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EKLF转录激活miR-96在红系分化过程中表达
目的 研究红系分化过程中,红系分化特异转录因子EKLF对miR-96的表达调控.方法 氯化高铁血红素(Hemin)诱导人K562细胞(人红白血病细胞系)向红系分化,real-time PCR检测miR-96表达.生物信息学分析miR-96转录起始点上游可能的EKLF结合位点.并经染色质免疫共沉淀(ChIP)与双荧光报告基因实验验证EKLF与这些位点结合的生物学意义.结果 Hemin诱导K562细胞向红系分化过程中,miR-96表达显著升高,且在48h表达高(3.94±0.64,P＜0.05).生物信息学分析显示miR-96转录起始位点上游2.0 kb内含有多个EKLF结合位点.经ChIP验证这些位点有EKLF的结合,且EKLF与这些位点结合能募集RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)结合,起始转录.进一步的双荧光报告基因实验也证明EKLF对miR-96转录起始点上游序列具有转录激活作用.结论 EKLF转录激活miR-96在红系分化过程中的表达.
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miR-96与转移抑制因子1是前列腺癌骨转移潜在的生物学标志物
目的 探讨miR-96和转移抑制因子1(MTSS1)在前列腺癌(PCa)组织中的表达及其临床意义.方法 收集PCa患者标本89例,癌旁组织作为正常对照,分别用原位杂交及免疫组化检测PCa组织及癌旁组织中miR-96和MTSS1的表达水平,并对二者进行相关性分析.结果 89例PCa组织中miR-96阳性表达率为87.64％,显著高于癌旁组织(P＜0.01);而MTSS1蛋白阳性表达率为16.85％,显著低于癌旁组织(P＜0.01);miR-96的表达随着Gleason评分和临床分期演进而增加(P＜0.05),有骨转移的miR-96的表达高于无骨转移组(P＜0.05);MTSS1的表达随着Gleason评分和临床分期演进而下调,且有骨转移的MTSS1的表达显著低于无骨转移组(P＜0.01);miR-96表达与MTSS1的表达呈显著负相关(P＜0.01).结论 miR-96与MTSS1可能是PCa骨转移的重要生物学标志.
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miR-96对胃癌细胞侵袭迁移的影响
目的:分析MicroRNA-96(miR-96)在胃癌组织中的表达情况;体外研究miR-96反义寡核酸技术(antisense oligonucleotide,ASO)对胃癌细胞侵袭和迁移的影响.方法:运用荧光定量PCR检测122例胃癌组织及对应正常组织中miR-96的表达;通过miR-96 ASO降低胃癌细胞中miR-96的表达,采用Transwell实验和划痕实验观察miR-96ASO对胃癌细胞侵袭和迁移能力的影响,同时运用Western blot的方法检测侵袭相关蛋白的表达变化.结果:在122例胃癌病例中,62.30％(76/122)的胃癌组织miR-96表达明显高于对应正常组织(P＜0.05);与空白对照组和转染无义ASO组相比,miR-96 ASO可以显著降低miR-96的表达(P＜0.05); Transwell实验和划痕实验结果显示转染miR-96 ASO后,胃癌细胞的侵袭迁移能力明显下降,同时相关侵袭蛋白基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和MMP9表达下降(P＜0.05).结论:miR-96在胃癌组织中表达上调,降低miR-96的表达可有效抑制胃癌细胞的侵袭和迁移.miR-96有可能成为胃癌侵袭转移调控的新靶点.
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Let-7a和miR-96对胰腺癌K-RAS基因的调节作用
目的 探讨miRNA分子Let-7a和miR-96对胰腺癌系K-RAS基因的抑制作用及其致病机制.方法 通过检测胰腺癌细胞系miRNA分子(Let-7a和miR-96)水平、K-RAS基因mRNA和蛋白质表达水平,观察Let-7a和miR-96水平与K-RAS蛋白表达的关系；并通过升高胰腺癌细胞Let-7a和miR-96水平,检测其对K-RAS蛋白表达水平的影响.结果 胰腺癌细胞系K-RAS的mRNA与蛋白质表达均保持在一个较高的水平；胰腺癌细胞系miRNA分子Let-7a和miR-96水平均较低；升高胰腺癌细胞Let-7a或miR-96水平会降低K-RAS蛋白表达水平.结论 正常状态下,Let-7a和miR-96通过调控K-RAS基因发挥对肿瘤的抑制作用,胰腺癌细胞的Let-7a和miR-96水平呈一定程度的降低,削弱了对K-RAS基因的抑制作用,进而参与肿瘤的致病过程.
