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桑黄提取物对C3H10t1/2细胞增殖与成脂分化的影响
目的 探讨桑黄提取物对C3H10t1/2细胞体外增殖及成脂分化的影响.方法 采用95％乙醇回流提取,RP18柱色谱乙醇梯度洗脱制备桑黄提取物,水提醇沉制备多糖,通过MTS法分析各洗脱组分和多糖对C3H10t1/2细胞增殖影响,油红0染色法检测其对C3H10t1/2细胞成脂分化影响.结果 桑黄各组分对C3H10t1/2均无明显生长抑制作用;桑黄多糖对C3H10t1/2成脂分化无明显抑制作用,但95％乙醇提取物抑制作用明显,50 μg/ml抑制率可达81.36％,而其有效成分主要集中于RP18柱色谱95％乙醇洗脱部位,其30 μg/ml对C3H10t1/2成脂抑制率可达85.70％.结论 桑黄提取物对C3H10t1/2毒性较低,但95％乙醇提取物具有显著成脂抑制活性,主要成分为极性较小的脂溶性成分.
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小豆蔻明对C3H10T1/2细胞成脂分化影响的作用机制
目的:探讨小豆蔻明抑制C3H10T1/2细胞成脂分化的作用机制.方法:观察C3H10T1/2细胞成脂过程形态学变化,采用MTS法、油红O染色法、GAP-PAP酶法检测小豆蔻明对C3H10T1/2细胞增殖、成脂分化以及胞内甘油三酯含量的影响,采用RT-PCR与Western Blot技术检测小豆蔻明对C3H10T1/2细胞PPARγ、C/EBPα和FABP4 mRNA以及蛋白表达的影响.结果:60、80、100μmol/L小豆蔻明能够显著抑制C3H10T1/2细胞存活率(P<0.01);5、10、30μmol/L小豆蔻明能够抑制C3H10T1/2细胞脂滴的形成,从而抑制成脂分化;5、10、30μmol/L小豆蔻明能够显著降低细胞中甘油三酯的含量(P<0.05,P<0.01);10、30μmol/L小豆蔻明能够显著下调PPARγ、C/EBPα和FABP4 mRNA的表达(P<0.05,P<0.01);5、10、30μmol/L小豆蔻明能够显著降低成脂关键转录因子PPARγ、C/EBPα和成脂分化标志因子FABP4蛋白的表达(P<0.05,P<0.01).结论:小豆蔻明通过下调PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA以及蛋白表达抑制细胞成脂分化并降低胞内甘油三酯含量.
关键词： C3H10t1/2细胞 成脂分化 小豆蔻明 -
P38 MAPK信号通路参与BMP-13诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化
目的 探讨P38 MAPK对BMP-13诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化的影响.方法 实验共4个部分,分组如下:1)BMP-13腺病毒(Ad-BMP-13)对P38 MAPK的作用:Ad-BMP-13转染组、Ad-GFP转染组和C3H10空白组.Western blot检测磷酸化P38 MAPK(p-P38 MAPK)和总P38 MAPK(t-P38 MAPK)的表达变化,免疫荧光技术定位p-P38 MAPK;2)P38 MAPK干扰腺病毒(Ad-si-P38)对P38 MAPK的作用:si-P38干扰组、si-NC干扰对照组和C3H10空白组.Western blot检测t-P38 MAPK的表达；3)Ad-si-P38阻断P38 MAPK后对BMP-13诱导分化的影响:si-P38+ Ad-BMP-13转染组、si-NC+ Ad-BMP-13转染组、si-NC+ Ad-GFP转染组和C3H10空白组.Western blot检测cTnT和Cx43的表达,荧光定量PCR检测GATA-4和MEF-2C的mRNA表达；4)SB203580阻断P38 MAPK后对BMP-13诱导分化的影响:DMSO+ Ad-BMP-13转染组、SB203580(2、5和10 μmol/L)+Ad-BMP-13转染组.荧光定量PCR检测GATA-4和MEF-2C的mRNA表达.结果 BMP-13促进P38 MAPK的磷酸化.Ad-si-P38可以有效降低P38 MAPK表达水平.Ad-si-P38阻断P38 MAPK后BMP-13诱导组cTnT、Cx43表达有明显降低(P＜0.05),GATA-4和MEF-2C的表达也有显著降低(P＜0.05).随P38 MAPK特异性抑制剂SB203580浓度增加,BMP-13诱导组GATA-4和MEF-2C的表达降低(P＜0.05).结论 Ad-BMP-13可以通过激活P38 MAPK信号通路来调控C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化.
