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黄芪及其有效成分对干细胞影响的研究进展
黄芪在治疗缺血性脑卒中方面发挥着重要的作用,而随着干细胞的出现,黄芪及有效成分在促进干细胞增值方面的作用越来越受到研究者的重视.本文通过文献查阅的方法,以总结黄芪及有效成分对干细胞影响,为黄芪及有效成分治疗缺血性脑卒中提供依据.
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脂肪来源干细胞-组织工程学的新亮点
脂肪来源干细胞( Adipose derived stem cells,ADSCs)是来源于脂肪组织,具有多向分化潜能的干细胞群。它贴壁生长,显微镜下呈长梭形。没有特定的表面标记物,除了CD45以外,与骨髓间充质细胞具有相同的表面抗原。经特定条件诱导,ADSCs有分化为脂肪、骨、软骨、神经、血管内皮等多种器官或组织的细胞的潜能,经免疫组化、RT-PCR技术、镜下观察及染色等方法可鉴定ADSCs具有该种器官或组织细胞的结构和功能。因此,常用作组织工程的种子细胞进行人工器官的再造或用作细胞治疗,来解决软骨组织工程、神经与皮肤的创伤和脂肪移植等临床方面的问题,并参与促进各种损伤的人体组织修复和再生。近年来,ADSCs已逐渐成为国内外新的干细胞移植的种子细胞来源。本文结合近年来的相关研究,就ADSCs的生物学特性、分化潜能与鉴定方法,国内外的研究进展、本实验室的工作积累及研究意义和所存在的问题等方面进行了综述。
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富血小板纤维蛋白对人脂肪干细胞增殖和成脂分化的影响
目的 探讨自体富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)对体外培养人脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖及成脂分化的影响.方法 将自愿捐献由脂肪抽吸术获取的脂肪组织进行分离培养ADSCs并鉴定.将第3代ADSCs分为空白对照组和1个PRF膜片组(1PRFM组)和2个PRF膜片组(2PRFM组).倒置显微镜观察细胞生长情况,培养后1、2、3、4、5、6、7d采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)法检测细胞增殖活性.在第3、5、7、9、11和14天时采用油红O染色法检测细胞成脂分化情况.结果 随着PRFM剂量的增加,细胞增殖数量和成脂率增加,3组差异具有显著统计学意义.结论 PRF能明显促进ADSCs增殖和成脂分化,可以作为自体材料应用于脂肪组织工程的研究.
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体外碱性成纤维细胞生长因子聚乳酸纳米缓释微球对人脂肪干细胞增殖和成脂分化的影响
目的 体外观察碱性成纤维细胞生长因子(basie fibroblast growth factor,bFGF)聚乳酸纳米缓释微球对人脂肪干细胞增殖和成脂分化的影响,为bFGF缓释微球应用于脂肪组织工程的研究提供理论依据.方法 体外分离培养脂肪干细胞,并行多向诱导分化鉴定.配制含有0、1、2、3、4、5 mg/ml bFGF聚乳酸缓释微球的脂肪干细胞培养液及成脂分化诱导液.将脂肪干细胞接种至96孔板,第2天更换含不同浓度hFGF缓释微球的培养液和成脂诱导液,分别用四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)和油红O定量检测法定期检测细胞增殖和成脂分化的情况.所得数据均用SPSS13.0软件进行统计学处理.结果 bFGF聚乳酸缓释微球有明显促进脂肪干细胞增殖和成脂分化的作用.增殖实验和成脂诱导实验合适的作用浓度分别为3 mg/ml和4 mg/ml.结论 bFGF聚乳酸纳米缓释微球体外可以明显促进脂肪下细胞的增殖和成脂分化,可作为一种较理想的细胞因子缓释系统应用于脂肪组织工程的研究.