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COCH基因与miR-96的相关性研究
目的 研究COCH基因与小分子RNA miR-96的相互作用,探讨miR-96的表达变化是否对COCH基因有影响.方法 在细胞水平上,转染miR-96的miRNA模拟物和miRNA抑制物而改变miR-96的表达水平,通过荧光定量PCR检测COCH基因的表达变化情况.结果 miR-96的表达变化与COCH基因的表达变化呈正相关关系.结论 结果显示miR-96并没有对COCH基因进行负调控,而是呈现协同作用,甚至miR-96有可能作用于其他相关因子而导致COCH基因表达上调,从而影响COCH基因在耳蜗及前庭功能变化中的作用.
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MiR-96调控FOXO1基因抑制膀胱癌T24细胞凋亡
目的 肿瘤抑制基因FOXOl基因在包括膀胱癌在内的多种肿瘤中表达下调,但其参与肿瘤的分子机制不是很明确,本文探讨MiR-96是否调控FOXO1基因抑制膀胱癌T24细胞凋亡.方法 应用生物学信息软件结合定量PCR和Northern blot预测并验证FOXO1基因靶向miRNA;通过转染靶向micRNA的模拟物,Western blot检测FOXO1蛋白的表达,流式细胞仪检测膀胱癌T24细胞的凋亡情况.结果 在FOXO1基因的3′端发现一个保守的miR-96结合位点,其在膀胱癌中表达上调,且能明显抑制FOXO1基因的表达,且miR-96表达上调能明显抑制膀胱癌T24细胞凋亡.结论 miR-96靶向调节FOXO1基因参与的细胞凋亡过程可能是其参与膀胱癌发生的分子机制之一.
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miR-96在人乳腺癌中表达及其对乳腺癌细胞侵袭和迁移活性的影响
目的 研究miR-96在人乳腺上皮细胞株和乳腺病变组织中表达状况及其对人乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响.方法 抽提4株人乳腺上皮细胞系和28例人乳腺病变新鲜组织总miRNA,实时定量PCR方法检测它们miR-96的表达状况;脂质体介导的转染方法将miR-96抑制物转染人乳腺癌MCF-7细胞株;通过MTS试剂盒检测细胞增殖能力,Transwell侵袭和迁移实验检测细胞侵袭及迁移能力.结果 miR-96在高侵袭乳腺癌细胞株中表达较低侵袭乳腺细胞明显下调(P<0.01);人乳腺癌组织中miR-96表达较乳腺良性病变组织明显下调(P<0.01);miR-96抑制物转染乳腺癌MCF-7后,乳腺癌细胞侵袭和迁移活力较阴性对照组细胞明显增强(P<0.05),而细胞增殖活力改变无统计学意义(P>0.05).结论 miR-96在人乳腺癌细胞株和乳腺癌组织中存在表达下调,并对人乳腺癌细胞的侵袭及迁移能力可能存在一定负性调控作用.
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转录因子ETS-1对乳腺癌细胞增殖作用的影响
目的:研究转录因子ETS-1通过调节miR-96对乳腺癌细胞增殖的影响.方法:通过RNAi技术下调乳腺癌细胞MCF-7中ETS-1的表达后,检测miR-96的表达;运用生物信息学方法预测转录因子ETS-1的结合位点,染色体免疫共沉淀反应加以验证;将miR-96转染入乳腺癌细胞MCF-7,观察对乳腺癌细胞增殖和克隆形成的影响.结果:抑制ETS-1表达,miR-96在乳腺癌细胞MCF-7中的表达明显上调(P<0.01);ETS-1通过结合在miR-96启动子区域,调节miR-96的表达;与对照组比较,过表达miR-96后,MCF-7的增殖能力和克隆形成能力均明显增强(P<0.01).结论:ETS-1通过调节miR-96的表达,影响乳腺癌细胞增殖和克隆形成能力,有望在乳腺癌治疗中成为新的靶标.
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miR-96抑制急性髓系白血病细胞的体外研究
目的 探讨miR-96在急性髓系白血病中的表达及调控机制.方法 采用逆转录-聚合酶链反应检测miR-96在急性髓系白血病和健康人中的表达.应用miR-96小分子类似物转染人急性髓系白血病细胞系HL-60和K562细胞,采用CCK-8试剂盒检测miR-96和加入阿霉素后对细胞增殖和活力影响.通过流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.利用生物信息软件预测miR-96的潜在靶基因,RT-PCR和WB检测靶基因mRNA和蛋白表达.结果 miR-96在急性髓系白血病中表达降低,抑制HL-60和K562细胞增殖,促进细胞凋亡;Western blot检测显示,miR-96显著抑制内源性KRAS的表达(P<0.05).结论 miR-96通过靶向KRAS基因调控急性髓系白血病细胞增殖,为急性髓系白血病治疗提供新的治疗策略.