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Islet-1在乙酰化调控网络中特异性辅助C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化
目的 筛选并分析转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞转化为心肌样细胞过程中与Islet-1相互作用的组蛋白乙酰化酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs),明确Islet-1在C3H10T1/2细胞分化为心肌样细胞乙酰化调控网络中的关键枢纽作用.方法 培养转染Islet-1慢病毒载体的C3H10T1/2细胞,观察细胞形态.免疫荧光和免疫印迹检测Islet-1的表达部位和高表达时间点.免疫共沉淀与Islet-1结合的蛋白.免疫印迹验证Islet-1相互作用的HATs和HDACs.结果 诱导组细胞形态出现心肌样细胞改变.各组Islet-1主要在胞质表达.诱导组Islet-1表达量在诱导后3周高(0.782 ±0.015).诱导组Islet-1表达量显著高于空白对照组和C3H10组(分别为0.819±0.026,0.127±0.006和0.126 ±0.001)(P＜0.05),免疫共沉淀技术可行.与Islet-1相互作用的HATs和HDACs有GCN5、P300/CBP和HDAC4.结论 Islet-1与GCN5、P300/CBP和HDAC4相互作用特异性辅助C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化.
关键词： C3H10t1/2细胞 Islet-1 心肌样细胞 组蛋白乙酰化 -
BPI-BD3融合抗菌肽修饰C3H10T1/2细胞对小鼠感染创面愈合的影响
目的 观察pAdxsi-BP1-BD3转染C3H10T1/2细胞对小鼠感染创面愈合的影响.方法 使用重组腺病毒载体pAdxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2细胞,并采用RT-PCR及Western blotting进行鉴定.取30只KM小鼠行直径1cm的全层皮肤缺损创面,并接种金黄色葡萄球菌制造感染创面.造模后,随机均分为3组每组10只,T组尾静脉注射pAdxsi-BPI-BD3转染后的C3H10T1/2细胞,C组注射未转染的C3H10T1/2细胞,N组注射等量PBS.通过大体观察、痂下细菌计数、测定创面残留面积、HE染色等来评价BPI-BD3修饰的C3H10T1/2的促愈效果.结果 与其余两组相比,T组痂下菌量较少(P＜0.05),且T组愈合较快,7、14d时,创面残留面积与其余两组相比差异有统计学意义(P＜0.05).HE染色结果显示,与其余两组相比,T组炎症较轻、表皮生长较快.结论 BPI-BD3修饰的C3H10T1/2可以促进金黄色葡萄球菌所致的小鼠感染创面的愈合.
