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EKLF转录激活miR-96在红系分化过程中表达
目的 研究红系分化过程中,红系分化特异转录因子EKLF对miR-96的表达调控.方法 氯化高铁血红素(Hemin)诱导人K562细胞(人红白血病细胞系)向红系分化,real-time PCR检测miR-96表达.生物信息学分析miR-96转录起始点上游可能的EKLF结合位点.并经染色质免疫共沉淀(ChIP)与双荧光报告基因实验验证EKLF与这些位点结合的生物学意义.结果 Hemin诱导K562细胞向红系分化过程中,miR-96表达显著升高,且在48h表达高(3.94±0.64,P＜0.05).生物信息学分析显示miR-96转录起始位点上游2.0 kb内含有多个EKLF结合位点.经ChIP验证这些位点有EKLF的结合,且EKLF与这些位点结合能募集RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)结合,起始转录.进一步的双荧光报告基因实验也证明EKLF对miR-96转录起始点上游序列具有转录激活作用.结论 EKLF转录激活miR-96在红系分化过程中的表达.
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小鼠骨髓间充质干细胞中RUNX1对WNT5A基因录活性的调控
本研究旨在探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)中转录因子RUNX1对WNT5A转录活性的调控,探索骨髓造血微环境对造血干细胞调控的机制.体外分离、培养、鉴定小鼠骨髓MSC；利用RTPCR方法检测小鼠骨髓MSC中RUNX1的表达；利用染色质免疫共沉淀研究RUNX1与WNT5A启动子之间的直接相互作用；利用逆转录病毒表达系统将RUNX1导入小鼠间充质干细胞中,用RT-PCR的方法检测基因的表达,研究RUNX1对WNT5A的转录调节作用.结果发现:体外分离培养得到的MSC经脂肪、成骨、软骨诱导后,分别用油红O、von Kossa、甲苯胺蓝染色呈阳性.RUNX1表达于小鼠骨髓来源MSC中,RUNX1能与WNT5A启动子直接结合,并时WNT5A具有转录激活作用.结论:小鼠骨髓MSC中表达RUNX1,WNT5A是RUNXl的一个下游靶基因,其转录活性受RUNX1调控.
关键词： 间充质干细胞 RUNX1:WNT5A 转录调控 染色质免疫共沉淀 -
采用ChIP-chip技术分析大鼠肺成纤维细胞转分化前后全基因组蛋白H3K4三甲基化水平的改变
目的：研究经二氧化硅（SiO2）染毒的肺成纤维细胞（LF）转分化前后全基因组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）三甲基化（met3）水平的改变。方法原代培养大鼠肺泡巨噬细胞（AM）和LF，采用transwell共培养，建立共培养模型，用100 mg·L-1游离SiO2粉尘染毒AM 24 h，收集LF细胞，免疫组织化学法对转分化后的LF进行表型鉴定。采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术（ChIP-chip）对LF全基因组蛋白H3K4met3进行高通量筛选，采用染色质免疫共沉淀-实时荧光定量聚合酶联反应技术（ChIP-qPCR）验证芯片结果，采用定量逆转录聚合酶联反应技术（qRT-PCR）检测H3K4出现显著差异的mRNA表达水平。结果通过对经SiO2染毒前后LF全基因组蛋白H3K4met3水平的对比，共筛选出1815个基因存在H3K4显著性差异（Cy3/Cy5比值>2.0或<0.5，NimbleScan V2.5软件），其中518个基因出现H3K4met3程度增高，1297个基因H3K4met3程度降低。随机挑选2个差异表达基因nfib和kpna3，以ChIP-qPCR和qRT-PCR方法验证，取得与CpG岛芯片一致的结果。结论经SiO2染毒的LF转分化前后全基因组蛋白H3K4met3水平存在显著改变。ChIP-chip技术有利于进一步揭示矽肺纤维化发生的分子机制，有助于发现新的蛋白标志物和基因干预靶点。
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在人类胰腺癌细胞BxPC3全基因组中受Notch-1胞内结构域和CBF-1转录共调控的靶基因特征分析