关键词： 脂肪来源干细胞 碱性成纤维细胞生长因子 缓释微球 成脂分化 -
人脂肪组织细胞外基质支架的构建
目的 探讨从人脂肪组织中提取细胞外基质并构建支架的方法,研究其结构特点,分析其作为脂肪组织工程支架的可行性.方法 收集抽脂术患者的脂肪组织,共7例,每例约310 ml,10 ml用来分离培养脂肪来源干细胞,300 ml提取细胞外基质,并制备成粉末状,扫描电镜观察其表面结构.DiI荧光标记脂肪来源干细胞,统计荧光标记后细胞存活率；将荧光标记前、后的细胞与支架粘附,检测其粘附率,所得数据用SPSS 13.0软件两样本t检验进行统计学比较,分析标记前后细胞粘附率有无差异；荧光显微镜下观察细胞在支架表面生长情况.结果 从人脂肪组织中提取得到脂肪来源干细胞和细胞外基质粉末.脂肪来源干细胞具有成脂、成软骨和成骨分化的能力；扫描电镜观察细胞外基质粉末具有多孔、粗糙表面和光滑表面的结构.脂肪来源干细胞与支架粘附较好；DiI标记前、后细胞粘附率分别为(88.81±4.81)％和(86.48±4.58)％,两样本t检验,P=0.371,差异无统计学意义(P＞0.05).荧光显微镜下脂肪来源干细胞在细胞外基质支架上生长状态良好.结论 人脂肪组织细胞外基质粉末容易获取,形状和颗粒体积具有高度的多样性,表面积较大,有利于脂肪干细胞的粘附和增殖,可作为一种较理想的脂肪组织工程支架材料.
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促进脂肪移植的佳SVFs浓度的实验研究
目的 探讨应用自人脂肪组织新鲜分离的不同浓度的血管基质层细胞( stromal vasvular fraction cells,SVFs)辅助脂肪移植,从而提高移植物的存活率的方法.方法 脂肪组织来自临床行吸脂术者,提取SVFs,将0.3 ml待移植的脂肪颗粒分别与浓度为①5×105个/ml(A组)；②1 × 106个/ml(B组)；③2×106个/ml(C组)的SVFs混合,另设对照组为完全培养基+单纯脂肪颗粒(D组),随机注射移植于6只裸鼠背部皮下.术后3个月观察移植物情况:①湿重.②切片HE 染色计数血管密度.③方网测试系统“点计数”法检测存活脂肪细胞计数以及纤维坏死组织计数.结果 ①湿重:A组(60.000±6.325) mg,B组(81.670±7.528) mg,C组(68.330±7.528) mg,D 组(48.330±7.528) mg,B组脂肪存活率均高于A、C、D组(P<0.05),A、C2组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).②血管密度:A、B、C组血管密度均高于D组,且B组明显高于其他3组(P＜0.05),A、C2组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).③点计数:B组存活脂肪细胞计数均高于A、C、D组(P＜0.05),纤维组织计数均低于D组(P ＜0.05),A、C2组之间比较差异均无统计学意义(P＞ 0.05).结论 来源于人自体SVFs复合脂肪颗粒能够显著提高移植脂肪组织的成活率,其中1×106个/ml数量级的SVFs移植脂肪的存活率高,更适合用于脂肪移植,具有广阔的临床应用前景.
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血管基质片段细胞携血管内皮生长因子对移植颗粒脂肪血管化的影响
目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)复合血管基质片段细胞( stromal vascular fraction cells,SVFs)细胞疗法对移植颗粒脂肪组织血管化的影响,寻找一种安全、有效、简单的细胞辅助脂肪移植术式.方法 取患者植皮术后废弃的皮下脂肪,提取SVFs.用DiI染色观察SVFs染色标记情况,锥虫蓝染色观察SVFs活性.将0.3 ml待移植的脂肪颗粒分别与0.2 ml下列细胞混合:①复合有VEGF的SVFs(A组)；②SVFs(B组)；③DMEM完全培养基(C组).按照随机化原则将3组脂肪组织混合物分别注射移植于裸鼠背部皮下,每只裸鼠背上注射3个点(共12只).观察移植物外形、成活情况、湿重、直径,HE染色及CD31染色镜下观察并计数毛细血管密度.使用SPSS 16.0进行方差分析检验.结果 新鲜提取的SVFs可被DiI标记染色,加用VEGF仍能保持较好的细胞活性,移植术后2个月3组移植脂肪的湿重为:A组(191.90 ±9.81)mg、B组( 177.01±10.50)mg、C组(92.05±8.30)mg,A组＞B组＞C组(P＜0.01).移植物直径为:A组(0.49±0.24)cm、B组(0.40±0.26) cm、C组(0.32±0.28) cm,A组＞B组＞C组(P＜0.01).CD31染色镜下,每高倍镜视野微血管密度:A组(14.58±2.06)个、B组(11.55±2.18)个、C组(7.87±1.55)个,与B组和C组比较,A组较少见纤维结缔组织增生及坏死凋亡细胞.结论 结合VEGF因子的SVFs辅助脂肪移植是一种临床可操作性强、简便可行的较理想的细胞疗法,比单纯SVFs更能有效地促进移植脂肪血管化.
