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NKx2.5、GATA-4基因表达对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响
观察NKx2.5、GATA-4 基因在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化为心肌细胞过程中表达时序性及表达强度的变化,初步阐明两基因对MSCs分化为心肌细胞的影响.以MSCs植入后的Wistar大鼠为研究对象,在移植后不同的时间点取心肌标本,采用逆转录聚合酶链反应技术,提取心肌组织的总RNA,逆转录,加入特异性引物扩增目的基因,观察基因表达的时序性,并应用凝胶图像分析系统检测这两个基因表达强度的动态变化.显示在MSCs移植后1 d两个基因即出现弱的表达,1 d～1周表达较低,2周～3周表达强度高,达到高峰期,以后表达强度则逐渐降低.NKx2.5、GATA-4在MSCs转化为心肌细胞的早期发挥重要的作用.
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心脏发育相关基因NKX2.5和GATA4突变与先天性心脏病的相关性
目的 观察心脏发育相关基因NKX2.5和GATA4突变与先天性心脏病之间的相关性.方法 纳入214例先天性心脏病患儿,并入选186例健康儿童作为对照组,用脱氧核糖核酸聚合酶链反应(PCR-DNA)测序技术对先天性心脏病患儿外周血中NKX2.5和GATA4基因的外显子及其侧翼序列进行分析.测序完成后,对NKX2.5的2个外显子和GATA4的6个外显子进行聚合酶链反应(PCR)扩增测序,将结果与GeneBank中公布的DNA标准序列进行对比,观察是否发生突变.结果 NKX2.5测序发现,72例患儿位于21位氨基酸的第3位碱基发生同义突变(c.63A＞G,E21E),8例患儿的94位氨基酸的第3位碱基发生同义突变(c.282A/C,P94P),以上突变基因均位于外显子1;48例患儿的246位氨基酸的第3位碱基均发生突变(T→A,c.738A/T,N246K),位于外显子2的第一部分;8例患儿的2个杂合发生同义突变[(c.769C/G,P257P)和(c.780C/A,G260G)],位于外显子2的第二部分.GATA4测序发现,8例患儿的第744位碱基发生杂合同义突变(c.744C ＞T,N248N),位于外显子3.结论 在先天性心脏病患儿中,NKX2.5外显子发现了5个突变位点,GATA4发现了1个突变位点,这些单核苷酸多态性与先心病可能存在着相关性.
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转录因子Nkx2.5与心血管疾病
心血管疾病严重危害人类健康.其病因复杂.遗传因素起很大作用.Nkx2.5是重要的转录因子,与心脏发育、功能维系密切相关;Nkx2.5的突变可以导致心肌肥厚、心律失常、先心病等疾病.本文就转录因子Nkx2.5与心血管疾病的新进展予以综述.
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转录因子Nkx2.5和GATA-4在心脏发育中的作用
转录因子是能直接或间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质.Nkx2.5和GATA-4是两个与心脏发育密切相关的转录因子.Nkx2.5参与了心脏形成,包括右侧环化、心腔分化、心脏间隔功能成熟以及工作心肌和传导系统的维持等过程.GATA-4在心肌分化增殖和存活及心脏肥大过程中起重要作用.Nkx2.5和GATA-4在蛋白质水平相互作用,调节心房利钠肽、骨形态发生蛋白和心脏限制性锚蛋白复制蛋白等启动子的表达.