关键词： C3H10t1/2细胞 β防御素 杀菌/通透性增加蛋白 伤口感染 -
生物力学因素与BMP2单核苷酸多态性对颈椎后纵韧带骨化成骨作用的影响
目的 探讨生物力学因素与骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)单核苷酸多态性对颈椎后纵韧带骨化(ossification of the posterior longitudinal ligament,OPLL)成骨作用的影响,为进一步发现OPLL多因素共同致病的具体机制奠定基础.方法 采集颈椎OPLL病变组手术减压过程中骨化部位的后纵韧带和颈椎外伤等手术减压过程中的正常对照组后纵韧带.利用PCR和直接测序法分析BMP2上2个单核苷酸多态性位点109T＞G(rs2273073),570A＞T(rs235768)基因型及等位基因型的分布.Masson三色染色观察组织学结构改变.免疫组织化学染色和Western blot法检测BMP2的分布和表达.用C3H10T1/2细胞做转染构建细胞模型:正常组、空载体组、BMP2野生型组、BMP2(rs2273073)单突变组、BMP2(rs235768)单突变组、BMP2(rs2273073,rs235768)双突变组.采用机械应力装置对接种于Flexercell板的细胞施加10％、0.5Hz的机械应力,持续加载24h.以同样接种于Flexereell板未施加机械应力的细胞作为对照组.采用Western blot法检测机械应力加载前后各组BMP2表达情况.结果 Masson三色染色组织学观察显示病变组有成骨结构改变,免疫组织化学染色和Western blot法显示病变组BMP2的表达增加.机械应力加载后,细胞转染模型BMP2(rs2273073)单突变组和BMP2(rs2273073,rs235768)双突变组的BMP2表达较未施加应力组明显增加,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 BMP2单核苷酸多态性位点109T＞G(rs2273073)的突变不仅能提高人们对OPLL的易感性,同时能提高OPLL患者对机械应力的敏感度,从而加速OPLL的进展.
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骨形态发生蛋白2诱导鼠胚胎间充质干细胞成骨分化的分子机制研究
目的 探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2 的成骨分化能力.方法 培养C3H10T1/2,用20μg/ml BMP2 对其诱导一定时间后,Western blotting 检测smad 蛋白及信号通路中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38 的水平变化,QRT-PCR 检测成骨标志基因碱性磷酸酶(ALP)表达情况,茜素红染色,观察诱导晚期细胞矿化情况.结果 经BMP2 诱导后,C3H10T1/2 细胞成骨终末期分化标志矿化情况(茜素红染色)显著增加,smad 蛋白及p38 磷酸化水平有所上升,成骨标志基因ALP 表达水平有明显提高.结论 BMP2 具有诱导C3H10T1/2 细胞成骨分化能力,对BMP、Smad 通路有一定依赖性.
关键词： 骨形态发生蛋白 C3H10t1/2细胞 成骨分化 -
骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞成骨分化中长链非编码RNA的作用
背景：人类长链非编码RNA是现今的研究热点，已有研究报道其在肿瘤发生中的作用机制，但其在成骨分化方面的机制并不明确。
目的：观察人类长链非编码RNA在经骨形态发生蛋白2诱导小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用，并探讨其分子机制。
方法：首先进行碱性磷酸酶染色和成骨指标基因检测。对C3H10T1/2细胞在骨形态发生蛋白2诱导下的成骨分化过程长链非编码RNA表达变化进行芯片分析。采用高通量测序比较骨形态发生蛋白2诱导组和未经骨形态发生蛋白2诱导组的表达变化，筛选出表达下降的基因。过表达相应长链非编码RNA后观察对骨形态发生蛋白2诱导成骨分化的影响。
结果与结论：骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2细胞导致碱性磷酸酶活性增加。骨形态发生蛋白2诱导72 h后，碱性磷酸酶、Id1、骨钙素、Runx2、sp7表达上升(P<0.05)。未诱导C3H10T1/2细胞与骨形态发生蛋白2诱导细胞芯片杂交后结果比较，下降达1.5倍的长链非编码RNAs有24条，其中只有AK035085有内含子。与未过表达AK035085的对照组相比，骨形态发生蛋白2诱导72 h后AK035085过表达的C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶、Id1、骨钙素、Runx2、sp7表达均下降(P<0.05)。提示骨形态发生蛋白2可刺激C3H10T1/2细胞发生成骨分化，AK035085可能对C3H10T1/2细胞的成骨分化存在抑制作用。 -