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活体MR成像监测移植干细胞治疗SD大鼠心肌梗死并评价左心功能的可行性研究
目的 以超小超顺磁性氧化铁(USPIO)标记SD大鼠脂肪来源干细胞(ADSCs),探讨临床型1.5 T MR扫描仪活体示踪SD大鼠急性心梗后心肌注射USPIO标记的干细胞并同时评估心功能的可行性.方法 USPIO 40 μg Fe/ml、多聚赖氨酸(poly-l-lysine,PLL) 1.5 μg/ml与ADSCs共孵育培养,普鲁士蓝染色和透射电镜验证标记有效性、MTS试验验证标记安全性.开胸结扎实验组(n =10)SD大鼠冠状动脉前降支建立心梗模型并于心肌内注射标记干细胞,术后利用1.5 T MR扫描仪对实验组和空白对照组(n =5)大鼠行磁共振成像,观察心肌信号、计算并比较两组大鼠的左室舒张末容积(left-ventricular end-diastolicvolume,LVEDV)、左室收缩末容积(left-ventricular end-systolic volume,LVESV)及左室射血分数(left-ventricular ejection fraction,LVEF).病理组织学检查观察心肌结构和标记ADSCs的分布.结果 普鲁士蓝染色显示USPIO标记ADSCs的阳性率＞99%,透射电镜下可见黑色氧化铁颗粒位于细胞溶酶体内,MTS试验证实USPIO标记对ADSCs细胞活性无明显影响.开胸结扎冠脉前降支成功构建心梗模型,实验组大鼠心脏于FIESTA和FSPGR序列图像上可见左室前壁内信号降低和室壁运动异常,2D MDE序列图像上发现实验组心肌内延迟强化.实验组LVEDV、LVESV、LVEF分别为0.52±0.05 ml,0.20±0.03 ml和61.0±4.3%,空白对照组分别为0.44±0.04 ml,0.25±0.05 ml和42.7±13.4%,两组大鼠的LVEF、LVEDV差异具有统计学意义(P ＜0.05).病理组织学检查于梗死心肌周边发现局灶性氧化铁颗粒沉积.结论 临床1.5 T MR成像仪活体示踪SD大鼠心肌梗死注射移植USPIO标记的ADSCs并同时评估SD大鼠心功能是可行的.
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骨形态发生蛋白4基因修饰的脂肪来源干细胞复合藻酸钙凝胶支架修复关节软骨的实验研究
目的:观察骨形态发生蛋白4(BMP4)修饰的脂肪来源干细胞(ADSCs)复合藻酸钙凝胶支架修复猪膝关节软骨缺损的实验效果.方法:分离并培养猪ADSCs.构建表达BMP4的腺病毒载体系统,并成功转染ADSCs,通过免疫荧光显微镜及流式细胞学观察其转染效率.在体外,通过ELISA法检测BMP4基因修饰ADSCs后软骨相关蛋白的表达情况.选取中国实验用小型猪24只(雄性,6个月,25～30 kg),随机分为4组:组1为空白对照组,即单纯软骨缺损组;组2为单纯藻酸钙凝胶支架修复组;组3为ADSCs复合藻酸钙凝胶修复组;组4为BMP4基因修饰的ADSCs复合藻酸钙支架修复软骨缺损组.分别于术后12周、24周取材,通过组织形态学方法来评估缺损修复情况.结果:体外实验证实,携带BMP4的腺病毒能够成功转染ADSCs,并诱导其表达软骨组织特异性蛋白Sox9和Col Ⅱ.同时体内实验证实BMP4基因修饰的ADSCs复合藻酸钙凝胶支架可修复小型猪膝关节软骨缺损.结论:体内外实验证实,BMP4基因修饰的ADSCs复合藻酸钙凝胶支架可用于修复猪关节软骨缺损,为软骨损伤修复提供了一种选择.
