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人骨肉瘤细胞系MG-63细胞球形成细胞干性特征
目的 从人骨肉瘤细胞系MG-63中分离细胞球,鉴定其干性特征并探讨其与侵袭、转移的相关性及可能机制.方法 无血清悬浮培养富集MG-63细胞球,PKH26染色确定细胞球中存在干细胞,Western blot检测细胞球干性相关蛋白表达.甲基纤维素半固体培养及Transwell小室检测细胞球自我更新及侵袭能力,并对上皮间质转化和侵袭、转移相关蛋白进行检测.结果 MG-63细胞无血清悬浮培养11 d后形成的细胞球中存在单个PKH26阳性细胞.与MG-63单层细胞相比,干细胞相关蛋白OCT-4、SOX2和Nanog表达显著提高(P<0.05).MG-63细胞球细胞成球数是单层细胞的1.84倍(P<0.01),侵袭能力较单层细胞提高1.45倍(P<0.01).细胞球中E-cadherin低表达,snail及MMP2高表达(P<0.05).结论 骨肉瘤细胞系MG-63细胞球形成细胞具有干性特征,通过上皮间质转化促进了细胞的侵袭与转移.
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MiR-590-3p在胰腺癌干细胞中的表达
目的 应用无血清培养基分离胰腺癌干细胞，检测其miR-590-3p的表达。方法 运用无血清培养基克隆培养ASPC-1、PANC1细胞，检测其单克隆形成、分化及细胞周期、半数抑制浓度(IC50)和表面标记物CD24+、CD44+表达。实时定量PCR法检测细胞miR-590-3p的表达。结果 经无血清培养基培养,(0.94±0.53)％的ASPC-1细胞和(0.57±0.12)％的PANC1细胞能存活，呈克隆球样悬浮生长，并可以在体外连续传代。加入血清后细胞球又重新贴壁生长。ASPC-1细胞球G0/G1期比例和CD24+、C44+、CD24+ CD44+的细胞比例及IC50分别为(75.3±5.4)％、0.96％～2.01％、27.52％～34.47％、0.35％ ～0.44％和(224.37±5.71) μg/ml，均显著高于亲本细胞的(43.7±3.8)％、0.38％～0.42％、17.65％ ～ 18.25％、0.05％～ 0.08％、(11.43±2.10) μg/ml(P值均＜0.05)。PANC1细胞球G0/G1期比例和CD24+、CD44+、CD24 +CD44+的细胞比例及IC50分别为(80.1±4.7)％、5.31％ ～9.84％、72.05％ ～93.06％、4.91％ ～5.21％、(296.58±4.27) μg/ml，均显著高于亲本细胞的(46.1±5.3)％、4.09％～4.97％、47.71％～55.66％、1.48％ ～2.63％、(26.17±3.81) μg/ml(P值均＜0.05)。ASPC-1、PANC1细胞球miR-590-3p表达分别是亲本细胞的4.67和4.52倍。结论 应用无血清培养基可以从ASPC-1、PANC1细胞系中分离出具有干细胞特性的胰腺癌细胞球，其miR-590-3p表达上调，该基因可能是胰腺癌干细胞特性维持的关键基因。
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人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中肿瘤干细胞的培养分化及增殖侵袭能力分析
背景：研究发现，食管癌组织中存在一类细胞亚群，具有一定的侵袭和转移性能，与治疗效果之间存在十分密切的联系。目的：从人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中分离富含肿瘤干细胞的细胞球，并对其增殖和侵袭能力进行分析。方法：运用无血清培养基培养KYSE-150、TE-1细胞，观察细胞球的生成情况，采用MTT法以及Transwel小室实验检测细胞的增殖情况和侵袭能力，流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。结果与结论：①KYSE-150、TE-1细胞在无血清培养条件下可以获得稳定传代的细胞球。②细胞球的增殖能力和侵袭能力均显著高于亲本细胞(P <0.05)。③TE-1细胞球和KYSE-150细胞球的CD44+、CD271+、CD44+CD271+细胞比例均显著高于TE-1亲本细胞和KYSE-150亲本细胞(P <0.05)。④实验结果提示，从人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中分离出具有肿瘤干细胞特性的细胞球，具有很强的增殖和侵袭转移能力，且CD44和CD271可以作为重要的食管癌干细胞表面标志物。
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表皮生长因子及其受体对结肠癌干细胞的增殖调控
背景:肿瘤干细胞是肿瘤组织中—小部分具有自我更新、多向分化以及高度增殖能力的肿瘤细胞.研究发现表皮生长因子(EGF)可促进肿瘤干细胞增殖.目的:探讨EGF及其受体(EGFR)在结肠癌干细胞增殖调控中的作用.方法:结肠癌细胞株HT29、HCT116培养于无血清培养基中,以EGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)分别干预细胞.MTT法检测EGFR抑制剂吉非替尼对结肠癌细胞球细胞的增殖抑制作用,体外实验检测EGFR抑制剂吉非替尼、PD153035对细胞球形成的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡.体内实验检测结肠癌细胞球和细胞株的成瘤能力,real-time PCR检测两者干细胞标记LGR5、Musashi-1和分化标记CK20表达.结果:EGF组HCT116细胞形成的细胞球数量显著高于空白对照、bFGF、IGF组(P＜0.05).吉非替尼能抑制HCT116细胞球细胞增殖和细胞球形成,并诱导细胞凋亡,作用呈浓度依赖性.HCT116细胞球成瘤时间较细胞株显著缩短,移植瘤体积显著增大(P＜0.05).LGR5、Musashi-1在细胞球中的表达显著高于细胞株,而CK20在细胞株中的表达显著高于细胞球(P＜0.05).结论:EGF对结肠癌细胞株HCT116、HT29形成细胞球具有促进作用.EGFR抑制剂可抑制结肠癌细胞球增殖并诱导细胞凋亡,相关作用可能与调控LGR5、Musashi-1和CK20表达有关.