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孕期锌缺乏对胎鼠心脏发育及其调节因子表达的影响
目的 观察大鼠孕期锌缺乏对胎鼠心脏发育及其关键调节因子表达的影响.方法 SPF级SD大鼠随机分为缺锌、常锌和配饲3组(n=9),分别摄入含锌量为2.78、29.83、29.83 μg/g的饲料,14d后交配受孕,同法饲养至孕d19剖腹取胎,行胎心组织形态学观察;检测胎鼠血浆超氧化物岐化酶(SOD)、白介素1β(IL-1β)的含量和胎心组织GATA结合因子4(GATA4)、胰岛素基因增强结合因子(Islet-1)和Nk2型同源盒转录因子5(Nkx2.5)的蛋白和mRNA表达;并检测母鼠血锌水平.结果 (1)与常锌组比较,缺锌组母鼠的血锌水平显著降低(P＜0.05),而配饲组无显著差异(P＞0.05);(2)缺锌组胎心部分组织血管充血,心肌细胞核形态不规则、大小各异,染色质分布不均,偶见胞浆局灶性稀疏和灶性减少.常锌组及配饲组胎心组织形态未见明显异常;(3)与常锌组比较,缺锌组胎心GATA4、Islet-1的蛋白含量均显著降低(P＜0.05);且GATA4、Nkx2.5、Islet-1的mRNA表达均显著降低(P＜0.05),而配饲组胎心GATA4、Nkx2.5、Islet-1蛋白及mRNA的含量无显著差异(P＞ 0.05);(4)与常锌组比较,缺锌组胎鼠血浆IL-1β水平显著升高、SOD水平显著降低,配饲组胎鼠血浆IL-1β或SOD水平无显著差异(P＞0.05).结论 大鼠孕期锌缺乏导致胎鼠心脏组织结构异常可能与缺锌引起的胎心组织GATA4、Nkx2.5和Islet-1表达下调以及机体氧化应激与炎症反应异常有关.
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柯萨奇B3病毒对心脏发育因子GATA-4、NKx2.5表达的影响及叶酸对其保护作用
目的：探讨叶酸对孕期感染柯萨奇B3病毒(CVB3)的新生鼠心脏发育因子GATA-4、NKx2.5的基因与蛋白表达的影响。方法 SD雌鼠分为对照组、叶酸组、CVB3组、CVB3+叶酸组。叶酸组及CVB3+叶酸组孕前给予叶酸灌胃2周；CVB3组及CVB3+叶酸组孕第7天腹腔注射CVB3，连续5 d，自然分娩后取新生鼠心脏组织，病理切片HE染色观察新生鼠心脏组织形态学变化；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot测定新生鼠心脏组织中转录因子GATA-4、NKx2.5基因及蛋白表达水平。结果 CVB3组新生鼠心肌损伤明显，心肌细胞排列紊乱，心肌纤维断裂，CVB3+叶酸组状态改善。CVB3组新生鼠心脏组织GATA-4、NKx2.5基因及蛋白表达低于对照组（P＜0.05）， CVB3+叶酸组GATA-4、NKx2.5基因及蛋白表达高于CVB3组（P＜0.05）。结论孕鼠早期感染CVB3抑制新生鼠心脏发育因子正常表达，补充叶酸对新生鼠心脏发育具有明显保护作用。
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血府逐瘀汤对心肌梗死大鼠心肌发育相关基因GATA4、NKx2.5调控作用的研究
目的 观察血府逐瘀汤对心肌梗死大鼠心肌发育相关基因GATA4、NKx2.5的调控作用.方法 采用结扎大鼠左冠状动脉前降支方法建立心肌梗死模型,将成模大鼠随机分为模型组和血府逐瘀汤组,每组30只.另选择同月龄健康SD大鼠10只作为假手术组.模型组给予生理盐水2 mL/次灌胃,血府逐瘀汤组给予浓煎血府逐瘀汤2 mL/次灌胃,均1次/d.采用RT-PCR方法检测3组大鼠干预1d、10 d、15 d心肌组织中GATA4、Nkx2.5mRNA表达水平.结果 干预1d后,模型组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均明显低于假手术组(P均＜0.05);干预10 d后,模型组和血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量与假手术组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05),但模型组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量和血府逐瘀汤组GATA4mRNA表达量均明显高于干预1d后(P均＜0.05);干预15d后,血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均明显高于假手术组(P均＜0.05).干预1d、10d、15 d后,血府逐瘀汤组GATA4、Nkx2.5mRNA表达量均较模型组有所升高,但差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 大鼠心肌梗死后,其心肌组织中GATA4、Nkx2.5mRNA表达量呈现先下降、再升高的趋势.血府逐瘀汤可发挥一定的促进心肌梗死大鼠心肌发育相关基因GATA4、NKx2.5表达增加的作用,该作用可能是祛瘀中药促进梗死后心肌组织迅速修复、愈合的机制之一.