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脂肪来源干细胞移植干预兔骨骼肌放射性纤维化的实验研究
目的 观察脂肪来源干细胞(adipose-derive stem cells,ASCs)植入放射损伤骨骼肌后的纤维化程度改变,探讨ASCs对兔骨骼肌放射性纤维化的影响.方法 64只新西兰兔单侧臀部予9 MeV电子线单次照射80 Gy后,采用随机数字表法分为ASCs组和PBS组,每组32只,照射24 h后照射侧分别肌肉注射1 ml含5×107 ASCs的PBS悬液和1 ml PBS缓冲液,未照射一侧作为各组的正常对照.分别于照射后1、4、8和26周,收集各组8只实验动物肌肉标本,计算Masson染色切片胶原纤维面积占总面积的比值,利用免疫组织化学及Western blot法检测骨骼肌中TGF-β1蛋白的表达.结果 ASCs植入骨骼肌后能在放射损伤部位迁移.ASCs组及PBS组纤维化程度随照射后时间延长而加重,ASCs组胶原纤维面积占总面积的比值较PBS组在照射后4、8和26周显著降低(t=4.62、5.99和10.48,P＜0.05).ASCs组骨骼肌组织TGF-β1的IOD值较PBS组在照射后4、8和26周显著降低(=3.79、16.45和15.17,P＜0.05).Western blot检测ASCs组TGF-β1蛋白的表达水平较PBS组低.结论 ASCs移植能抑制放射损伤骨骼肌组织TGF-β1的表达减轻放射性纤维化.
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脂肪来源干细胞修复骨骼肌放射损伤的病理学研究
目的 观察CM-Dil标记的脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)植入放射损伤骨骼肌后的病理学改变,探讨ASCs对兔骨骼肌放射损伤的修复影响.方法 64只新西兰兔单侧臀部予9 MeV电子线单次照射80 Gy后采用随机数字表法分为ASCs组和磷酸盐缓冲液(PBS)组,每组32只,照射24 h后照射侧分别肌肉注射1 ml含5×107/ml标记后ASCs的PBS悬液和1 mlPBS缓冲液,未照射一侧作为各组正常对照.分别于照射后1、4、8和26周收集各组实验动物肌肉标本.观察标记后ASCs在骨骼肌组织中的分布及迁移,分析骨骼肌损伤病理学分级,观察4和26周时肌组织超微病理结构改变.结果 标记后的ASCs能在损伤部位迁移.ASCs组受照射骨骼肌组织病理损伤分级较PBS组在照射后1、4、8、26周显著减低(U=11.5、12.0、11.0,P＜0.05).ASCs组26周时再生肌细胞数(27.01土9.36)显著高于PBS组(5.23 ±4.23)(t=15.12,P＜0.05).ASCs组4和26周肌原纤维损伤程度较PBS组轻,26周ASCs组肌细胞肌间隙可见肌原纤维状结构增生.结论 ASCs能减轻受照射骨骼肌的病理组织学损伤,促进肌卫星细胞的代偿增生、再生肌组织,可能是修复骨骼肌放射损伤的部分机制.