目的在人类胰腺癌细胞BxPC3全基因组水平上寻找受Notch-1胞内结构域和CBF-1共同转录调控的靶基因；分析它们的类型、功能和在基因组中的分布等特征值；并以此为基础预测Notch信号通路的潜在生物学功能和调控模式。方法染色质免疫共沉淀联合基于Illumina/Solexa平台的高通量测序。结果1)Notch-1胞内结构域和CBF-1两组样本有效read数分别为14287722和14289280个,与人类参考基因组唯一匹配的read数分别为11782027和11711920个；2)两组样本的peak数分别为385和492个,peak区域分别为318344 bp和383768 bp,都占全基因组的约0.01%；3)两组样本的peak区域几乎集中于基因间区和内含子区,只有不到5%位于外显子区；4)两组样本的peak对应基因数分别为150和287个,其中共有基因93个；5)通过基因聚类分析和数据库比对可以查到这些基因的名称、分类、基本功能和在基因组中的位置等具体信息。结论在人类胰腺癌细胞BxPC3全基因组范围内找到了更多在转录水平上受CBF-1和Notch-1胞内结构域共同调控的未知靶基因；初步明确了它们的类型、分布和功能等特征值；这些数据可以为进一步分析Notch信号通路潜在的生物学功能和调控模式奠定基础。
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过表达D5Stat5a促进前列腺癌细胞增殖及IGFBP-7基因启动子组蛋白甲基化
目的 探讨D5 Stat5a对人类前列腺癌细胞增殖的影响及其对胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP-7)表达的影响.方法 常规培养人前列腺癌细胞(DU145及PC3),并随机分为四组:对照组及三个实验组.对照组以不含外源基因的腺病毒感染,三个实验组细胞则以携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染,其病毒感染增殖活性(MOI)依次为10、20及30.四组细胞均在培养液中加入催乳素(50 ng/mL)以启动细胞信号转导.运用MTS方法检测细胞增殖;实时定量PCR检测抑癌基因IGFBP-7及EZH2 mRNA水平;染色质免疫共沉淀技术(ChIP)检测IGFBP-7基因启动子区域组蛋白甲基化程度;蛋白质印迹法检测IGFBP-7蛋白表达.结果 携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒感染能够呈剂量依赖式地促进前列腺癌细胞(DU145及PC3)增殖.如PC3细胞,对照组细胞的相对活细胞数为(1.362±0.018),三个实验组相对活细胞数分别为(1.453±0.022)(P＞ 0.05)、(1.649±0.020)(P＜ 0.05)及(1.829±0.027)(P＜ 0.05).实时定量PCR及蛋白印迹证明D5 Stat5a过表达明显下调IGFBP-7的表达.DU145及PC3对照组细胞IGFBP-7 mRNA相对值分别为(0.796±0.023)及(0.871±0.046),而感染携带D5 Stat5a cDNA的腺病毒(MOI 30)后,其IGFBP-7 mRNA相对值则分别下降到(0.148±0.019)(P＜ 0.01)及(0.078±0.021)(P＜ 0.01).染色质免疫共沉淀分析(ChIP-Assay)证实,D5 Stat5a导致IGFBP-7基因启动子区域组蛋白甲基化(H3K27Me3)水平显著上升.DU145细胞对照组与实验组,其沉淀DNA比例分别为(0.0176±0.0030)％及(0.0650±0.0099)％,两者差异有高度统计学意义(P＜0.01).此外,实时定量PCR检测表明,D5 Stat5a引起组蛋白甲基转移酶EZH2 mRNA大幅上升.DU145细胞对照组及D5 Stat5a感染组相对mRNA水平分别为(0.0033±0.0004)及(0.0160±0.0035),两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 转录因子D5 Stat5a能够显著促进人类前列腺癌细胞的增殖,其主要的表观遗传学机制在于D5 Stat5a增加EZH2基因表达,导致抑癌基因IGFBP-7启动子区域组蛋白甲基化,使启动子活性降低,IGFBP-7表达下降,是导致前列腺癌细胞的异常增殖分子机制之一.