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转录因子Nkx2.5和GATA4的相互作用
背景:心脏发育过程是复杂多种因子相互作用的结果,对转录因子Nkx2.5 和GATA4 在心脏发育过程中相互作用的研究将有助进一步了解心脏发育过程.目的:分析心脏转录因子Nkx2.5 和GATA4 在细胞内的相互作用.方法:在构建Nkx2.5 和GATA4 真核表达质粒以及脑钠肽启动子荧光表达质粒的基础上,将真核表达质粒经共转染或单转染COS7 细胞,利用免疫共沉淀技术验证Nkx2.5和GATA4 在细胞内是否有相互作用,并通过荧光素酶分析技术分析Nkx2.5和GATA4 对脑钠肽启动子序列可能存在的协同激活作用.结果与结论:通过免疫共沉淀实验发现GATA4 能将Nkx2.5 沉淀下来,相应的Nkx2.5 也能将GATA4 沉淀下来,说明在COS7 细胞中,GATA4 能和Nkx2.5 相互作用.脑钠肽启动子荧光表达质粒并与Nkx2.5 和GATA4 共转染COS7 细胞,比起单转染Nkx2.5 或GATA4 质粒,两者共转染更能激活脑钠肽启动子的表达.Nkx2.5 和GATA4 不仅各自在心脏发育过程中发挥重要作用,两者之间的相互协调作用对于心脏的正常发育过程同样非常重要.
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骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞相关基因表达与形态结构发生的关联
背景:前期已完成体外定向诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验.目的:观察骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞过程中,细胞形态变化、结构发生规律与GATA-4、Nkx-2.5和a-MHC表达的关联性.方法:采用心肌组织裂解液诱导SD乳鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞,以免疫组织化学染色检测心肌肌钙蛋白T和间隙连接蛋白43表达情况,鉴定心肌细胞;在定向诱导分化过程中,RT-PCR检测GATA-4、Nkx2.5与α-MHC的表达情况.结果与结论:①细胞形态:在定向诱导过程中,细胞形态由长梭形经历短杆状、形成短小突起、网状结构、呈竹节状及肌管样结构;②心肌细胞鉴定:竹节样结构开始出现心肌肌钙蛋白T和间隙连接蛋白43阳性细胞,肌管样结构心肌肌钙蛋白T和间隙连接蛋白43阳性细胞增多;③RT-PCR检测:在定向分化过程中,细胞GATA-4、Nkx2.5与α-MHC基因表达持续增加;细胞交错连接成网状时,GATA-4表达明显增加,之后持续高表达;相邻细胞融合形成肌管样结构时,α-MHC表达达到峰值;Nkx2.5表达随诱导时间的延长逐渐增加;④结果表明:骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞过程中,心肌细胞特异基因的表达与心肌样细胞的形态特征、特殊结构发生密切相关,具有典型的时序性和空间性.
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汉族先天性心脏病患儿中NKX2.5基因的分析
目的 初步研究转录因子Nkx2.5的基因突变与汉族先天性心脏病发生之间的关系,为先心病患儿的预防和治疗提供依据.方法 收集55例散发型先天性心脏病患儿及55名正常人的外周静脉血,采用聚合酶链反应结合DNA测序技术,对Nkx2.5基因的外显子进行序列检测,分析Nkx2.5基因突变是否与中国先天性心脏病的发生有关.结果 55例患者中未检测出核苷酸突变.55名正常人也未检测出基因突变.结论 Nkx2.5基因突变与中国先天性心脏病的发生之间相关性可能是间接的.