Foxc2稳定转染对C3H10T1/2细胞成骨性能的影响
目的:探讨Foxc2基因过表达对体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞系C3H10T1/2细胞生物学行为及分化能力的影响.方法:通过慢病毒转染构建Foxc2过表达C3H1OT1/2细胞系,采用实时定量PCR和Western免疫印迹法检测转染后Foxc2蛋白的表达.应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,实时定量PCR和Western免疫印迹法检测过表达Foxc2对成骨、成脂相关基因(Runx2、OPN、OCN、PPARγ)表达的影响,分别通过碱性磷酸酶(ALP)染色和油红染色检测细胞成骨和成脂分化能力.采用SPSS 17.0软件包对数据进行t检验.结果:成功构建Foxc2稳定过表达的C3H10T1/2细胞系,发现Foxc2过表达阻滞细胞于G1期,抑制细胞增殖.在成骨诱导过程中,过表达Foxc2可以显著上调Runx2、OPN、OCN等成骨相关基因的表达.ALP染色显示,Foxc2稳定过表达细胞较对照组细胞染色深.在成脂诱导过程中,过表达Foxc2显著下调PPARγ基因的表达;油红染色显示,成脂分化进程被部分抑制.结论:Foxc2过表达抑制细胞增殖,促进细胞分化.其机制是上调Runx2、OPN、OCN成骨相关基因的表达,下调PPARγ的表达,促进C3H10T1/2细胞的成骨分化,抑制其成脂分化.
关键词： FOXC2基因 成骨分化 成脂分化 C3H10t1/2细胞 -
淡豆豉异黄酮通过影响Sox2对C3H10T1/2细胞增殖和分化的影响
目的 探讨淡豆豉异黄酮通过影响Sox2对C3H10T1/2细胞增殖和分化的影响.方法 选取间充质干细胞株C3H10T1/2为研究对象,不同浓度淡豆豉异黄酮(0、10、100、1 000 μg/L)处理C3H10T1/2细胞,并同步联合成骨诱导液诱导成骨细胞分化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTF)实验检测C3H10T1/2细胞增殖情况,采用碱性磷酸酶(ALP)活性实验鉴定C3H10T1/2细胞成骨分化情况,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法及蛋白印迹法检测C3H10T1/2细胞中Sox2 mRNA及蛋白表达情况.构建pEGFP-N1-Sox2过表达载体,利用脂质体2000向C3H10T1/2细胞转染重组质粒,分析Sox2过表达对C3H10T1/2细胞增殖和成骨分化的影响.结果 MTT检测结果可见,10、100、1 000μg/L淡豆豉异黄酮可明显抑制C3H10T1/2细胞增殖,且呈现一定时间、剂量依赖性(P＜0.05);10、100、1 000 μg/L淡豆豉异黄酮可明显促进C3H10T1/2细胞成骨分化,且呈一定剂量依赖性(P＜0.05);10、100、1 000 μg/L淡豆豉异黄酮可明显抑制C3H10T1/2细胞中Sox2 mRNA及蛋白表达,且呈一定剂量依赖性(P＜0.05);Sox2过表达可明显促进C3H10T1/2细胞增殖,抑制成骨细胞分化.结论 淡豆豉异黄酮可能是通过下调Sox2表达,发挥抑制C3H10T1/2细胞增殖,促进成骨细胞分化作用.
关键词： 淡豆豉异黄酮 C3H10t1/2细胞 成骨分化 SOX2 -
GILZ真核表达载体的构建及其表达定位
目的:克隆、构建HA标签的糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白GILZ表达载体,观察其在细胞中表达与定位,为研究GILZ在脂肪细胞分化中的作用提供工具. 方法:采用逆转录PCR(RT-PCR)法从C3H10T1/2细胞中扩增带有HA标签的GILZ cDNA编码区,并将其重组于真核表达载体pcDNA3中.经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过Lipofectamine 2000脂质体和CaCl2方法,分别转染C3H10T1/2和293T细胞,用HA抗体免疫荧光和免疫印迹法检测GILZ在细胞内的表达、分布及分子量大小. 结果:HA-GILZ表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在C3H10T1/2和293T细胞中获得了高效表达.在荧光显微镜下,GILZ主要表达于细胞质内,分子量约20 kD. 结论:成功构建HA-GILZ基因表达载体并表达于C3H10T1/2细胞质中,为GILZ的功能研究奠定了基础.