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利用染色质免疫共沉淀测序研究Twist1结合的靶DNA序列
目的:利用染色质免疫共沉淀测序研究Twist1结合的靶DNA序列,比较过表达Bcl-2和正常状态下Twist1结合靶DNA序列的变化.方法:筛选常态表达Twist1的肝癌细胞系,分别转染Bcl-2表达质粒和对照空载体,收集转染后细胞以甲醛交联DNA,收集样品进行染色质免疫共沉淀,获得与Twist1蛋白结合的DNA片段进行测序分析.结果:通过对5种肝癌细胞系进行筛选,观察到HepG2可表达Twist1,其与DNA结合序列在空载体对照组和Bcl-2过表达组具有很大的差别,结合DNA数量分别为68条和212条,其中共享序列154条.结论:Twist1在不同环境下与DNA结合位点多达212个,涉及粘附分子、细胞骨架、信号转导、代谢和转录调节等多种生物学功能.
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系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞组蛋白H3赖氨酸4三甲基化水平的研究
目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)组蛋白H3赖氨酸4(H3K4)三甲基化(Me3)水平.方法 梯度密度离心法分离10例SLE活动期患者、7例SLE稳定期患者和8名健康者的PBMCs,采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(CHIP-chip)在全基因组范围内对SLE患者及健康者的PBMCs组蛋白H3K4me3进行高通量的筛选.染色质免疫共沉淀一实时定量聚合酶链反应(ChlP-qPCR)验证芯片结果.定量反转录一聚合酶链反应(qRT-PCR)检测H3K4me3显著差异基因的mRNA表达水平.结果 10例SLE活动期患者与健康对照相比较,鉴定出413个基因存在H3K4me3显著差异,其中137个基因显示H3K4me3程度增高,276个基因H3K4me3程度降低;7例SLE稳定期患者与健康对照相比较,发现393个基因存在H3K4me3表达差异,其中有112个基因H3K4me3程度增高,281个基因H3K4me3程度降低.ChIP-qPCR验证结果与CpG岛芯片的结果相一致.结论 SLE患者与健康者之间的PBMCs存在组蛋白H3K4me3显著改变.ChIP-chip技术有利于进一步揭示SLE分子机制,发现新的治疗靶点.
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组蛋白甲基化调控淋巴瘤PRDM1基因表达的研究
目的:研究细胞分化相关基因PRDM1在淋巴瘤细胞中的表达差异是否受组蛋白甲基化的影响.方法:应用染色质免疫沉淀(CHIP)技术对B淋巴瘤细胞株Namalwa和SU-DHL-4,以及T淋巴瘤细胞株H9和人胚肾细胞系293T的组蛋白甲基化情况进行检测.结果:在表达PRDM1差异的细胞内存在H3K4m3和H3K9m3水平的差异,高水平的H3K4m3与PRDM1的高表达相关,高水平的H3K9m3与PRDM1的表达下调相关.结论:PRDM1基因表达与组蛋白甲基化相关.后者是PRDM1基因转录调控的可能机制之一.