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miR-96调控生育酚结合蛋白的表达及前列腺癌细胞生长
目的 筛选并鉴定调控生育酚结合蛋白(TAP)的miRNAs,并观察其对前列腺癌细胞增殖的影响.方法 生物信息学分析和双荧光报告筛选调控TAP的miRNAs；以前列腺组织总RNA1μg反转录并扩增TAP基因(SEC14L2,Gene ID:23541)及其3'端非翻译区(3’-UTR),克隆入p3 ×FLAG-CMVTM-7.1载体；miR-96类似物与TAP表达载体pCMV7.1-TAP、pCMV7.1-TAP-3’-UTR转染前列腺癌细胞DU-145,Western blot检测TAP的表达,噻唑蓝(MTT)法观察DU-145的增殖.结果 miR-96可作用于TAP的3’-UTR；pCMV7.1-TAP-3’-UTR分别经Not Ⅰ/BglⅡ、Sal Ⅰ/Xba酶切后电泳,在1200、1400 bp附近有目的条带,测序结果与Gene Bank报道一致.Western blot检测结果表明miR-96可使TAP表达下降65.1％ (P ＜0.05).MTT分析显示对照组以及空载体转染组的细胞吸光度(A)值分别为0.972 ±0.023、0.967±0.042;pCMV7.1-TAP转染组、pCMV7.1-TAP-3’-UTR转染组的A值分别为0.625±0.037、0.731±0.043,差异均有统计学意义(P＜0.05)；pCMV7.1-TAP-3’-UTR和miR-96共转染组的A值为0.914±0.034,与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 miR-96可通过3’-UTR调节TAP的表达,并减弱TAP对前列腺癌细胞增殖的抑制作用.
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肺癌细胞中miR-96对其侵袭和迁移的影响
目的 分析miR-96在肺癌组织中的表达情况;体外研究miR-96反义寡核苷酸(ASO)对肺癌细胞侵袭和迁移的影响.方法 运用荧光定量PCR法检测116例肺癌组织及相应癌旁组织中miR-96的表达;通过miR-96 ASO降低肺癌细胞中miR-96的表达,采用Transwell实验和划痕实验观察miR-96ASO对肺癌细胞侵袭和迁移能力的影响,Western blot法检测侵袭相关蛋白的表达变化.结果 在116例肺癌病例中,63.80％ (74/116)的肺癌组织miR-96表达明显高于相应癌旁组织(P＜0.05);与空白对照组和转柒随机ASO组相比,miR-96 ASO可以显著降低miR-96的表达(P＜0.05);Transwell实验和划痕实验结果显示转染miR-96 ASO后,肺癌细胞的侵袭迁移能力明显下降,同时相关侵袭蛋白MMP2和MMP9表达下降(P＜0.05).结论 miR-96在肺癌组织中表达上调,降低miR-96的表达可有效抑制肺癌细胞的侵袭和迁移.miR-96有望成为肺癌侵袭转移调控的新靶点.
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miR-96在口腔鳞状细胞癌中的表达及作用的相关研究
目的:探讨miR-96在人口腔鳞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)组织标本和细胞系中的表达差异.方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测人OSCC组织标本和细胞系中miR-96的表达情况,并分析miR-96的表达与患者临床病理特征的相关性.体外转染miR-96抑制剂至OSCC细胞Tca8113中,qRT-PCR检测转染后Tca8113细胞中miR-96的表达变化,CCK-8实验和流式细胞术检测转染后Tca8113细胞的增殖和凋亡情况.结果:qRT-PCR结果显示miR-96在人OSCC组织标本和Tca8113细胞中异常高表达(P<0.01),并且miR-96的表达与临床分期和淋巴结转移密切相关(P<0.01).转染miR-96抑制剂后,Tca8113细胞中miR-96的表达水平明显降低(P<0.01),细胞增殖能力明显下降(P<0.01),细胞凋亡率明显上升(P<0.01).结论:miR-96在OSCC组织标本和细胞系中异常高表达,下调miR-96的表达能够明显抑制OSCC细胞的增殖,促进其凋亡.