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脂肪来源干细胞促进放射损伤骨骼肌血管生成的实验研究
目的 观察新西兰兔脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)植入放射损伤骨骼肌后的微血管密度改变,分析组织中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)的变化,探讨ASCs移植对兔放射损伤骨骼肌血管生成的影响.方法 64只实验动物单侧臀部予9 MeV电子线一次性照射80 Gy,采用随机数字表法分为ASCs组和磷酸缓盐冲溶液(PBS)组,每组为32只.照射后24 h,ASCs组和PBS组照射侧分别肌肉注射1 ml含5×107个ASCs的细胞悬液及PBS.免疫组织化学法检测照射后1、4、8和26周骨骼肌组织中CD31阳性的微血管、VEGF和bFGF的表达.蛋白印迹法检测骨骼肌组织中VEGF、bFGF蛋白表达.ELISA法检测ASCs在条件培养基中分泌的VEGF、bFGF浓度.结果 ASCs组受照射骨骼肌组织中CD31染色阳性的微血管密度较PBS组在照射后4、8和26周增高(t=8.14、7.44、18.58,P＜0.05).ASCs组受照射骨骼肌组织VEGF、bFGF的累计光密度值(IOD)较PBS组在照射后1、4、8和26周增高(VEGF:t=3.13、4.66、2.19、6.79,P＜0.05;bFGF:t =3.14、3.84、4.28、3.61,P＜0.05).ASCs组VEGF蛋白的表达水平较PBS组在照射后1、4、8和26周增高(t=4.28、5.02、4.24、4.56,P＜0.05).ASCs组bFGF蛋白的表达水平较PBS组在照射后4、8和26周增高(=3.36、3.16、5.77,P＜0.05).ASCs在放射损伤肌肉匀浆上清条件培养基中较在正常肌肉匀浆上清条件培养基中分泌的VEGF浓度在48、72和96 h增高(t=2.81,9.96,4.75,P＜0.05),分泌的bFGF浓度在72和96 h增高(t=3.80,4.33,P＜0.05).结论 ASCs能上调骨骼肌放射损伤组织VEGF和bFGF分泌、增加新生血管形成,可能是修复骨骼肌放射损伤的部分机制.
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温敏性壳聚糖水凝胶对脂肪来源干细胞生物学性能影响的实验研究
目的 检测温敏性壳聚糖水凝胶对脂肪来源干细胞(ADSCs)的生物学性能影响.方法 提取大鼠ADSCs和制备温敏性壳聚糖水凝胶,体外检测在温敏性壳聚糖水凝胶携带下的ADSCs细胞活力、增殖情况、多向分化潜能等生物学性能.结果 与正常培养条件下ADSCs相比,温敏性壳聚糖水凝胶携带下的ADSCs细胞活力良好、增殖能力正常,并仍能保持多向分化潜能.结论 温敏性壳聚糖水凝胶材料具有良好的细胞相容性,有望作为可注射性心肌组织工程研究中良好的可注射性支架材料.
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不同途径移植脂肪来源干细胞对创伤性脑损伤大鼠空间记忆的影响
目的 观察经不同途径移植脂肪来源干细胞(ADSC)后创伤性脑损伤大鼠记忆的变化, 探讨干细胞移植的佳途径.方法 以酶化学法自大鼠脂肪组织中分离培养大鼠ADSCs,建立侧方液压打击创伤性脑损伤大鼠模型, 将ADSCs分别经尾静脉注射(伤后1d、3d、7d,2×106/次)、海马背侧CA1区局部注射(伤后1d,2×106/次)移植入实验动物体内, 对照组造模成功后,不予处理自然转归,各组模型均于移植后22天采用Morris水迷宫检测大鼠的空间记忆功能以及伤后7d、14d、28d应用RT-PCR检测脑源性神经生长因子(BDNF) mRNA的表达.结果 经酶消化法分离得到的ADSCs经流式细胞检测以及成骨、成脂分化提示其具有间充质干细胞的生物学特性,经不同途径移植ADSCs后,定位航行测试结果表明细胞移植组逃避潜伏期均较对照组明显缩短(P<0.05);空间探索能力测试结果表明细胞移植组于目标象限的游泳时间较对照组明显延长(P<0.05),RT-PCR检测结果表明细胞移植组BDNF mRNA的表达较对照组明显增高,差别均具有统计学意义(P<0.05),而移植组之间在空间能力的改善以及14、28天时BDNF mRNA的表达的影响无统计学差异(P>0.05).结论 治疗大鼠创伤性脑损伤时,ADSCs经尾静脉(多次移植)与脑内损伤区移植在改善空间记忆障碍方面无显著差异.
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脂肪来源干细胞的基础研究及成脂应用进展
目前已经证实可以从脂肪组织中获取具有多向分化能力的细胞[1-2],这些细胞一般被称之为脂肪来源干细胞( adipose derived stem cells,ADSC)、脂肪来源基质细胞(adipose derived stromal cells,ADSC)、脂肪来源的间充质祖细胞(adipose derived progenitor cells)或前脂肪细胞(preadipocytes),然而这些不同的命名在文献中往往混淆使用,为有利于文献的发表交流,国际脂肪利用科技学会(international society of fat to use technology)已经达成了共识,采用“脂肪来源干细胞”( ADSC)来定义从脂肪组织中分离出来的具有多向分化潜能的细胞群.