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ChREBP及其靶基因在高糖大鼠非酒精性脂肪肝中的表达
目的 探讨碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)及其靶基因乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶(FAS)在高糖大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型中的动态表达及作用.方法 SD大鼠32只,随机分为对照组和高糖组.高糖组于4,8,12周处死,对照组于12周处死.HE染色观察肝肝脂肪变性,RT-PCR和Western blot 方法测定不同时间点大鼠肝脏组织中ChREBP,ACC,FAS的mRNA表达和蛋白水平,染色质免疫共沉淀法分析不同时间点ChREBP与ACC、FAS基因启动子碳水化合物应答元件(ChRE)结合情况.结果 成功构建高糖饮食大鼠NAFLD摸型,随着造模时间的延长,肝脂肪程度不断加重,第4,8和12周末高糖组大鼠肝组织ChREBP、ACC、FASmRNA、蛋白及ChRE DNA的表达水平,与对照组差异显著(P <0.01),且随造模时间延长,其表达量显著增加.结论 高碳水化合物饮食可增强ChREBP的表达,而ChREBP通过上调ACC、FAS的表达参与了NAFLD的形成过程.
关键词： 非酒精性脂肪肝 ChREBP及其靶基因 染色质免疫共沉淀 -
外阴鳞状细胞癌组织中VEGF和Bcl-2基因组蛋白H3K4三甲基化水平的表达
目的:检测外阴鳞状细胞癌患者癌组织血管内皮生长因子(VEGF)和Bcl -2基因组蛋白H3K4三甲基化(me3)甲基状态及其mRNA的表达.方法: 采用染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶链反应( ChIP - qPCR)技术对15例外阴鳞状细胞癌患者癌组织和毗邻正常组织VEGF和Bcl -2基因组蛋白H3K4me3甲基化状态进行定量分析；随后采用定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测基因的mRNA表达.结果: 外阴鳞状细胞癌组织中VEGF和Bcl -2基因呈现组蛋白H3K4me3水平增高(P＜0.05)；VEGF和Bcl -2基因的mRNA表达增加.结论: 外阴鳞状细胞癌组织VEGF和Bcl -2基因可能参与外阴鳞状细胞癌的发生,成为外阴鳞状细胞癌新的治疗靶点.
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三甲基化组蛋白H3赖氨酸4对调节性T淋巴细胞foxp3基因表达的影响
目的 探讨天然调节性T淋巴细胞(nTreg)的三甲基化组蛋白H3赖氨酸4(H3 K4me3)对foxp3基因的影响,寻找维持调节性T淋巴细胞(Treg)表型长期稳定的方法.方法 使用免疫磁珠细胞(MACS)分选法从健康人外周血中分离出CD4+ CD25+Treg.对CD4+ CD25+ Treg分别进行0d、3d、7d培养,其中0d为阴性对照组,3d为阳性组1,7d为阳性组2,采用流式细胞仪(FCM)对0d、3d、7 d nTreg膜表面标志CD25的变化进行检测,并分别对培养0d、3d、7d的nTreg细胞通过染色质免疫共沉淀(ChIP-PCR)法检测foxp3基因启动子区H3 K4 me3及DNA水平变化.结果 1.使用细胞计数Kit-8(CCK-8)法确定植物血凝素(PHA)质量浓度在10 mg·L-1时为佳的药物质量浓度,对Treg细胞的增殖作用为显著.nTreg细胞培养0d、3d、7d的表型变化呈递减趋势.随着培养时间(0d、3d、7 d)的延长,与foxp3基因启动子区结合的H3 K4 me3表达逐渐减少.2.采用ChIP-PCR法对培养0d、3d、7d的nTreg细胞检测与H3 K4 me3结合的foxp3基因启动子区DNA水平变化.DNA凝胶电泳图显示,0d、3d在204 bp处可见条带(灰度值分别为2.31、0.91),7d有模糊条带或无条带.三者比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PHA不能维持Treg细胞的表型稳定,其机制与H3 K4 me3减少有关.