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食管肿瘤干细胞抗辐射特性的实验研究
目的:探讨食管肿瘤干细胞的抗辐射特性.方法:采用无血清培养基培养人食管癌细胞ECA109,分离食管肿瘤干细胞,MTT法检测不同浓度环氧化酶-2选择性抑制剂NS398(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L)对细胞增殖的抑制作用,克隆形成实验检测亲本细胞和细胞球的增敏效应,成球实验分析NS398联合X线照射对细胞成球能力的影响,Western blot检测细胞β-catenin蛋白的表达水平.结果:NS398对亲本细胞和细胞球的增殖抑制作用均具有时间、浓度依赖性.20 μmol/L NS398作用后,亲本细胞Do、Dq和SF2值均减小(P＜0.05),放射增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)为1.17;20 μmol/LNS398作用后,细胞球Do、SF2减小(P＜0.05),SER为1.12.照射使ECA109细胞成球率增加(P＜0.05).NS398联合X线照射组与单纯照射组相比,细胞成球率显著降低(t=7.01,P＜0.01),亲本细胞和细胞球β-catenin的表达水平均降低(t=10.15,P＜ 0.01;t=3.225,P＜0.05).结论:细胞球的增敏效应小于亲本细胞,具有抗辐射特性,其机制可能与抑制细胞β-catenin蛋白表达有关.
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食管癌细胞株中肿瘤干细胞样细胞的分离培养及生物学鉴定
目的:用无血清培养基方法从人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中分离富含肿瘤干细胞的细胞球并鉴定其生物学特性.方法:运用无血清培养基培养KYSE-150、TE-1细胞,观察细胞球的生成及在有血清培养基中的分化情况,利用MTT法以及Transwe11小室法研究食管癌细胞球的增殖情况和侵袭能力,流式细胞仪检测分子标志CD44、CD271的表达.结果:KYSE-150、TE-1细胞在无血清培养基培养条件下可以获得可稳定传代的细胞球,细胞球细胞的增殖能力和侵袭能力均高于其亲本细胞;无血清培养基培养下KYSE-150细胞球中CD44+、CD271+、CD44+CD271+细胞分别为(64.92±11.04)％、(28.27±6.79)％、(24.07±5.39)％,均显著高于亲本细胞[(37.04±6.30)％、(3.69±0.49)％、(1.64±0.11)％,P均＜ 0.05].TE-1细胞球中CD44+、CD271+、CD44+CD271+细胞占(6.41±0.87)％、(2.58±0.17)％、(0.27±0.53)％,均显著高于亲本细胞[(1.87±0.18)％、(0.44±0.10)％、(0.09±0.02)％,P均＜0.05].结论:应用无血清培养基可以从KYSE-150、TE-1细胞系中分离出具有干细胞特性的食管癌细胞球,CD44、CD271分子可能是食管癌干细胞的标志.