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四甲氧基二苯乙烯抑制多潜能干细胞C3H10T1/2的脂肪分化
目的：探讨不同浓度CYP1B1抑制剂TMS（2,3’,4,5’,-四甲氧基二苯乙烯）对于C3H10T1/2多潜能干细胞脂肪分化及相关基因表达的影响。方法体外培养C3H10T1/2细胞株至完全融合后，接触抑制2 d，用激素刺激混合物（IDM）（10μg/ml胰岛素，2μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-异丁基1-甲基黄磦呤）诱导分化，同时加入不同浓度TMS（0，1.0，2.0、4.0μg/ml）。观察各组细胞分化程度，脂肪分化关键转录核因子——过氧化物酶体增殖物活化受体（PPARγ）及其下游靶基因CD36、脂肪酸结合蛋白4（FABP4）的的表达状况。结果油红和TG含量测定结果显示，CYP1B1选择性抑制剂TMS可剂量依赖地抑制IDM诱导的多潜能干细胞C3H10T1/2向脂肪细胞分化；这一作用源于TMS抑制转录核因子PPARγ的转录和蛋白表达以及下游靶基因CD36与FABP4表达。结论 TMS抑制由IDM诱导的多潜能干细胞C3H10T1/2向脂肪细胞分化。
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BMP2诱导C3H10T1/2细胞成软骨分化的分子机制研究
目的:探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2向成软骨分化的可能分子机制.方法:20 μg/mL BMP2诱导C3H10T1/2细胞0,4h,1,3,6,10,13,15 d后,RT-PCR检测BMP信号通路中关键分子BMPRⅠ,BMPRⅡ,Smad1/5/8的表达,Western blot检测smad蛋白及MAPK信号通路中p38磷酸化水平变化,QRT-PCR检测成软骨标志基因aggrecan,Col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平,同时用Alcine Blue染色,观测C3H10T1/2细胞成软骨分化情况.结果:经BMP2诱导后,C3H10T1/2细胞表现出成软骨分化,smad蛋白及p38磷酸化水平有所上升,同时成软骨标志基因Col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平都有增加.与未诱导组相比,Col2a1,FGFR3,Sox9在3d的表达与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05),FGFR3,Sox9在6d的表达与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论:在一定培养条件下,BMP2具有诱导C3H10T1/2细胞成软骨分化能力.
关键词： 骨形态发生蛋白2 C3H10t1/2细胞 成软骨分化 -
miRNA对C3H10T1/2细胞成软骨分化相关基因表达的影响
目的 探讨miR-30c-5p介导的C3H10T1/2细胞成软骨分化相关基因表达的影响.方法 取C3H10T1/2细胞系并转染miR-30c-5p后,RT-qPCR验证miR-30c-5p相关的成软骨基因.结果 转染miR-30c-5p诱导第7、14、21天时,RT-qPCR检测软骨标志物acan、sox9、col2a1 mRNA的基因表达均显著高于对照组和过表达组.结论 抑制表达阳性组的miR-30c-5p促进了C3H10T1/2细胞的成软骨基因的表达.
