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Islet-1诱导成纤维细胞系C3H10T1/2向心肌细胞分化过程中组蛋白乙酰化与DNA甲基化在GATA4启动子区的关系
目的 研究在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中的心肌早期发育相关基因GATA4启动子区域组蛋白乙酰化与DNA甲基化的相互作用关系.方法 构建过表达Islet-1细胞模型,在GATA4基因表达过程中,用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)检测其启动子区组蛋白H3K9乙酰化的时序性变化;甲基化特异性PCR技术(MSP)检测其启动子区CpG岛甲基化的时序性变化,明确两者之间相互作用的关系.结果 随着Islet-1诱导C3H10T1/2向心肌细胞特异分化的时间延长,GATA4基因的表达增高(P＜0.05),其启动子区第2个CpG位点组蛋白H3K9乙酰化的水平升高(P＜0.05),DNA甲基化水平降低(P＜0.05).结论 Islet-1诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞特异分化过程中,组蛋白乙酰化和DNA甲基化在调控心肌特异早期转录因子GATA4表达过程中存在相互拮抗作用,从而促其表达呈时序性变化.
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Islet-1在乙酰化调控网络中特异性辅助C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化
目的 筛选并分析转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞转化为心肌样细胞过程中与Islet-1相互作用的组蛋白乙酰化酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs),明确Islet-1在C3H10T1/2细胞分化为心肌样细胞乙酰化调控网络中的关键枢纽作用.方法 培养转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞,观察细胞形态.免疫荧光和免疫印迹检测Islet-1的表达部位和高表达时间点.免疫共沉淀与Islet-1结合的蛋白.免疫印迹验证Islet-1相互作用的HATs和HDACs.结果 诱导组细胞形态出现心肌样细胞改变.各组Islet-1主要在胞质表达.诱导组Islet-1表达量在诱导后3周高(0.782 ±0.015).诱导组Islet-1表达量显著高于空白对照组和C3H10组(分别为0.819±0.026,0.127±0.006和0.126 ±0.001)(P＜0.05),免疫共沉淀技术可行.与Islet-1相互作用的HATs和HDACs有GCN5、P300/CBP和HDAC4.结论 Islet-1与GCN5、P300/CBP和HDAC4相互作用特异性辅助C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化.
关键词： C3H10t1/2细胞 Islet-1 心肌样细胞 组蛋白乙酰化 -
小鼠Islet-1基因慢病毒表达载体的构建及其诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞特异性分化
目的 研究Islet-1对干细胞分化的影响.方法 用PCR钓取目的 基因,将目的 基因与pLenO-WPI载体连接,选取阳性质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞生产出慢病毒载体.感染C3H10T1/2细胞,实时荧光定量PCR及Western blot检测Islet-1和心肌、肝脏、骨骼及神经各系统相关标志物的表达,免疫荧光检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达部位.结果 PCR及测序显示目的 片段正确插入,实验组有Islet-1表达;心肌早期发育相关基因GATA-4、MEF2C、NKx2.5在检测到荧光蛋白1周后升高,2周到达高峰,3周后可检测到心肌特异性蛋白cTnT(0.582±0.0576),其时序性表达呈随时间增强趋势;cTnT表达于胞质;肝脏系统特异性标志AFP及ALB、骨骼系统特异性标志BGP及BALP、神经系统特异性标志Nestin及GFAP均未表达.结论 Islet-1具有特异性促进干细胞向心肌样细胞分化的作用.
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孕期锌缺乏对胎鼠心脏发育及其调节因子表达的影响
目的 观察大鼠孕期锌缺乏对胎鼠心脏发育及其关键调节因子表达的影响.方法 SPF级SD大鼠随机分为缺锌、常锌和配饲3组(n=9),分别摄入含锌量为2.78、29.83、29.83 μg/g的饲料,14d后交配受孕,同法饲养至孕d19剖腹取胎,行胎心组织形态学观察;检测胎鼠血浆超氧化物岐化酶(SOD)、白介素1β(IL-1β)的含量和胎心组织GATA结合因子4(GATA4)、胰岛素基因增强结合因子(Islet-1)和Nk2型同源盒转录因子5(Nkx2.5)的蛋白和mRNA表达;并检测母鼠血锌水平.结果 (1)与常锌组比较,缺锌组母鼠的血锌水平显著降低(P＜0.05),而配饲组无显著差异(P＞0.05);(2)缺锌组胎心部分组织血管充血,心肌细胞核形态不规则、大小各异,染色质分布不均,偶见胞浆局灶性稀疏和灶性减少.常锌组及配饲组胎心组织形态未见明显异常;(3)与常锌组比较,缺锌组胎心GATA4、Islet-1的蛋白含量均显著降低(P＜0.05);且GATA4、Nkx2.5、Islet-1的mRNA表达均显著降低(P＜0.05),而配饲组胎心GATA4、Nkx2.5、Islet-1蛋白及mRNA的含量无显著差异(P＞ 0.05);(4)与常锌组比较,缺锌组胎鼠血浆IL-1β水平显著升高、SOD水平显著降低,配饲组胎鼠血浆IL-1β或SOD水平无显著差异(P＞0.05).结论 大鼠孕期锌缺乏导致胎鼠心脏组织结构异常可能与缺锌引起的胎心组织GATA4、Nkx2.5和Islet-1表达下调以及机体氧化应激与炎症反应异常有关.