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慢性再生障碍性贫血辨证分型与miR-96相关性研究
目的:分析慢性再生障碍性贫血辨证分型与细胞凋亡及miR-96表达的相关性.方法:将90例慢性再生障碍性贫血患者分为肾阳虚、肾阴阳两虚和肾阴虚各30例,另以10例健康志愿者作为正常对照组.采用流式细胞术检测骨髓单个核细胞凋亡率和Fas/FasL阳性率,采用实时荧光定量检测miR-96的表达.结果:慢性再生障碍性贫血患者骨髓单个核细胞凋亡率明显高于正常对照组(P＜0.05),肾阴虚组凋亡率高,肾阳虚组低,肾阴阳两虚组介于两者之间.慢性再生障碍性贫血患者骨髓细胞表面两种抗原Fas和FasL的阳性率均明显高于正常对照组(P＜0.05),三型比较,阳性率由高到低依次为肾阴虚组、肾阴阳两虚组和肾阳虚组.中医各证型组miR-96的相对表达水平均高于正常对照组(P＜0.05),三型比较以肾阴虚组与肾阴阳两虚组为高,但二者之间无统计学差异.结论:慢性再生障碍性贫血造血干细胞的凋亡可能与miR-96的异常表达相关,不同辨证分型之间存在miR-96表达的差异.
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miR-96对膀胱尿路上皮癌T24细胞生物学行为的影响
目的 观察miR-96对膀胱尿路上皮细胞癌T24细胞生物学行为的影响.方法 通过细胞转染,将miR-96抑制片段及miRNA阴性对照片段转染到T24细胞中,采用MTT法检测细胞的生长情况,使用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞的侵袭能力.结果 构建miR-96抑制剂及micro RNA 阴性片段,转染到T24细胞,细胞的转染效率达到80％以上可以进行后续的实验.转染48h后的T24细胞,生长速度较对照组明显减慢,差异有统计学意义(P＜0.01).转染48 h后的T24细胞凋亡率较对照组明显增加(P＜0.01).细胞侵袭实验观察到转染48 h后的T24细胞侵袭能力减弱(P＜0.01).结论 miR-96能够促进T24细胞的生长、增殖及侵袭,抑制T24细胞的凋亡.
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miR-96、miR-183基因遗传变异性与噪声性听力损伤关系研究
目的 对噪声暴露人群的miR-96与miR-183基因遗传变异性进行检测并探讨其意义.方法 根据职业健康检查结果,从广州市某空调压缩机厂和某汽车发动机厂噪声作业人群中选取50名有职业性噪声性听力损伤(ONHL)的工人为病例组,以年龄、性别按1∶2配对选取的100名听力正常工人为对照组,采集血样,应用ABI3730XL测序仪检测该人群miR-96与miR-183基因的遗传变异,重点关注rs41274239、rs73159662、rs41281222、rs72631833的基因型,并与国际人群频率报道数据进行比较.结果 miR-96和miR-183基因的上述单核苷酸多态性突变频率均为0.000,与国际人群报道的频率基本一致;且在这2个基因中未发现新的突变.结论 人群中miR-96和miR-183基因突变频率很低,开展相关研究对ONHL的预防和控制意义可能不大.
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前列腺癌miRNA表达谱及miR-96在氧化应激信号通路中的作用
[目的]检测miRNA在前列腺癌与正常前列腺组织的表达差异,并探讨表达异常的miRNA在前列腺癌发病中的作用.[方法]前列腺癌和正常前列腺组织样品(100 mg),Trizol法提取RNA,应用聚合酶链反应(PCR)芯片检测miRNA的表达；同时以250 μmol/L的过氧化氢(H2O2)刺激前列腺癌PC-3细胞4h,继续正常培养12h.检测不同时间点细胞内活性氧(ROS)水平,以实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-96在各组细胞中的表达.[结果]与正常前列腺组织相比,前列腺癌组织中miR-144、miR-216a上调5.9倍,miR-96上调30.4倍,miR-488、miR-873下调到4.9％,差异有统计学意义(P＜0.05).PC-3细胞内ROS为RWPE-l细胞的5.2倍(P＜0.05),miR-96在PC-3细胞中的表达为RWPE-1细胞的15.4倍(P＜0.05).H2O2刺激PC-3细胞1、4h后,胞内ROS为对照组的4.3、6.4倍(P均＜0.05),miR-96表达水平为对照组的10.2、18.9倍(P均＜0.05)；10、16h组胞内ROS为对照组的2.5倍、1.2倍,miR-96表达水平为对照组的2.7、1.9倍(P均＞0.05).[结论]在前列腺癌组织中发现了若干有表达差异的miRNA；miR-96参与前列腺癌细胞的氧化应激信号途径,可能是防治前列腺癌的重要分子靶点.