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心脏转录因子Nkx2.5真核表达质粒的构建
目的 构建人类心脏特殊转录因子Nkx2.5的真核表达质粒,为进一步探讨Nkx2.5在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础.方法 以质粒pCMV6-XL5-Nkx2.5为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2.5编码区序列,将真核表达载体pCMV-HA和Nkx2.5的PCR产物分别在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-HA-Nkx2.5,转化至大肠杆菌,提取质粒后经PCR、双酶切及测序鉴定.结果 成功设计引物扩增出Nkx2.5基因编码区约1 000 bp的目的 片段,PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2.5基因序列.结论 成功构建了含有Nkx2.5的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础.
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NKx2.5基因在孕鼠肥胖致胚胎心脏畸形中的表达及意义
目的 探讨NKx2.5基因mRNA及其蛋白在肥胖孕鼠胚胎畸形心脏中的表达水平及相关意义.方法 3周龄SPF级SD雌鼠100只,随机分为两组:正常组(40只)给予基础饲料;高脂组(60只)给予高脂饲料.8周后,以高脂组体重超过正常组平均体重的20%且血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量显著高于正常组的作为肥胖雌鼠,随机抽取20只肥胖雌鼠和正常雌鼠分别与雄鼠交配获取肥胖组孕鼠和对照组孕鼠.取孕13、15、17、19 d胚胎鼠心脏,通过切片进行组织学观察以确定心脏畸形情况,采用RT-PCR法检测NKx2.5基因的mRNA表达,采用Western blot方法检测NKx2.5蛋白表达.结果 肥胖组孕鼠胚胎心脏畸形率显著高于对照组孕鼠(P<0.01);肥胖组孕鼠各孕龄胚胎畸形心脏NKx2.5基因mRNA及其蛋白表达比对照组孕鼠正常胚胎显著降低(P<0.05).结论 孕鼠肥胖导致胚胎心脏畸形率升高;孕鼠肥胖抑制胚胎心脏NKx2.5基因和蛋白表达,可能导致心脏发生发育缺陷从而造成先天性心脏畸形.
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叶酸缺乏对孕鼠子代心脏超微结构及心脏发育相关基因表达的影响
目的 探讨叶酸缺乏孕鼠的子代心脏发育过程中GATA-4、NKx2.5基因表达和超微结构的改变.方法 成熟雌性SD大鼠36只随机分为实验组和对照组,分别喂以缺乏叶酸和含叶酸饲料2周后与成熟SD雄性大鼠交配,分别取孕13.5 d(E13.5 d)、孕17.5 d(E17.5 d)胚胎及新生鼠心脏.用实时扩增聚合酶链反应(RT-PCR)检测胚胎及新生鼠心脏GATA-4、NKx2.5基因3个时期的表达.电镜观察新生鼠心脏的超微结构.结果 1.经切片观察E13.5 d胚胎实验组发现明显发育延迟占35.14%,E17.5 d胚胎实验组发现明显心脏畸形占43.24%,新生鼠实验组发现明显心脏畸形占69.44%.2.GATA-4、NKx2.5基因在3个时期相对表达量实验组低于对照组( Pa＜0.05).3.实验组新生鼠心脏电镜下肌细胞胞浆内膜性结构退行性变、肌丝明暗带(z带)不清、线粒体内基质凝结、肌浆网扩张;对照组正常或破坏很轻.结论 孕鼠叶酸的缺乏影响子代心脏GATA-4、NKx2.5基因水平的表达,并导致心脏超微结构和大体结构的改变,从而造成心脏发育缺陷.