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Islet-1促C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化过程中的电生理特性
目的:研究Islet-1体外诱导C8H10T1/2细胞分化为心肌样细胞过程中,钠、钙离子通道电流的表达情况.方法:Islet-1慢病毒载体感染C3H10T1/2细胞,观察细胞形态变化.差速贴壁法分离培养新生小鼠心肌细胞,以免疫荧光法进行鉴定.RT-PCR检测相应钠、钙离子通道基因mRNA表达水平.全细胞膜片钳技术检测细胞钠、钙离子通道电流表达情况.结果:实验组细胞形态呈心肌样改变;实验组钠、钙离子通道基因SCN5A(INa离子通道基因)、CACNA1C(IL-Ca离子通道基因)和CACNA1H(IT-Ca离子通道基因)表达量均明显高于空白组和阴性对照组(均P＜0.05);膜片钳检测空白组和阴性对照组无内向离子通道电流表达,实验组检测到与心肌细胞相似的钠电流(INa)和T型钙电流(IT-Ca),峰值电流呈现不均一性,总体水平低于小鼠心肌细胞;IL-Ca的离子通道基因虽表达增高,但未测得电流表达.结论:实验组钠、钙离子通道基因表达增高,可产生与心肌细胞相似的钠、钙离子通道电流,说明Islet-1可诱导C3H10T1/2细胞分化为有电生理功能的心肌样细胞.
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Islet-1促MSCs心肌特化过程中Nkx2.5启动子区域DNA甲基化水平变化
目的:研究Islet-1诱导C3H10T1/2细胞定向分化为心肌样细胞过程中表达增加的心肌早期发育相关基因Nkx2.5启动子区域DNA甲基化水平的变化情况.方法:高表达Islet-1基因的慢病毒载体转染间充质干细胞C3H10T1/2,免疫荧光检测Islet-1表达情况,在Nkx2.5表达达高峰的时间点,通过甲基化特异性PCR技术检测其启动子区域DNA甲基化水平,比较C3H10组(空白对照组)、阴性对照组(转染慢病毒空载体)和实验组(转染高表达Islet-1基因的慢病毒载体)上述基因启动子区域的DNA甲基化水平.结果:实验组Nkx2.5基因启动子区域DNA甲基化水平低于其他两组(均P＜0.05).结论:高表达Islet-1促C3H10T1/2细胞特异性向心肌细胞方向分化过程中,心肌早期发育相关基因启动子区域DNA甲基化水平降低,促进其表达增加.
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Islet-1诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化过程中对心肌特异蛋白基因上组蛋白乙酰化的促进作用
目的 研究Islet-1诱导C3 H10 T1/2细胞定向分化为心肌样细胞过程中表达增加的心肌特异蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c上组蛋白乙酰化水平的变化情况.方法 lslet-1基因慢病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞C3H10,Western blot检测转染后乙酰化的组蛋白H3表达情况,逆转录及实时荧光定量PCR时序性检测出心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c的mRNA表达达高峰的时间点,采用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,CHIP),用CHIP级乙酰化H3抗体免疫沉淀与其所结合的DNA,采用实时荧光定量PCR扩增抗体所富集的心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c启动子区域的DNA量,比较感染组和未感染组与抗体所结合的上述3种心肌特异蛋白基因的表达情况.结果 感染高表达Islet-1的C3H10T1/2细胞组蛋白H3的乙酰化水平较未感染组升高3.04倍(P＜0.05),在心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2C的mRNA表达达高峰的2周时间点,乙酰化的H3抗体所结合的心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c与未转染Islet-1的细胞组相比较,表达增加(P＜0.05).结论 高表达Islet-1之后C3H10T1/2细胞定向分化为心肌样细胞过程中表达增加的心肌特异蛋白基因上组蛋白乙酰化水平增高.
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转录因子 lslet-1在氧诱导血管增生性视网膜病变中的表达
目的：研究高氧诱导的视网膜新生血管模型鼠中转录因子Islet-1的表达差异。
方法：采用高氧诱导的方法制作鼠视网膜新生血管模型,运用荧光造影视网膜铺片及视网膜切片苏木精-伊红染色观察视网膜新生血管的形态。于小鼠出生后第7,12,14,17,26 d取视网膜组织,采用Real-time PCR及Western blot技术测定视网膜组织中Islet-1的表达水平。
结果：模型组视网膜铺片及组织切片可见大量视网膜新生血管形成。小鼠出生后第7d,模型组与正常组视网膜组织中Islet-1表达水平无明显差异；小鼠出生后第12~14d,模型组视网膜组织中Islet-1表达水平明显上调；出生后17d,模型组视网膜组织中Islet-1表达水平仍高于正常组；出生后26d,随着视网膜新生血管消退,视网膜组织中Islet-1表达水平降至正常水平。
结论：模型鼠视网膜新生血管发生过程中,持续缺氧的视网膜组织通过增加转录因子Islet-1的表达,从而诱导视网膜新生血管的发生。
