min)诱导K562细胞红系分化过程中的表达变化.以IFN-γ处理hemin诱导的K562细胞和人脐血CD34+细胞来源的红系细胞,用real-time PCR检测红系分化标志物CD235a和CD71表达.用联苯胺染色展现IFN-γ处理的K562细胞中血红蛋白含量,通过Westem blot和real-time PCR检测红系相关转录因子GATA1和NFE2的表达.结果 Hemin诱导下分化的K562细胞中IFN-γR1/R2 mRNA先减少后增高,IFN-γ促进K562及造血干祖细胞红系分化晚期CD71及CD235a的表达,增加联苯胺阳性染色率.IFN-γ对红系分化的促进作用具有时间依赖性.机制研究表明IFN-γ可促进红系关键转录因子NFE2的表达.结论 IFN-γ促进K562细胞及人脐血造血干祖细胞的红系终末分化.
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SLC30A3促进人髓性白血病细胞K562向早期红系分化
目的 研究SLC30A3在红系分化中的作用.方法 在人髓性白血病K562细胞系中用质粒载体过表达SLC30A3后,检测细胞红系分化指标CD235、ε-、γ-和β-珠蛋白的表达量及细胞增殖速度.流式细胞术检测CD235的表达,荧光实时定量PCR检测珠蛋白mRNA水平,Western blot法检测转录因子GATA-2蛋白水平,MTS法检测细胞增殖速度.结果 过表达SLC30A3使K562细胞的红系分化特异标志CD235的表达升高,CD235阳性细胞率由对照组的34.25％±16.89％增加至95.7％±0.14％ (P＜0.01),ε-、γ-和β-珠蛋白的表达明显升高,红系分化相关转录因子GATA-2的表达降低,细胞增殖速度加快.结论 SLC30A3促进人髓性白血病K562细胞系向早期红系分化.
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EKLF转录激活miR-96在红系分化过程中表达
目的 研究红系分化过程中,红系分化特异转录因子EKLF对miR-96的表达调控.方法 氯化高铁血红素(Hemin)诱导人K562细胞(人红白血病细胞系)向红系分化,real-time PCR检测miR-96表达.生物信息学分析miR-96转录起始点上游可能的EKLF结合位点.并经染色质免疫共沉淀(ChIP)与双荧光报告基因实验验证EKLF与这些位点结合的生物学意义.结果 Hemin诱导K562细胞向红系分化过程中,miR-96表达显著升高,且在48h表达高(3.94±0.64,P＜0.05).生物信息学分析显示miR-96转录起始位点上游2.0 kb内含有多个EKLF结合位点.经ChIP验证这些位点有EKLF的结合,且EKLF与这些位点结合能募集RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)结合,起始转录.进一步的双荧光报告基因实验也证明EKLF对miR-96转录起始点上游序列具有转录激活作用.结论 EKLF转录激活miR-96在红系分化过程中的表达.
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P38-2G4蛋白在红系细胞分化过程中的动态表达分析
目的 分析小鼠P38-2G4蛋白在红系细胞分化中的表达及功能,初步研究该蛋白是否参与红系分化过程.方法 制备E10.5 ～E16.5胎肝细胞、FVA细胞及诱导剂丁酸钠和六亚甲基二乙酰胺诱导不同时间的小鼠红白血病细胞MEL,用Western blot检测P38-2G4蛋白在上述3种细胞中的表达,同时以联苯胺染色法检测细胞分化的标志蛋白血红蛋白的表达.结果 在不同分化期的胎肝细胞中,P38-2G4蛋白的表达先升高后降低;在FVA细胞分化过程中,P38-2G4表达量同样先增加后减少;而在诱导剂诱导MEL细胞分化过程中,P38-2G4表达量呈下降趋势.结论 P38-2G4蛋白在不同红系分化组织中的差异性表达提示该蛋白参与了小鼠红系细胞的分化过程.
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miR-34 a-5 p抑制K562细胞红系分化
目的：探索miR-34a-5p对K562细胞红系分化的影响。方法分别用miR-34a-5p模拟物和反义抑制寡核苷酸转染K562细胞，用real-time PCR法检测过表达或干扰效率，并进一步用流式细胞术和联苯胺染色法检测K562细胞向红系的分化情况；通过Western blot方法检测miR-34a-5p的靶基因。结果 miR-34a-5p在K562细胞红系分化过程中呈现表达下降趋势；在K562细胞中过表达 miR-34a-5p 可抑制 hemin 诱导的红系分化（ P ＜0.05）；反之，干扰K562内源的miR-34a-5p表达会对K562红系分化产生促进作用（ P＜0.01）；另一方面，miR-34a-5p通过靶向抑制c-MYB的表达抑制细胞向红系分化。结论 miR-34a-5p通过抑制c-MYB在K562细胞早期红系分化过程中发挥促进作用。
关键词： miR-34a-5p K562 c-myb 红系分化 -
转录因子Sp1抑制K562细胞红系分化
目的 研究转录因子Sp1在K562细胞诱导向红系分化过程中的表达变化,并确定其对于红系分化及珠蛋白表达的影响.方法 用定量PCR及Western blot的方法确定Sp1在红系分化过程中的表达情况.通过RNAi的方法抑制Sp1的表达,并通过联苯胺染色确定K562细胞中血红蛋白的表达情况,同时定量PCR的方法分析红系分化相关基因的表达,流式细胞技术检测红系分化过程中表面标志蛋白的表达情况.结果 在hemin诱导的K562细胞以及促红细胞生成素EPO诱导的造血干细胞向红系分化过程中,Sp1的mRNA及蛋白水平均呈明显下降,提示其可能负调节红系分化过程.在K562细胞中抑制Sp1的表达则可明显提高K562细胞中的血红蛋白含量,促进γ-,ε-珠蛋白,CD71,CD235a基因的表达,同时CD71,CD235a阳性细胞比例明显增加.结论 以上结果说明转录因子Sp1负调节红系分化过程,抑制Sp1的表达可提高K562细胞中珠蛋白的表达,并促进K562细胞向红系分化.