关键词： microRNA C3H10t1/2细胞 成软骨分化 -
Hey1表达对BMP-9诱导下C3H10T1/2细胞的成骨分化及增殖影响
目的 探讨Notch信号通路重要靶点Hey1表达水平改变对BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化与增殖的影响.方法 构建过表达Hey1慢病毒LV-Hey1、抑制Hey1表达慢病毒LV-shHey1,分别感染C3H10T1/2细胞干预Hey1表达水平,以LV-Blank(空质粒)感染C3H10T1/2细胞作为对照;以荧光显微镜对慢病毒感染效果、实时荧光定量PCR以及Western blot对Hey1表达水平进行验证,筛选不同Hey1表达水平的稳定细胞系.用含BMP-9的条件培养基诱导不同Hey1表达水平的C3H10T1/2细胞(分别为BMP-9+C3H10T1/2组、BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组、BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组),以正常培养基培养的细胞作为对照(C3H10T1/2组、C3H10T1/2-Blank组).培养后48 h,实时荧光定量PCR及Western blot测定成骨分化相关转录因子Runx2、骨桥蛋白、骨钙素mRNA及蛋白表达水平;4、5、6、7d行MTT检测及4、5、10d行流式细胞仪测定细胞增殖能力;4、7d时ELISA测定细胞ALP表达水平并行染色观察.结果 成功建立不同Hey1表达水平稳定细胞系.成骨方面,各时间点与BMP-9+C3H10T1/2组比较,BMP-9诱导下Hey1过表达的BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组细胞Runx2、骨桥蛋白、骨钙素mRNA及蛋白表达水平以及成骨分化标志物ALP含量均显著增加(P＜0.05),抑制Hey1表达的BMP-9+C3H10T1/2-shHey1组细胞以上指标均显著降低(P＜0.05).对细胞增殖活力影响方面,与BMP-9+C3H10T1/2组比较,BMP-9+C3H10T1/2-Hey1组MTT检测吸光度(A)值及细胞G2+S期百分比均提高(P＜0.05);而抑制Hey1表达BMP-9+C3H10T 1/2-shHey1组以上指标均降低(P＜0.05).结论 Hey1表达是BMP-9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化重要环节,同时影响细胞早期增殖.
关键词： Hey1 BMP-9 C3H10t1/2细胞 成骨分化 细胞增殖 -
miR-93-5p靶向调控Smad5表达抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化的研究
目的 探讨miR-93-5p是否通过靶向调控其预测靶基因Smad5的表达,从而抑制小鼠MSCsC3H10T1/2细胞的成骨分化.方法 构建Smad5 3'-UTR-荧光素酶报告载体(pmiR-RB-REPORTTM),通过双荧光素酶报告基因检测,观察miR-93-5p对Smad5 3'-UTR荧光素酶活性的影响,鉴定Smad5是否为miR-93-5p的靶基因.将miR-93-5p mimics(M组)与miR-93-5p inhibitor(In组)及其对应的阴性对照组miR-93-5p mimics阴性对照(MC组)与miR-93-5p inhibitor阴性对照(InC组)分别转染至C3H10T1/2细胞中,并进行成骨诱导培养,48 h后分别采用实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)及Westemblot检测各组细胞Smad5在mRNA及蛋白水平的相对表达量;14d后通过茜素红染色检测各组细胞外钙盐的沉积情况,了解miR-93-5p对C3H10T1/2细胞成骨分化的调控效应.结果 双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-93-5p能与Smad5 mRNA3'-UTR特异性结合,抑制其荧光素酶活性(p＜0.05).qRT-PCR检测示,M组及In组Smad5的mRNA相对表达量与对应阴性对照组MC组及InC组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);Western blot检测示,M组及In组Smad5蛋白相对表达量与对应阴性对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),其中M组较MC组表达量下调,而In组则较InC组表达量上调.茜素红染色示,M组钙盐沉积较MC组明显减少,而In组则较InC组钙盐沉积明显增多.结论 Smad5是miR-93-5p的靶基因,miR-93-5p可通过靶向调控Smad5的表达,抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化.