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超小超顺磁性氧化铁体外标记SD大鼠脂肪来源干细胞
目的 评估超小超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)标记SD大鼠脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)的有效性及安全性,探讨标记细胞体外磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)特点.方法 将USPIO 40μg/ml及多聚赖氨酸(polv-L-lysine,PLL)1.5μg/ml的培养基与ADSCs共孵育培养24 h,检测USPIO标记的有效性及安全性,并用MRI对标记细胞进行体外成像.结果普鲁士蓝染色显示USPIO标记ADSCs的阳性率为99％,透射电镜提示USPIO颗粒主要位于胞质内溶酶体中；台盼蓝染色实验显示活细胞数大于95％,MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium,溴化噻唑蓝四氮唑]实验提示USPIO浓度为10、20、40、80和160μg/ml时不影响ADSCs增殖.ELISA结果表明标记细胞与未标记细胞组间培养液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平无显著差异；体外条件下,MRI图像信号强度与标记细胞数量呈正相关.结论 USPIO标记ADSCs安全有效,MRI图像信号强度与标记细胞数量存在一定相关性,提示USPIO可用于在体条件下MRI成像示踪标记细胞.
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ADSCs粘附脂肪组织细胞外基质支架构建组织工程化脂肪的实验研究
目的 探讨以成人脂肪来源干细胞(Adipose-derived Stem Cells,ADSCs)为种子细胞粘附于人脂肪组织细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)支架构建组织工程化脂肪的条件与方法.方法 采用Body-jet水动力辅助吸脂系统自成人下腹部皮下脂肪丰厚区抽吸获取颗粒脂肪100 ml,酶消化法分离、培养、多向分化诱导鉴ADSCs.从吸脂获取的脂质部分分离提取人脂肪组织ECM成分,经过低温冻干、粉碎、灭菌等一系列处理,得到粉末状ECM产物,电镜扫描观察表面特征并将其与脂肪来源干细胞进行粘附实验,探讨其作为支架材料的可行性.收集ADSCs,以2×106/ml的细胞密度粘附于ECM支架复合后移植于裸鼠背部皮下,同鼠对侧背部皮下只移植等量ADSCs作为对照,每侧移植0.5 ml,共6只实验鼠.8周后取材,称量标本湿重,收集数据并用SPSS18.0软件进行统计学处理分析.结果 从脂肪组织中分离得到AD-SCs和ECM支架.ADSCs与ECM支架相容性良好,粘附率达(89.87±2.59)％,细胞在支架表面可充分伸展生长.体内移植8周后,实验侧和对照侧都能够形成脂肪组织,湿重比较P=0.038＜0.05,实验侧较对照侧重,差别具有显著意义.经HE切片及油红O染色均证实实验侧形成成熟的脂肪组织,对照侧只能形成少量成熟的脂肪组织.结论 ADSCs粘附脂肪组织细胞外基质支架在体内能够成功构建成熟的脂肪组织,且8周后支架并无明显吸收,可作为一种较理想的构建组织工程化脂肪的方法.
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人脂肪来源干细胞增强型绿色荧光蛋白质粒转染及体内示踪
目的:对于人脂肪来源干细胞的应用,目前已开始进行临床前期体内移植实验,细胞标记与示踪是证明移植细胞转归和生成组织来源的关键问题.实验观察了带有增强型绿色荧光蛋白的基因质粒转染人脂肪来源干细胞的效果及体内示踪效应.方法:实验于2007-03/12在沈阳军区总医院整形美容外科中心实验室(省级)、沈阳军区呼吸中心实验室(国家级)和全军神经外科中心实验室(国家级)完成.①细胞来源与动物:脂肪组织取自1例腹壁整形术女性患者,对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.清洁级雄性裸鼠8只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.大肠杆菌JM109由本室保存.转染质粒pEGFP-N3为美国Clontech公司产品.②实验方法:无菌条件下切取患者脂肪组织,采用酶消化法体外分离培养脂肪来源干细胞,传至第3代时以2.5×107L-1密度接种,分别加入200,300,400,500,600,700,800,900mg/L G418,确定G418杀死所有细胞的低浓度(C0).采用脂质体法对人脂肪来源干细胞进行pEGFP-N3质粒转染,C0浓度G418筛选,计数阳性细胞率.培养5代后制备单个细胞悬液,浓度为8×1010L-1,植入到裸鼠背部皮下,采用活体化学发光和荧光成像系统观察大鼠荧光表达情况.结果:①体外培养的人脂肪来源干细胞贴壁后为成纤维细胞样,细胞生长活性良好,传代后生长速度加快.②当G418浓度为600 mg/L时细胞全部死亡,故将此浓度设定为C0.③pEGFP-N3质粒-脂质体复合物转化脂肪来源干细胞24 h后,绿色荧光蛋白阳性细胞率为(13.0±3.5)%,经C0浓度G418筛选后高达(65.0±5.4)%.④裸鼠背部皮下注射脂肪来源干细胞8周后,可见移植区周围弥漫分布绿色荧光区,提示植入细胞存活并广泛分布.结论:增强型绿色荧光蛋白质粒可以有效转染人脂肪来源干细胞,并在裸鼠体内呈现良好的示踪效果.