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包载姜黄素纳米胶束的制备与体外抗肿瘤评价
目的:构建载姜黄素纳米胶束,体外评价其对C6脑胶质瘤细胞的生长抑制作用.方法:合成新型十一烯酸-接枝-ε-多聚赖氨酸(ε-PLL-UNA)聚合物,并对其结构进行表征,采用芘荧光探针法对其临界胶束浓度进行测定;以ε-PLL-UNA为材料,采用透析法制备载姜黄素纳米胶束,以动态光散射和透射电镜对其粒径、形态进行表征,以动态透析法测定药物释放行为,以激光共聚焦显微镜观察体外细胞摄取性,以肿瘤球模型考察其体外抗肿瘤作用.结果:1H-NMR和FT-IR结果表明ε-PLL-UNA聚合物成功合成,其临界胶束浓度为0.19 g/L,能自发组装成胶束;载姜黄素纳米胶束载药量能达到12.22%±2.13%、包封率则高达85.12%±3.64%,平均粒径为(60.6±2.1)nm、Zeta电位为(28.2±5.6)mV,具有球形微观结构;该纳米胶束48 h释放84%的姜黄素,体外快速被C6细胞摄取;与姜黄素溶液相比,该纳米胶束能明显抑制胶质瘤细胞球的生长.结论:ε-PLL-UNA聚合物胶束对姜黄素具有较高的载药量,粒径小于100 nm、分布均匀,体外缓慢释放药物,提高了C6细胞对姜黄素的摄取,而且对C6细胞球具有有效的杀伤作用.
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人牙根尖乳头细胞体外无支架三维培养的生物学行为研究
目的 探讨根尖乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAP)在无支架三维培养条件下的生物学行为.方法 用显微镜和HR染色观察SCAP球的大体形态,组织学结构;用免疫组化法检测SCAP球中骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP)和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的表达.结果 细胞球的大小对球体内部细胞的生长有影响,SCAP球具有向成骨和向内皮分化的潜能.结论 无支架三维培养是一种可行的SCAP培养方法.
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LY294002抑制 PI3K-Akt 通路对富集肝癌干细胞细胞球增殖的影响
目的：探讨 LY294002对富集肝癌干细胞的细胞球增殖和磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶 B （PI3K-Akt）通路的影响。方法对人肝癌 HepG2细胞进行无血清悬浮培养获得富集肝癌干细胞的细胞球，消化后使用 LY294002（10、20、30μmol/ L）培养作为实验组，对照组不使用 LY294002。细胞活性计数法检测细胞增殖活性，Western blotting 检测 Akt，实时定量 PCR 检测 PI3K-Akt 信号通路下游基因诱骗受体3（DcR3）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）的表达。结果与对照组相比，30μmol/ L LY294002可显著抑制富集肝癌干细胞的细胞球增殖，吸光度（A）值有显著差异[（0.14±0.03）：（0.56±0.01），t =-8.915，P =0.000]；磷酸化 Akt 表达水平明显降低[（0.57±0.08）：（0.16±0.42），t =6.027，P =0.026]；DcR3[（0.38±0.08）：1，t =13.060， P =0.006]、mTOR[（0.37±0.04）：1，t =30.363，P =0.001]、Bcl-2[（0.26±0.04）：1，t =33.554，P =0.001]、Cyclin D1[（0.1±0.02）：1，t =63.528，P =0.000]表达明显减少。结论 LY294002可能通过抑制 PI3K-Akt 通路而抑制富集人肝癌干细胞的细胞球的增殖。
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小鼠髓母细胞瘤干细胞分离培养及干细胞标记物的分析
目的 旨在建立自发髓母细胞瘤模型小鼠肿瘤干细胞分离培养方法,观察其在体外形成克隆的能力,对可能的肿瘤干细胞标志分子CD44、CD133和CD15进行流式细胞术分析鉴定.方法 将小鼠髓母细胞瘤组织通过温和消化液消化分离成单细胞悬液,于干细胞培养基中培养.计算其细胞球形成率.于含血清培养基中培养观察分化能力.利用流式细胞术对其表面可能的干细胞表面标记分子进行分析鉴定.结果 从模型小鼠髓母细胞瘤组织中成功分离培养髓母细胞瘤原代细胞,原代细胞可形成具有高度的自我更新和增殖能力的细胞球;细胞球可在含血清培养基中贴壁分化成为神经元样细胞;干细胞表面标记分子流式细胞术分析表明髓母细胞瘤干细胞中CD44表达较高,CD133及CD15的表达无差异或者降低.结论 髓母细胞瘤肿瘤细胞中存在一定量的具有自我更新增殖能力、高表达CD44的肿瘤干细胞,并能在体外将其分离培养、连续传代及诱导发生分化.
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人肺癌细胞系A549中肿瘤干细胞样细胞的分离及鉴定
目的 从人肺癌细胞系A549中分离并鉴定肺癌干细胞.方法 将A549细胞置于无血清条件培养基中培养,形成细胞球,采用平皿克隆形成实验、MTT细胞增殖实验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术,检测并比较A549细胞和A549细胞球的增殖能力及干细胞相关标记的表达水平,鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性.结果 利用无血清条件培养基从A549细胞中分离出肿瘤干细胞样细胞；相比A549细胞,细胞球呈悬浮生长,增殖能力和克隆形成数目(104±7)高于贴壁细胞[(37±3)(P＜0.05)],且干细胞相关标记Sox2(2.68±0.39)和Oct4( 1.23 ±0.12)表达水平明显提高[贴壁细胞Sox2(0.05 ±0.02)、Oct4(0.10±0.02),P＜0.05].结论 运用无血清条件培养基可以从A549细胞系中有效富集肺癌干细胞样细胞.