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小鼠干细胞成骨和成软骨分化特异性微小RNA的初步研究
目的 通过对C3H10T1/2细胞进行成骨及成软骨分化,利用微小RNA (microRNA,miRNA)芯片技术筛选成骨分化和成软骨分化中差异miRNA,以期寻找调节C3H10T1/2细胞成骨及成软骨分化的特异性miRNA. 方法 取C3H10T1/2细胞系,分别行成骨和成软骨诱导分化,对诱导组和对照组进行鉴定.然后通过miRNA芯片技术筛选分化前后2倍变化幅度且平均标准化信号值＞2的差异miRNA,并行实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)验证. 结果 诱导7d成骨诱导组较对照组有明显ALP表达(P＜0.05);诱导7、14、21d,RT-qPCR检测成骨诱导组成骨标志物Runx2、丝氨酸蛋白酶7(serine protease 7,Sp7)、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN) mRNA相对表达量均显著高于诱导0d时(P＜ 0.05);诱导21d,Western blot检测成骨诱导组Runx2、Sp7、Ⅰ型胶原、OPN蛋白表达量明显高于对照组(P＜0.05).成软骨诱导5、10、15d,RT-qPCR检测成软骨诱导组软骨标志物SOX9、Ⅱ型胶原、蛋白多糖(Aggrecan)、透明质酸合成酶(Has2) mRNA相对表达量均显著高于诱导0d时(P＜0.05);诱导15d,Western blot检测成软骨诱导组SOX9、Ⅱ型胶原、Aggrecan、Has2蛋白表达量明显高于对照组(P＜0.05).通过miRNA芯片技术分别筛选出10个成骨和3个成软骨2倍变化幅度且平均标准化信号值＞2的差异miRNA.除miR-455-3p之外,其余差异miRNA验证结果与芯片结果比较有较好一致性. 结论 通过miRNA芯片技术对C3H10T1/2细胞系以及其诱导成骨和成软骨分化细胞进行检测对比,发现部分miRNA表达量在诱导后细胞中发生变化,为进一步挑选成骨和成软骨特异性miRNA进行功能验证和靶基因预测奠定了基础.
关键词： C3H10t1/2细胞 成骨分化 成软骨分化 微小RNA -
β联蛋白参与骨形成蛋白9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化
目的 探讨骨形成蛋白9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化过程β联蛋白(β-catenin)的作用.方法 利用重组腺病毒BMP9(Ad-BMP9)诱导C3H10T1/2细胞分化,通过Western blot法检测Ad-BMP9及不同剂量XAV-939处理后β-catenin的激活情况;在完全抑制β-catenin的情况下,Ad-BMF9诱导l周,通过实时定量PCR法检测心肌细胞增强因子2C(MEF2C)、心肌组织特异性转录因子GATA结合蛋白4(GATA4);Ad-BMP9处理3周后,通过Western blot法及免疫荧光技术检测心肌连接子蛋白43(Cx43)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达.结果 在感染效率约50％的情况下,BMP9可过度激活β-catenin,使其磷酸化水平增高;在XAV-939抑制β-catenin后,Ad-BMP9诱导的C3H10T1/2细胞表达的cTnT、GATA4、Cx43和MEF2C均受到抑制.结论 β-catenin能被BMP9激活并参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化.
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Wnt3a联合BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化
目的 探讨Wnt3a单独以及联合骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化的作用.方法 利用HEK293细胞扩增重组腺病毒AdGFP、AdBMP9、AdWnt3a;分别转染C3H10T1/2细胞3周后,倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态及绿色荧光蛋白表达;流式细胞术检测细胞转染效率;Western blot法、免疫荧光技术及实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测缝隙连接蛋白43(Cx43)、肌钙蛋白T(cTnT)、GATA结合蛋白4(GATA4)、心肌细胞增强因子2C(MEF2C)的表达.结果 经HEK293细胞扩增可得到高滴度的重组腺病毒;转染C3H10T1/2细胞3周后,Wnt3a组Cx43、cTnT、GATA4、MEF2C的表达量与空白组比较无明显差异;Wnt3a联合BMP9组的Cx43、cTnT、GATA4、MEF2C基因的表达量显著高于空白组、GFP组和Wnt3a组,与单独BMP9组相比无显著性差异.结论 Wnt3a不能单独诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化;Wnt3a联合BMP9可诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞样细胞分化.
关键词： 骨形态发生蛋白9 Wnt3a C3H10t1/2细胞 心肌细胞样细胞