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兔脂肪组织来源干细胞体外生长特性及培养的适宜条件
背景:脂肪组织来源干细胞是位于脂肪荩质内的一种细胞,具有多向分化潜能,可以定向分化成多种细胞类型.目的:探索兔脂肪组织来源干细胞体外生长特性及胶原酶消化适宜条件.设计、时间及地点:细胞分子生物学实验,2008 05/09在解放军南京军区福州总医院比较医学科及实验科完成.材料:日本大耳白兔5只.Ⅰ型胶原酶为美国Worthington公司产品,低糖DMEM/F12培养液为美国Gibco公司产品.方法:兔颈后部皮下脂肪取材,采用Ⅰ胶原酶消化法获取细胞,按Ⅰ型胶原酶消化质量浓度分为1.0,1.5,2.0 g/L 3组,每组再按消化时间分为0.5,1,1.5 h3个亚组.脂肪组织剪碎混匀后均分为9等分,后重悬细胞终体积均定为2mL并计数,每个亚组计数6次,共取5次脂肪组织,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞.主要观察指标:细胞体外生长特性并比较不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间对兔脂肪来源干细胞体外培养的影响.结果:采用1.0,1.5,2.0 g/L三种不同胶原酶浓度进行消化,发现在消化时间为0.5 h和1 h时,2.0 g/L组消化细胞总数多,细胞总数与其他组比较.差异有显著性意义(P<0.01).在消化时间为1.5 h时,消化细胞总数较0.5 h和1 h均有增加,同时,1.0,1.5,2.0 g/L组消化细胞总数无统计学差异,活细胞比值1.0g/L组高,但与其他组无统计学差异,观察第3代细胞生长特性,1.0 g/L消化1.5 h组别具有更好的增殖活性.结论:脂肪来源干细胞具有较强的自我更新能力,对于兔脂肪组织来源干细胞,胶原酶浓度1.0 g/L、消化时间1.5 h是佳的抉取条件.
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脂肪源性干细胞成骨分化过程中成骨相关miRNA的表达模式
背景:miRNA在细胞分化等众多生理病理过程中起重要调控作用,可调节脂肪来源干细胞成骨分化.目的:筛选成骨分化相关miRNA,分析miRNA在脂肪来源干细胞成骨分化过程中的表达模式.方法:从皮下脂肪组织中分离、培养人脂肪来源干细胞.应用基因芯片技术筛选脂肪来源干细胞成骨诱导前后表达差异显著的miRNA,采用RT-PCR技术检测所筛选的miRNA在成骨诱导第7,14,21天上调/下调的相对表达强度,以ELISA试剂盒检测相应时间点成骨相关蛋白的表达情况.结果与结论:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的脂肪来源干细胞,一定诱导条件下具有成骨、成脂、成软骨分化能力.②基因芯片技术筛选出成骨分化前后表达差异变化明显的9个miRNA,其中5个上调,4个下调.③成骨诱导第7天,miR-106a表达上调1.58倍(P<0.05).第14天时,9个miRNA均表达上调.第21天时,5个miRNA表达上调,4个表达下调.④成骨相关蛋白骨钙素、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨唾液酸蛋白的质量浓度在诱导成骨分化第7天即明显升高,第14天达到峰值,第21天略有下降.