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残耳软骨细胞诱导脂肪来源干细胞体外软骨形成实验研究
目的 探讨残耳软骨细胞能否在体外模拟软骨诱导微环境,促进脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)向软骨分化并形成软骨样组织. 方法 取外耳再造术中废弃的先天性小耳畸形患者残耳软骨组织与皮下脂肪组织分离培养,分别收集第2代残耳软骨细胞与第3代ADSCs,以3∶7比例混合培养作为实验组(A组),单纯残耳软骨细胞和单纯ADSCs作为对照(分别为B组和C组).取各组细胞1.0×106个离心培养获得细胞球后,体外培养28 d,大体观察各组细胞球取材时的外观变化,测量湿重；阿利辛蓝比色法检测糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)含量；RT-PCR检测各组标本的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan) mRNA表达；并行HE、甲苯胺蓝、番红O组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测. 结果 体外培养28 d后,A、B组标本形成白色半透明圆盘状组织块,表面光滑,弹性可；C组标本组织块有明显收缩,呈黄色球状,无弹性.A、B组标本湿重及GAG含量显著高于C组(P＜0.05)；A、B组间差异无统计学意义(t=1.820 3,P=0.068 7;t=1.861 4,P=0.062 7).RT-PCR检测示A、B组标本均可见Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA条带清晰表达,C组未见明显表达；A、B组Ⅱ型胶原与Aggrecan mRNA表达均显著高于C组(P＜0.05),A、B组间差异无统计学意义(t=1.457 6,P=0.144 9;t=1.519 5,P=0.128 6).组织学观察示:A组与B组细胞球标本形成了大量软骨陷窝样结构,细胞外基质均有不同程度染色；C组细胞球标本组织内主要为纤维性成分,未见软骨陷窝,细胞外基质染色阴性.A、B组可见在软骨陷窝周围有不同程度棕黄色沉淀即Ⅱ型胶原表达,C组未见明显表达；A、B组灰度值显著低于C组(P＜0.01),A、B组间差异无统计学意义(t=1.661 5,P=0.097 0). 结论 残耳软骨细胞可在体外独立模拟软骨诱导微环境,促进ADSCs软骨定向分化并形成软骨组织.
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人食管鳞癌细胞系EC109中肿瘤干细胞的分离(富集)与鉴定
目的 运用无血清成球培养法从人食管鳞癌细胞系EC109中分离/富集肿瘤干细胞,并对其“干性”特性进行鉴定.方法 将EC109细胞接种至添加1X B27的干细胞培养基(DMEM/F12 1∶1,无血清),于poly-Hema包被的培养皿或低黏附培养板中培养,获取细胞球.采用实时定量PCR方法检测其干性相关转录因子的基因表达,连续传代和平板克隆形成实验评价其自我更新能力,免疫荧光细胞化学法检测其分化前后干性相关转录因子和分化标志物的表达变化,以裸鼠移植瘤实验检测其体内成瘤能力.结果 培养5d能获得EC109细胞的细胞球.细胞球细胞高表达Oct4等干性相关转录因子,具有自我更新能力、分化潜能.裸鼠体内1×104个细胞球细胞能启动肿瘤形成,而单层培养细胞则需要1×105个细胞,且同数量级的细胞球细胞较单层培养细胞所形成的肿瘤体积大.结论 无血清成球培养法能从食管鳞癌细胞系EC109获得细胞球,细胞球富集了肿瘤干细胞.
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人肺癌干细胞分离培养及鉴定的实验研究
目的:从人肺腺癌细胞株SPC-A1中分离及鉴定具有干细胞特征的高致瘤性干细胞.方法:无血清条件下培养肺癌细胞,利用细胞生长因子诱导球体形成,球体细胞通过检测干细胞标志物及裸鼠成瘤实验,鉴定其肿瘤干细胞的特性.结果:SPC-A1肺腺癌细胞经无血清悬浮培养可形成细胞球;肺球体细胞CD133、ABCG2表达率明显高于肺癌细胞;肺球体细胞具有高致瘤性,在裸鼠中移植1×103个细胞即可形成肿瘤.结论:人肺腺癌细胞株无血清培养可形成细胞球,肺球体细胞肿瘤干细胞高度富集并具有致瘤性.