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伴甲状腺异位的先天性甲状腺功能减低症患儿NKX2.5基因突变研究
目的 研究伴异位的甲状腺发育不全(TD)患儿中NKX2.5基因的突变情况和遗传特征,完善NKX2.5基因突变库,并为基因诊断与产前诊断奠定应用基础.方法 通过山东省新生儿筛查系统选取山东省90例已排除先天性疾病(特别是先天性心脏病)的伴异位TD病例,提取外周静脉血基因组DNA,采用3对序列特异性引物对NKX2.5基因的全部2个外显子进行PCR扩增,测序后进行突变筛查.运用独立的2组二分类资料比较方法对扩增区域内所发现SNP位点的基因频率进行x2检验.结果 在伴异位的TD病例中未发现NKX2.5基因外显子区及外显子与内含子接头区存在突变,但在第1外显子区发现1个SNP位点(rs2277923,c.63T＞C)为同义突变(Glu→Glu),经统计,90例伴异位的TD病例中SNPrs2277923的等位基因频率为T=0.416 7,与MAF小等位基因频率比较,差异无统计学意义(x2=3.437 6,P＞0.05),提示该SNP位点与TD的发生无相关性.结论 该研究是迄今为止国内关于伴异位的TD病例的大规模的致病基因的筛查,未见突变存在,证实伴异位的TD病例中NKX2.5基因突变率极低,不是山东地区CH病例的致病基因.
关键词： 先天性甲状腺功能减低症 甲状腺发育不全 异位 NKx2.5 突变 -
Nkx2.5在妊娠期糖尿病胎鼠心脏发育中的表达及意义
目的：了解心肌转录因子 Nkx2.5在妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）胎鼠心肌组织的表达变化，探讨其在妊娠期糖尿病胚胎心脏发育异常中可能的作用机制。方法：80只成年雌性 SD大鼠，随机分为实验组（GDM 组）和对照组各40只，实验组通过腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）成功建立妊娠期糖尿病大鼠模型后，两组分别于孕12、15、19d 随机分组并行剖腹产，取胎鼠心肌组织。采用免疫组织化学及实时荧光定量 PCR 检测 Nkx2.5蛋白及 mRNA 在胎鼠心肌组织的表达。结果：对照组与实验组 Nkx2.5蛋白及 mRNA 在胎鼠心肌组织的表达随胎龄的增长而呈上升趋势，同一时间点实验组 Nkx2.5蛋白表达较对照组明显减少，差异有统计学意义（P﹤0.01）；孕12及19 d 实验组 Nkx2.5mRNA表达较对照组明显减少，差异有统计学意义（P﹤0.01），孕15 d 两组间无明显差异。结论：Nkx2.5蛋白及mRNA 在妊娠期糖尿病胎鼠心肌组织的表达下降，可能参与了妊娠期糖尿病致胚胎先天性心脏病的发病过程。
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Nkx2.5基因在肺血减少型先天性心脏病右心室流出道心肌突变及表达中的意义
目的 观察Nkx2.5基因(同源盒转录因子)在肺血减少型先天性心脏病患者中的突变及表达变化,探讨Nkx2.5基因在右心室流出道梗阻发生中的分子调控机制.方法 选取2012年5月至2014年5月蚌埠医学院第一附属医院与安徽省立儿童医院心脏外科收治的56例肺血减少型先天性心脏病患者为试验组,选取同期收治的63例室间隔缺损患者为对照组.试验组男30例、女26例;年龄6个月～14(5.82±4.23)岁.对照组男36例、女27例,年龄6个月～ 14 (6.93±4.56)岁.收集所有患者术前外周静脉血5ml,采用聚合酶链反应结合DNA测序技术对Nkx2.5基因的外显子进行序列检测,观察有无Nkx2.5基因突变;留取术中右心室流出道肥厚心肌组织0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,提取心肌组织RNA,应用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测心肌中Nkx2.5基因mRNA的表达情况,分析Nkx2.5基因与肺血减少型先天性心脏病的关系.结果 试验组与对照组外周静脉血中均未检测出基因突变,试验组心肌中Nkx2.5基因mRNA表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Nkx2.5基因突变可能与多因素有关,肺血减少型先天性心脏病的发生可能与心肌组织中Nkx2.5基因表达下降有关.