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染色质免疫共沉淀技术在前列腺癌细胞株中的优化
目的 优化染色质免疫共沉淀技术(ChIP)的关键条件,以期提高实验效率.方法 拟以前列腺癌细胞株PC-3、DU145为实验材料,主要对裂解液体积、超声波的功率、脉冲及工作时间等方面进行调整,超声波破碎仪设置不同的条件(25％或30％功率,35 s或50 s间隔,3s或5 s工作时间),然后解交联富集这些DNA片段,测定其浓度及纯度值,分别行聚合酶链反应(PCR)并用2％琼脂糖凝胶电泳检测结果.结果 前列腺癌细胞株合适的ChIP实验条件为:(1)超声波大功率为30％,设定每38 s行3s或55 s行5s超声工作时间,总的时间45 ～75 s;(2)纯化后的DNA浓度＞10 ng/μl、纯度值(A260/ A280)＞1.45,可以得到比较好的实验结果.结论 在前列腺癌细胞株PC-3、DU145中,选定合适的超声波频率后,总的超声工作时间为60s时,便可得到合适的DNA片段;洗脱液体积固定后,分2次离心要比1次离心所得到的DNA纯度值高,所得到的实验结果也越明显.
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Islet-1诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化过程中对心肌特异蛋白基因上组蛋白乙酰化的促进作用
目的 研究Islet-1诱导C3 H10 T1/2细胞定向分化为心肌样细胞过程中表达增加的心肌特异蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c上组蛋白乙酰化水平的变化情况.方法 lslet-1基因慢病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞C3H10,Western blot检测转染后乙酰化的组蛋白H3表达情况,逆转录及实时荧光定量PCR时序性检测出心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c的mRNA表达达高峰的时间点,采用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,CHIP),用CHIP级乙酰化H3抗体免疫沉淀与其所结合的DNA,采用实时荧光定量PCR扩增抗体所富集的心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c启动子区域的DNA量,比较感染组和未感染组与抗体所结合的上述3种心肌特异蛋白基因的表达情况.结果 感染高表达Islet-1的C3H10T1/2细胞组蛋白H3的乙酰化水平较未感染组升高3.04倍(P＜0.05),在心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2C的mRNA表达达高峰的2周时间点,乙酰化的H3抗体所结合的心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c与未转染Islet-1的细胞组相比较,表达增加(P＜0.05).结论 高表达Islet-1之后C3H10T1/2细胞定向分化为心肌样细胞过程中表达增加的心肌特异蛋白基因上组蛋白乙酰化水平增高.
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ChREBP及其靶基因在高脂大鼠非酒精性脂肪肝中的表达
目的 探讨碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)及其靶基因A羟化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)在高脂大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型中的动态表达及作用.方法 选取SD大鼠24只,随机分为高脂组和对照组.两组均于喂养第12周末处死.HE染色观察肝脏脂肪变性,逆转录酶链免疫反应(RT-PCR)和Western blot方法测定两组大鼠肝脏组织中ChREBP、ACC、FAS的 mRNA表达和蛋白水平,染色质免疫共沉淀分析ChREBP与ACC、FAS基因启动子碳水化合物应答元件(ChRE)结合情况.结果 成功构建高脂饮食大鼠NAFLD模型,血生化指标(ALT、AST、TC、TG)明显升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);高脂组大鼠肝组织ChREBP mRNA、蛋白及ChRE DNA的表达水平降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);而ACC、FAS mRNA、蛋白的表达水平增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 高脂饮食可抑制ChREBP的表达,在高脂饮食导致的NAFLD形成过程对ACC、FAS的表达起负性调控作用;ACC、FAS的表达通过其他调控途径升高而参与NAFLD的形成过程.