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ZNF330促进红系分化
目的：探索ZNF330对红系分化的影响及作用机制。方法用hemin诱导K562细胞向红系分化，用real-time PCR检测ZNF330的表达；ZNF330的RNAi 慢病毒颗粒感染CD34＋细胞并向红系诱导后用real-time PCR检测CD235a和γ-globin的表达。在293T／17细胞中，用双荧光报告系统检测ZNF330是否具有转录激活作用；在293T／17细胞中，用Co-IP检测ZNF330与mRNA降解途径中ZNF408的相互作用。结果在hemin诱导的K562细胞向红系分化过程中ZNF330表达逐渐升高；抑制ZNF330后，CD34＋细胞中红系分化标志CD235 a和γ-globin的表达下降（ P＜0.05）；未检测到ZNF330的转录激活结构域；双向Co-IP证明ZNF330与ZNF408是相互作用蛋白。结论ZNF330促进红系细胞分化，一个可能的机制是通过与一个参与mRNA降解途径的因子ZNF408的相互作用。
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eIF4H低表达对MEL细胞增殖和红系分化的影响
目的 探究eIF4H低表达对MEL细胞增殖和红系分化的影响.方法 重组质粒载体eIF4H-shRNA-1或eIF4H-shRNA-2与pCMV-VSVG和pCMV-dR8.2共同转染HEK293T细胞,获得可使eIF4H低表达的慢病毒.慢病毒侵染MEL细胞,获得eIF4H低表达的MEL细胞稳定株,Western blot检测干扰效果.MTT检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;联苯胺染色观察红系分化情况.结果 与对照组相比较,eIF4H-shRNA-2组细胞eIF4H表达明显下调,细胞增殖能力明显减弱(P＜0.01),G1期细胞比例明显增加;经丁酸钠处理后eIF4H-shRNA-2组联苯胺阳性细胞明显增加(P＜0.01).结论 成功构建eIF4H低表达MEL稳定株;eIF4H低表达抑制MEL细胞增殖能力;eIF4H低表达不能诱导MEL细胞红系分化,但可促进丁酸钠诱导MEL细胞红系分化.
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人类ERMAP-siRNA对Ara-C诱导K562细胞向红细胞系分化过程的影响
为探讨人类ERMAP基因在红细胞分化发育过程中的作用,本研究设计ERMAP-dsDNA,制备ERMAP-shRNA表达质粒,并建立稳定表达ERMAP-shRNA的K562细胞系(即ERMAP-shRNA/K562细胞系),观察Ara-C诱导ERMAP-shRNA/K562细胞向红细胞系分化过程中,细胞形态、联苯胺染色细胞阳性率和细胞表面标记等的变化,同时以FQ-PCR检测K562细胞人类ERMAP基因表达量的变化.结果发现:经Ara-C诱导72小时,ERMAP-shRNA/K562细胞与对照组比较,体积较大,胞浆量较少,着色大部分呈深蓝色或蓝紫色,部分细胞仍可见1-2个核仁;联苯胺染色阳性率由1.17%增加至2.04%(P＜0.05),但仍低于Ara-C诱导K562组(P＜0.05);CD36-/CD235a+细胞比例从8.83%增至11.28%,CD36+/CD235a+细胞比例从1.23%增至2.64%,CD36+/CD235a-细胞比例从0.59%增至1.47%,均明显低于Ara-C诱导K562细胞组;与此同时,ERMAP-shRNA/K562细胞ERMAP基因的表达量从诱导前的2.52×10-3缓慢增加至诱导72小时后的4.53×10-3,明显低于K562细胞组.结论:ERMAP-shRNA可抑制Ara-C诱导K562细胞向红系分化的过程,这进一步提示人类ERMAP基因与红细胞分化发育过程有关.
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蛋白磷酸酶2A催化亚基β(PPP2Cβ)过表达慢病毒载体系统的构建及对K562红系分化的影响
目的:构建蛋白磷酸酶2A的催化亚基PPP2Cβ慢病毒表达载体,获得较高滴度慢病毒颗粒,感染K562细胞建立稳定株,检测过表达PPP2Cβ对K562红系分化的影响.方法:将PPP2Cβ的CDS序列插入到第二代慢病毒表达载体FUGW,并与包装质粒pMD2G和psPAX2共转染293T细胞,36、48h分两次收集慢病毒上清,应用流式细胞术检测病毒滴度.获得的病毒感染K562细胞,应用Western blot检测过表达效果.采用联苯胺染色以及实时定量PCR检测过表达PPP2Cβ对K562红系分化的影响.结果:成功构建了PPP2Cβ慢病毒表达载体,利用慢病毒系统包装PPP2Cβ的慢病毒,获得了高滴度的慢病毒颗粒,并成功建立了PPP2Cβ的K562细胞稳定株,促进了K562向红系分化.结论:过表达PPP2Cβ能使K562细胞自发的向红系分化.