关键词： 前列腺癌 miRNA PCR芯片 氧化应激 miR-96 -
miR-96靶向血管生成素-1基因对子宫内膜异位症子宫内膜干细胞增殖的影响
目的 研究miR-96靶向血管生成素-1(Ang-1)基因对子宫内膜异位症(EM)子宫内膜干细胞(EnSCs)增殖的调控作用.方法 分离培养EM患者EnSCs,流式细胞仪检测EnSCs表面标志物,RT-PCR检测EnSCs中miR-96和Ang-1的表达,Western blot检测Ang-1蛋白表达水平,miR-96 inhibitor转染EnSCs后,RT-PCR和Western blot检测miR-96、Ang-1和蛋白的表达,双荧光素酶报告基因检测miR-96与Ang-1的相互作用,MTT细胞增殖实验检测miR-96对EnSCs增殖的影响.结果 EnSCs表达CD140b和CD146,不表达CD31和CD34;EM患者EnSCs中miR-96和Ang-1的表达均较非EM明显升高(P<0.01),且两者的变化具有正相关性;转染miR-96 inhibitor可使EnSCs中miR-96和Ang-1表达降低;miR-96能与Ang-1的3′UTR特异性结合,调控Ang-1的表达活性;转染miR-96 inhibitor可使EnSCs的增殖能力下降.结论 miR-96通过靶向Ang-1促进EnSCs的增殖,可能在EM的发病过程中发挥作用.
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MiR-96靶向调控Sox6促进小鼠β细胞胰岛素合成与分泌
目的 探索miR-96对小鼠胰岛β细胞胰岛素合成与分泌的影响及其作用机制.方法 将小鼠胰岛β细胞系(MIN6细胞)分为四组,通过脂质体LipfectamineTM2000介导将miR-96 mimics、mimics NC、miR-96 inhibitor、inhibitor NC瞬时转染至4组细胞,荧光定量PCR和ELISA方法分别检测Ins1、Ins2 mRNA的表达及细胞上清液中的胰岛素浓度,生物信息学分析miR-96与Sox63'UTR的结合关系,荧光素酶报告基因检测miR-96与Sox6的结合情况,Western blot检测Sox6蛋白水平.结果 与对照组比较,miR-96 mimics能增加葡萄糖刺激下MIN6细胞胰岛素的合成与分泌(P<0.01),而miR-96 inhibitor可下调胰岛素的合成与分泌(P<0.01).miR-96与Sox63'UTR的553-561位点结合.过表达miR-96可显著抑制Sox6荧光素酶活性及MIN6细胞中Sox6蛋白的表达.结论 miR-96靶向沉默Sox6进而促进β细胞胰岛素的合成与分泌.
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miR-96-5p上调抑制肺腺癌细胞A549的增殖
目的 探讨miR-96-5p上调对A549增殖的影响.方法 miR-96-5p干扰和高表达载体、shR-NA-mTOR分别转染二甲双胍干预和未干预的A549后,观察细胞增殖和p21、cyclin D1、p-4E-BP、p-S6K的表达,萤光素酶试验鉴定miR-96-5p的靶点mTOR.结果 上调miR-96-5p可单独通过mTOR/p-4E-BP/p-S6K通路或协同二甲双胍抑制A549增殖.上调miR-96-5p可增加p21、降低cyclin D1表达,这可能与miR-96诱导的G1期阻滞有关.mTOR野生型3′UTR组萤光比值显著低于空白对照组和突变型组.结论 miR-96-5p通过靶向mTOR抑制A549增殖.
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Micro-RNA-96在缺血性脑卒中的表达研究
目的:检测缺血性脑卒中患者外周血血小板中miR-96的表达情况,探讨miR-96在缺血性脑卒中的意义.方法:观察组是100例初次发病的急性脑梗死[AIS]患者,对照组是50例的健康体检者.急性脑梗死组和对照组miR-96均采用qRT-PCR法来检测.结果:观察组miR-96表达水平明显高于对照组(p<0.05).急性脑梗死组及对照组二者的一般临床资料相比,P>0.05.结论:缺血性脑卒中患者miR-96明显高于健康者,有统计学意义,miR-96与缺血性脑卒中存在相关性.