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转录因子S tat5a对乳腺癌细胞增殖的影响及其表观遗传学机制探讨
目的：探讨转录因子Stat5a对人类乳腺癌细胞（MCF‐7）增殖的影响及表观遗传学机制。方法利用腺病毒介导的基因转移技术，使MCF‐7大量表达转录因子Stat5a ，应用活细胞计数（M TS）法检测细胞增殖情况，并以染色质免疫共沉淀（ChIP）方法，检测p53基因启动子区域组蛋白甲基化程度。后以实时定量 PCR进一步确认 p53基因表达水平。结果携带Stat5a cDNA的腺病毒感染后，MCF‐7的数量呈剂量依赖式地增加。当病毒感染增殖活性（MOI）分别为10、20及30时，MCF‐7的细胞密度较对照组细胞分别增加7．6031％、18．1237％及24．8987％。染色质免疫共沉淀分析表明，Stat5a明显导致p53基因启动子区域组蛋白甲基化（H3K27Me3）增加，p53基因表达水平下降。结论 Stat5a导致MCF‐7抑癌基因p53启动子组蛋白甲基化，使启动子活性降低，导致细胞的异常增殖。
关键词： 转录因子Stat5a 乳腺肿瘤细胞 表观遗传学 组蛋白甲基化 染色质免疫共沉淀 -
雌激素通过雌激素受体α上调载脂蛋白M的表达
目的 探讨雌激素调节载脂蛋白M的机制.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测不同浓度牛血清清蛋白结合雌激素(E2-BSA)处理HepG2细胞24 h后载脂蛋白M(ApoM)的表达;RT-PCR检测不同雌激素和雌激素受体α(ER-α)拮抗剂MPP共同处理HepG2细胞24 h后ApoM mRNA的表达;PCR扩增ER-α全基因和ApoM转录起始位点上游2000 bp与下游+2000 bp之间不同长度片段,连入荧光素酶报告基因质粒pGL3-basic,各重组质粒转染后对表达荧光素活性进行检测;凝胶迁移实验和染色质免疫共沉淀进一步验证ER-α和ApoM启动子区的相互作用.结果 E2-BSA呈剂量依赖性上调HepG2细胞ApoM的表达,这一效应可以被MPP所抑制;通过荧光素酶报告基因实验鉴定出ApoM基因启动子区存在明显促进基因转录的调控区域[-1580～-1575 bp(-GGTCA-)].对该区域序列定点突变后重组荧光素酶报告基因表达的荧光素酶活性下降,而共转染未突变的荧光素酶报告基因质粒则荧光素酶活性上升;凝胶迁移阻滞和染色质免疫共沉淀结果显示,雌激素受体α与该区域特定序列存在相互作用.结论 雌激素通过ER-α上调载脂蛋白M的表达.
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外阴鳞状细胞癌患者癌组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化状态水平研究
目的:研究外阴鳞状细胞癌患者癌组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化状态及mRNA表达水平.方法:采用染色质免疫共沉淀-实时定量聚合酶联反应(ChIP-qPCR)技术对8例外阴鳞状细胞癌患者癌组织和毗邻正常组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化状态进行定量分析;随后采用定量反转录聚合酶联反应(qRT-PCR)检测其基因的mRNA表达水平.结果:外阴鳞状细胞癌患者癌组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化水平增高;其三甲基化水平较毗邻正常组织有显著性差异(P<0.05);进一步表达分析显示p16和DAPK基因其mRNA表达降低.结论:外阴鳞状细胞癌患者癌组织p16和DAPK基因组蛋白H3K27三甲基化水平增高,组蛋白H3K27三甲基化异常参与外阴鳞状细胞癌的发生,极可能成为外阴鳞状细胞癌新的表观治疗靶点.
关键词： 外阴鳞状细胞癌 染色质免疫共沉淀 组蛋白H3K27三甲基化 p16 DAPK -
在神经干细胞中Sox2直接调节Olig2的转录活性
目的 研究Sox2对Olig2直接转录调节.方法 荧光素酶报告基因法(Luciferase assay)检测Sox2对 Olig2基因启动子激活作用;染色质免疫共沉淀法(CHIP assay)验证体外培养的神经干细胞中Sox2与Olig2基因启动子DNA的结合位点.结果 在神经干细胞中,Sox2转录因子与Olig2基因启动子DNA存在结合(-1232--977, ATG为+1),并能在体外激活Olig2的转录.结论 Sox2可直接调节Olig2基因的转录活性,参与干细胞向少突胶质分化潜能的维持.
